이것은 상업적으로 이용 가능한 회전 세포 배양 시스템을 사용하여 특수 일회용 배양 용기를 사용하여 시뮬레이션된 미세 중력에서 림프구를 배양하기 위한 단계별 가이드입니다. 이러한 배양 방법은 모든 현탁형 세포 배양액에 적용될 수 있다.
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이 논문에서
요약
초록
우주에서 생물학적 연구를 수행하는 현재의 한계를 감안할 때, 세포 배양을 지구의 모의 미세 중력 (SMG)에 적용하기위한 몇 가지 옵션이 있습니다. 이러한 옵션은 방법, 원리 및 현탁 세포 배양에 사용하기에 적합한지 여부에 따라 다릅니다. 여기서, 세포 배양 방법은 2D 클리노스타트 또는 회전 벽 용기(RWV) 장치라고도 하는 상업적으로 이용 가능한 회전 세포 배양 시스템을 사용하여 림프구를 시뮬레이션된 미세 중력에 노출시키는 방법을 설명합니다. 이 세포 배양 방법은 시간 평균 중력 벡터 무효화 원리를 활용하여 수평 축에서 세포를 회전시켜 미세 중력을 시뮬레이션합니다. 이 시스템에서 배양된 세포는 세포 기능 및 생리학에 대한 시뮬레이션된 미세중력의 영향을 평가하기 위해 다양한 실험 분석에서 수확 및 활용될 수 있습니다. 배양 기술은 사용되는 세포 유형 또는 계통에 따라 약간 다를 수 있지만 여기에 설명된 방법은 모든 현탁액 유형 세포 배양에 적용될 수 있습니다.
서론
우주 비행은 면역 체계를 포함한 인간 생리학의 여러 측면에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 많은 연구에서 생체 내 우주 비행 및 시험관 내 모의 미세 중력 (SMG)에 대한 노출로 인한 면역 조절 장애의 증거를 입증했습니다 1,2,3,4. 인간 생리학에 영향을 미치는 우주 환경의 주요 측면 중 하나는 미세 중력입니다. 미세중력은 우주 환경5에서 낮은 중력으로 인해 경험하는 "무중력"을 의미한다. 인류가 달과 화성에 대한 더 긴 우주 임무를 준비함에 따라 우주 비행사의 심각한 건강 위험을 완화하기 위해 더 많은 연구가 수행되어야 합니다.
과학 연구를위한 실제 미세 중력 조건은 국제 우주 정거장 (ISS)의 우주 또는 궤도에 진입 한 나노 위성에서 달성 할 수 있습니다. 그러나 이러한 옵션은 오케스트레이션하는 데 비용이 많이 들고 복잡할 수 있습니다. 우주에서 생물학적 연구를 수행하는 현재의 한계를 감안할 때 지구에서 실제....
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프로토콜
알림: 다음 단계는 멸균된 생물학적 안전 캐비닛 내부에서 완료해야 합니다.
1. 세포 배양용 용기의 제조
- 플라스틱 포장에서 배양 용기를 꺼냅니다. 사용 중인 세포 유형/라인, 대조군(1G) 또는 처리(SMG) 여부 및 기타 관련 정보에 따라 테두리의 각 용기에 라벨을 붙입니다.
- 용기를 안정화하고 충전 포트 캡 페그/O-링을 건드리지 않고 충전 포트를 조심스럽게 엽니다. 용기가 채워지는 동안 페그/O-링이 위를 향하도록 캡을 에탄올 패드에 놓습니다. 주사기 포트에서 캡을 제거하지 마십시오.
알림: 페그/O-링을 실수로 만진 경우 캡 페그에 70% 에탄올을 뿌리고 용기를 채우는 동안 잠시 동안 그대로 두십시오(위쪽을 향함). 주입 포트를 다시 닫을 준비가 되면 새 종이 천으로 캡을 들어 캡을 완전히 건조시킨 후 용기에 다시 놓습니다. - 멸균 혈청학적 피펫을 사용하여 세포 배양에 적합한 전체 배지 10mL를 용기에 넣고 캡을 충전 포트에 다시 조심스럽게 놓습니다.
