이 프로토콜은 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로부터 순수한 지방세포 집단의 생성을 허용합니다. 레티노산은 iPSC를 지방세포 생성에 사용되는 중간엽 줄기세포(MSC)로 분화시키는 데 사용됩니다. 그런 다음 나일 레드 염색을 기반으로 한 분류 접근법을 사용하여 순수한 지방 세포를 얻습니다.
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이 논문에서
요약
초록
유도만능줄기세포(iPSC) 기술의 최근 발전으로 지방세포를 비롯한 다양한 세포 유형의 생성이 가능해졌습니다. 그러나, 현재의 분화 방법은 효율이 낮고, 지방세포의 균질한 집단을 생성하지 않는다. 여기에서 우리는 높은 수율로 중간엽 줄기 세포(MSC)를 생산하기 위해 all-trans retinoic 기반 방법을 사용하여 이 문제를 우회합니다. 세포 증식, 생존 및 부착을 제어하는 경로를 조절함으로써 당사의 분화 전략은 다능성 중간엽의 순수한 집단으로 분화하는 배아체(EB)의 효율적인 생성을 가능하게 합니다. 이 방법에 의해 생성된 많은 수의 중간엽 줄기세포는 지방세포를 생성하기 위한 이상적인 공급원을 제공합니다. 그러나 지방 세포 분화로 인한 샘플 이질성은 여전히 과제로 남아 있습니다. 따라서 우리는 FACS를 사용하여 지질 함유 성숙 지방 세포를 정제하기 위해 Nile red 기반 방법을 사용했습니다. 이 분류 전략을 통해 샘플 이질성이 감소하고 세포 기능이 향상된 지방 세포 풀을 사용하여 지방 세포 관련 대사 장애를 모델링하는 신뢰할 수 있는 방법을 확립할 수 있었습니다.
서론
중간엽 줄기 세포(MSC)는 지방 세포, 골 세포 및 연골 세포와 같은 중배엽 기원 세포를 생산하기 위한 효과적인 일시적 자원 역할을 하며, 이는 각각의 유전 질환을 모델링하는 데 추가로 사용될 수 있습니다. 그러나, 이전의 접근법은 성인 조직으로부터 이러한 중간엽 줄기세포를 얻는 것에 의존했다1, 이는 기증자로부터 많은 수의 중간엽 줄기세포를 얻는 데 어려움을 겪었고, 차선의 체외 배양 조건1,2에서 기능적으로 생존할 수 있도록 유지하는 데 한계가 있었다. 이러한 장애물은 시험관 내에서 MSC를 생성하기 위한 프로토콜을 갖는 것에 대한 큰 수요를 낳았습니다. 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)는 MSC 특성 3,4,5를 나타내는 MSC의 귀중한 공급원으로 사용될 수 있습니다. iPSC 유래 중간엽 줄기세포는 여러 질병에서 치료 옵션으로 사용할 수 있습니다. 또한 iPSC 유래 중간엽 줄기세포가 지방세포를 생성하는 능력은 인간 지방생성, 비만 및 ....
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프로토콜
이 연구는 적절한 기관 연구 윤리위원회의 승인을 받았으며 1964 년 헬싱키 선언 및 이후 개정 또는 유사한 윤리 기준에 명시된 윤리 기준에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜은 HMC(No. 16260/16) 및 QBRI(No. 2016-003)의 IRB(Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다. 이 작업은 H1 및 H9와 같은 hESC에도 최적화되어 있습니다. 충분한 정보에 입각한 동의를 받은 건강한 개인으로부터 혈액 샘플을 채취했습니다. iPSC는 건강한 개인의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 생성됩니다.
1. iPSC 배양 및 유지
- 코팅 매트릭스를 knockout-DMEM에서 1:80의 비율로 재구성하여 기저막 매트릭스 코팅 플레이트를 준비하고 4°C에서 보관합니다.
- 500mL의 줄기세포 기저 배지에 50mL의 10배 줄기세포 보충 배지와 5mL의 100x 페니실린-스트렙토마이신(P/S)을 추가하여 iPSC 배양액을 준비하고 단기간의 경우 4°C에서, 장기간 사용의 경우 -20°C에서 보관합니다.
- 플레이트를 코팅 매트릭스-1 mL 6-웰 플레이트에 대해, 500 μL에 12-웰 플레이트에, 250 μL에 24-웰 플레이트-....
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결과
중간엽 분화 중 세포의 도식 및 형태: iPSC를 중간엽 줄기세포로 분화하려면 EB 형성, 중간엽 분화 및 MSC 확장에 걸친 다양한 발달 단계가 포함됩니다(그림 1). 이러한 발달 단계에서 세포는 다양한 자극 화학 물질로 인해 다양한 형태를 얻습니다. 분화가 시작되면 세포는 현탁액에 도말되며 직경이 작거나 중간 크기인 동안 정의된 세포 경계와 함께 둥글게 될 것으로 예상됩니다(그림 2). 분화 초기 단계에서 현탁액으로 세포를 배양하는 것을 선택하면 자연 배아 발달 과정과 매우 유사하므로 이 단계는 성공적인 분화에 매우 중요합니다. EB 형성 및 RA 처리 단계는 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 EB를 도금하는 단계가 뒤따릅니다. 도금 시 EB의 생존 가능성은 더 많은 중간엽을 생성하는 빠른 확산 거동을 관찰함으로써 접근할 수 있습니다(그림 2). 중간엽 줄기세포가 나타.......
