본 프로토콜에서, 장내 미생물-항원 특이적 T 세포 입양 상반염 모델이 기재된다. CD4+ T 세포는 CBir1 TCR 형질전환 마우스로부터 분리된다. 이들은 면역 지배적인 창자 microbiota 항원 CBir1 flagellin를 위해 특정합니다, 수신자 Rag1/-- 마우스로 전송되는, 장 염증으로 이끌어 내는.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
부각의 증가와 함께, 염증성 장 질환 (IBD), 위 장관에 영향을 미치는 만성 질환은 개인과 사회에 상당한 건강 및 재정적 부담을 부과. 따라서 IBD의 발병 기제 및 개발의 근간을 조사하는 것이 중요합니다. 여기서, 장내 미생물-항원 특이적 T 세포 전달 대장염 모델이 기재되어 있다. CBir1 flagellin 실험 대장염및 크론병 환자에서 면역 지배적 인 장 세균 항원으로 인식되었습니다. CBir1 TCR 형질 전환기 naϊve CD4+ T 세포, CBir1 플래그렐린에 특정, 면역 결핍 Rag1/-- 마우스로 입양 전송 후 만성 대장염을 유도할 수 있다. 질병 엄격은 조직 병리학에 의해 평가됩니다. 대장 라미나 프로프리아의 CD4+ T 세포 표현형도 결정된다. 이 모델은 IBD의 발병을 유도하는 메커니즘을 조사하고 IBD 를 치료하기위한 잠재적 인 약물을 테스트하기위한 이상적인 뮤린 모델을 제공하는 IBD의 개발과 유사합니다.
서론
크론병(CD) 및 궤양성 대장염(UC)을 중심으로 염증성 장질환(IBD)은 위장관의 만성 재발 염증을 특징으로 하며 전 세계 수백만 명에게 영향을 미치고 있습니다1. 유전 감수성, 창자 미생물, 면역 반응, 규정식 및 생활양식2를 포함하여 IBD의 발달 그리고 병신에 몇몇 요인이 연루되었습니다. 그러나 IBD의 정확한 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않습니다.
특정 관심사 중 하나는 장 내 염증 조절에 있어 장 내 미생물군유상과 호스트 면역 반응 사이의 상호 작용입니다3. 장내 미생물은 면역 반응을 활성화할 수 있는 일련의 면역 자극 분자 및 항원을 제공합니다4. 이펙터 T 세포와 조절 T 세포 사이의 균형 (Tregs) 장 항상성을 유지에 중요 한 동안, 창 자 microbiota 항 원에 과도 한 장 점막 CD4+ T 세포 응답 장 염증에 기여 5,6,7. 면역 지배적 인 창 자 mic....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
모든 동물 절차는 동물의 사용 및 관리에 대한 텍사스 대학 의료 지부의위원회에 따라 수행되었다. CBir1 TCR Tg 마우스는 버밍엄에 있는 알라바마 대학의 찰스 엘슨 박사에 의해 제공되었습니다. CBir1 TCR Tg 마우스는 여성 또는 남성일 수 있지만 8-12 주에 있어야 합니다. C57BL/6 배경에 있는 Rag1/-- 마우스는 잭슨 연구소10으로부터 수득되었다. Rag1/- 마우스는 성별과 연령일치여야 하며, 남성 또는 암컷은 사용할 수 있지만 8-12주에 있어야 합니다. 전체 프로토콜은 그림 1로 요약됩니다.
1. 받는 쥐의 준비
- 동일한 특정 병원균없는 동물 시설에서 자란 C57BL/6 배경에서 Rag1/-- 마우스를 준비하십시오. 전력 분석에 의해 그룹당 마우스 수를 계산11.