참고: 여기서는 NK92 세포를 세포 치료제로 사용한 임상 시험에서 이전에 검증된 바와 같이 GM1 배지에서 배양한 NK92 NK 세포주를 사용했습니다14
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결과
이 배양 방법은 1) 세포의 증식이 대조군(이상적으로는 모든 실험군)에 걸쳐 거의 일관되고, 2) 파종 밀도, 처리 기간 및 세포 유형/계통의 배가 시간을 고려할 때 증식이 적절하고, 3) 수확된 세포의 생존율이 85% 이상인 경우 성공적인 것으로 간주됩니다(표 1 ). 이상적으로, 생성된 세포는 특히 후속 실험 및 분석에 사용하기 위해 표준 세포 배양에서와 같이 건강해야 합니다(즉, 생존율 85% 이상). 이 배양 방법은 그 반대의 경우 실패한 것으로 간주되며, 이에 따라 생성된 세포는 죽거나, 대조군에 걸쳐 증식이 크게 다르거나, 약 70% 이하의 최적이 아닌 생존율을 갖습니다(표 1). SMG 처리군에서의 증식은 SMG 처리가 세포 생리학에 미치는 영향에 따라 대조군과 비교하여 다를 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 그러나 이것은 현재까지 문제가 되지 않았으며 세포 증식은 대조군과 처리군에서 거의 동일했습니다(표 1). 앞서 언급했.......
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토론
인류가 달과 화성에 대한 더 긴 우주 임무를 준비함에 따라 우주 비행사의 심각한 건강 위험을 완화하기 위해 더 많은 연구가 수행되어야 합니다. 인간 생리학에 영향을 미치는 우주 환경의 주요 측면 중 하나는 미세 중력입니다. 여기서, 시판되는 회전세포 배양 시스템을 이용하여 림프구를 SMG에 투여하는 세포 배양 방법을 설명하였다.
이 프로토콜에는 사용되는 세포 유형 또는 계통에 따라 최적화해야 할 수 있는 몇 가지 중요한 단계가 포함되어 있습니다. 여기에는 1) 세포의 배가 시간과 SMG 처리 기간에 따라 적절한 파종 밀도 선택, 2) 최적의 처리 길이, 회전 속도 및 적절한 제어 결정이 포함됩니다. 연구 중인 세포 유형 또는 계통에 적합한 세포 농도의 중간 범위에 있는 파종 밀도를 선택하는 것으로 충분해야 합니다. 그러나 너무 낮은 파종 밀도를 선택하면 세포 증식 및 생존율이 낮아질 수 있으며(표 1), 너무 높은 밀도를 선택하면 영양소가 조기에 고.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 캐나다 우주국 (CSA), 연구 보조금 (17ILSRA3, Immuno Profile)의 지원을 받는다. 저자는 이 프로토콜의 초기 문제 해결에 도움을 준 Dr. Roxanne Fournier(토론토 대학교), Randal Gregg 박사(링컨 메모리얼 대학교) 및 Preteesh Mylabathula(애리조나 대학교)에게 감사를 표합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 일회용 고종횡비 용기(HARV) (10mL) | Synthecon | D-410 | 감마 멸균 배양 용기(4/상자) |
| Luer-Lok 팁 주사기(3mL) | BD | 309657 | 10mL HARV에 부착하기 위한 |
| NK92 세포주 | ATCC | CRL-2407 | |
| 회전식 세포 배양 시스템(RCCS) | Synthecon | RCCS-4D | 회전식 벽 용기 장치; 2D 클리노스타트 |
| Sarsedt 15 mL 코니컬 튜브 | Fisher Scientific | 50-809-220 | |
| Sarsedt 50 mL 코니컬 튜브 | Fisher Scientific | 50-809-218 | |
| Sarsedt 멸균 혈청학 피펫 | Fisher Scientific | 86.1254.001 | |
| T25 현탁액 배양 플라스크 | Sarsedt | 83.3910.502 | 플라스크 제어용 |
참고문헌
- ElGindi, M., et al. May the force be with you (or not): the immune system under microgravity. Cells. 10 (8), 1941(2021).
- Choukèr, A., Ullrich, O. The Immune System in Space: Are we Prepared. , Springer International Publishing. Cham. (2016).
- Crucian, B. E., et al.
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재인쇄 및 허가