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토론
이 프로토콜은 MSC에 높은 수율과 효율성을 제공할 수 있는 능력으로 인해 가장 중요합니다. 중간엽 줄기세포의 이러한 대량 생산은 10μM의 RA14,15를 사용한 iPSC 유래 EB의 일시적인 배양에 의해 가능했습니다. 10μM의 RA를 사용한 일시적인 처리는 MSC 수율을 11.2배에서 1542배까지14,15배 향상시켰으며, 이 프로토콜은 iPSC와 hPSC 모두에 적용할 수 있습니다. 이 용량과 치료 기간에서 RA는 iPSC의 생존 및 증식에 중요한 세포 증식, 세포자멸사, 세포-세포 및 ECM-세포 부착에 관여하는 여러 유전자의 발현을 직간접적으로 조절함으로써 EB 형성 세포의 증식 및 생존 능력을 향상시킨다14,16
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공개 사항
저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 카타르 국립 연구 기금 (QNRF) (보조금 번호 NPRP10-1221-160041)의 보조금으로 자금을 지원받았습니다. 마리암 아가디는 카타르 국립 연구 기금(QNRF)의 GSRA 장학금을 지원받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Adiponectin | Abcam | ab22554 | 지방 세포 성숙 마커 |
| anti-CD105 | BD Pharmingen | 560839 | MSC 분화 마커 |
| anti-CD14 | BD Pharmingen 561712 | MSC 분화 마커 | |
| anti-CD19 | BD Pharmingen | 555415 | MSC 분화 마커 |
| anti-CD34 | BD Pharmingen | 555824 | MSC 분화 마커 |
| anti-CD44 | abcam | ab93758 | MSC 분화 마커 |
| anti-CD45 | BD Pharmingen | 560975 | MSC 분화 마커 |
| anti-CD73 | BD Pharmingen | 550256 | MSC 분화 마커 |
| anti-CD90 | BD Pharmingen | 555596 | MSC 분화 마커 |
| bFGF | R& D | 233-FP | MSC 배양 배지 보충제 |
| C/EBPA | Abcam | ab40761 | 지방 세포 성숙 마커 |
| 덱사메타손 | 토릭스 | 1126 | 지방 세포 분화 배지 보충제 |
| FABP4 | Abcam | ab93945 | 지방 세포 성숙 마커 |
| 태아 소 혈청 | ThermoFisher | 10082147 | MSC 배양 배지 보충제 |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050-061 | MSC 배양 배지 보충제 |
| IBMX | Sigma Aldrich | I5879 | 지방 세포 분화 배지 보충제 |
| Indomethacin | Sigma Aldrich | I7378 | 지방 세포 분화 배지 보충제 |
| 인슐린 | 시그마 Aldrich | 91077C | 지방 세포 분화 배지 보충제 |
| Knockout DMEM | ThermoFisher | 12660012 | 마트리겔 |
| 저포도당 DMEM | ThermoFisher | 11885084 | MSC 배양 배지 |
| Matrigel | Corning | 354230 | 코팅 매트릭스 |
| MEM-alpha | ThermoFisher | 12561056 | 지방세포 분화 배지 |
| Nilered | Sigma Aldrich | 19123 | 지방세포용 분류 마커 |
| 페니실린 | ThermoFisher | 15140122 | MSC/지방세포 매체 보충제 |
| 인산염 완충 식염수 | ThermoFisher | 14190144 | 세척 완충제 |
| Pierce™ 20X TBS 완충액 | Thermo Fisher | 28358 | 세척 완충액 |
| PPARG | 세포 신호 기술 | 2443 | 지방세포 성숙 마커 |
| ReLeSR | 줄기세포 기술 | 5872 | 해리 시약 |
| 레티노산 | 시그마 알드리치 | R2625 | MSC 분화 매체 보충제 |
| 암석 억제제 | 토크리스 | 1254/10 | hPSC 배양 배지 보충제 |
| 로지글리타존 | 시그마 알드리치 | R2408 | 지방 세포 분화 배지 보충제 |
| StemFlex | ThermoFisher | A334901 | hPSC 배양 배지 |
| Triton | Thermo Fisher | 28314 | 투과화 시약 |
| Trypsin | ThermoFisher | 25200072 | 해리 시약 |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7942 | 세척 버퍼 |
참고문헌
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling: CCS. 9, 12(2011).
- Wagner, W., et al.
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재인쇄 및 허가