참고 : Rag1/- 마우스는 성숙한 T 세포및 B 세포10이 없습니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
약 5 x 106 CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T 세포는 성인 CBir1 TCR Tg 마우스로부터 분리되었다. CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T 세포의 전송은 수신자 Rag1/-- 마우스에서 만성 대장염을 유도. 세포 전달 후, 임상 징후는 체중 감소, 대변 일관성 및 구부러진 자세를 포함하여 장 염증의 진행을 평가하기 위해 모니터링되었습니다. 예상대로, 마우스는 세포 전달 후 약 3 주 동안 무게를 잃기 시작했고, 체중은 원래 체중 6 주 후 세포 전달의 약 80 %-85 %에 도달했습니다 (그림 3). 추가적으로, 마우스는 약 3-4 주 세포 전송 을 보여주고 가혹한 대장염을 개발할 때 구부러진 자세를 보여주었습니다. 결장의 총 형태가 표시되었고, 대장염 심각도는 마우스가 희생되었을 때 조직병리학 점수에 의해 평가되었다. CBir1 TCR Tg naϊv.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
모든 단계는이 대장염 모델의 재현성에 필수적이지만 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 수령인 Rag/- 마우스는 장 염증을 유도하기 위하여 CD4+ T 세포에 적당한 실행 가능한 naϊve 수신해야 합니다. 우리는 MLN 대신 순진한 CD4 + T 세포의 격리를 위해 비장을 사용했습니다. MLN에서 순진한 CD4 + T 세포의 수율은 비장보다 훨씬 낮기 때문입니다. CD62L은 순진한 T 세포에서 높게 발현되고, CD44 및 CD25는 T cells13,14의 활성화 마커이다. 이 연구에서는 CD4+ T 세포를 비장으로부터 격리하기 위해 먼저 안티 CD4 자기 구슬을 사용했습니다. 그런 다음 우리는 순진한 CD4+ T 세포의 절연을 위해 안티 CD4, 안티 CD62L 및 안티 CD25 항체의 조.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
어떤 저자도 재정적, 직업적 또는 개인적인 이해관계가 상충하는 저자가 없습니다.
감사의 글
이 작품은 국립 보건원 보조금 DK125011, AI150210, DK124132, 텍사스 시스템 STARs 상 (Y.C.), 그리고 갤버스턴 (W.Y.)의 텍사스 대학 의료 지부에서 제임스 W. 맥러플린 펠로우십 기금에 의해 부분적으로 지원되었다. 그림 1은 BioRender.com 함께 만들어졌습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.22 & 마이크로; m 진공 구동 일회용 병 상단 필터 | MilliporeSigma | SCGPS05RE | |
| 100x 페니실린-스트렙토마이신 | 코닝 | 30-002-CI | |
| 100-&마이크로; m 스트레이너 | BD Biosciences | 352360 | |
| 3-mL 전송 피펫 | Fisherbrand | 13-711-9CM | |
| 안티 마우스 CD16/32 | Biolegend | 101302 | |
| 안티 마우스 CD25-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 102030 | |
| 안티 마우스 CD3-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 100327 | |
| 안티 마우스 CD4 APC | Biolegend | ||
| 안티 마우스 CD4 자성 입자 | BD Biosciences | 551539 | |
| 안티 마우스 CD4-BV421 | Biolegend | 100544 | |
| 안티 마우스 CD62L-PE | Biolegend | 104408 | |
| 안티 마우스 Foxp3-PE | ThermoFisher | 12-5773-82 | |
| 안티 마우스 IFNγ-FITC | Biolegend | 505806 | |
| 안티 마우스 IL-17A-PE/Cy7 | Biolegend | 506922 | |
| 자동 세포 계수기 | Bio-rad | TC20 | |
| Brefeldin A | BD Biosciences | 555029 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| C 튜브 | Miltenyi | 130-093-237 | |
| 세포 분리 자석 | BD Biosciences | 552311 | |
| 콜라겐 분해 효소 IV | 시그마 - 알드리치 | C5138 | |
| DAPI | 시그마 - 알드리치 | D9542 | |
| 해리 기 기계 | Miltenyi | 130-096-427 | |
| DNase I | 시그마 - 알드리치 | ||
| EDTA | 코닝 | 46-034-CI | |
| EDTA (0.5 M, PH 8.0) | 코닝 | 46-034-CI | |
| FBS | R& D Systems | S11550 | |
| 유세포 분석기 | BD Biosciences | LSD Fortessa | |
| Heat Lamp | CoverShield | BR40 | |
| Hematoxylin 및 Eosin(H& E) 염색 키트 | Abcam | ab245880 | |
| 인슐린 주사기, | BD Biosciences, | 329412 | |
| Ionomycin | ThermoFisher | I24222 | |
| Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell 염색 키트 | , ThermoFisher | L10119 | |
| MaxQ 6000, Incubated/Refrigerated Stackable Shakers | ThermoFisher | SHKE6000 | |
| NH4Cl | Thermo Scientific | A687-500 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Phorbol-12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI 1640 Medium | Cytiva HyClone | SH3002702 | |
| Sorter | BD Biosciences | Arial Fusion | |
| Tissue 자동 프로세서 | ThermoFisher | STP120 | |
| 조직 임베딩/프로세싱 카세트 | Fisher Healthcare | 22048142 | |
| Tris Base | Thermo Scientific | BP154-1 | |
| True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer) | Biolegend | 424401 |
참고문헌
- Kaplan, G. G. The global burden of IBD: From 2015 to 2025. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (12), 720-727 (2015).
- Ananthakrishnan, A. N. Epidemiology and risk factors for IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
