이 프로토콜에서는 생리학적으로 관련된 미세혈관 환경을 재현하고 전체 백혈구 부착/이동 캐스케이드를 재현할 수 있는 생체모방 미세유체 분석법이 염증성 질환에서 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하는 데 사용됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
백혈구-내피 세포 상호작용은 패혈증과 같은 염증성 질환에서 중요한 역할을 한다. 염증 동안, 활성화된 백혈구가 혈관 내피를 가로질러 주요 기관으로 과도하게 이동하면 장기 부전이 발생할 수 있습니다. 생리학적으로 관련된 생체모방 미세유체 분석법(bMFA)은 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하기 위해 전체 백혈구 롤링/부착/이동 캐스케이드를 재현할 수 있는 몇 가지 실험 및 계산 기술을 사용하여 개발 및 검증되었습니다. 설치류 의 생체내 이미지로부터 얻은 미세혈관 네트워크는 지리 정보 시스템(GIS) 접근법을 사용하여 디지털화되고 현미경 슬라이드 상에서 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 미세제작되었다. 전단 속도와 혈관 토폴로지가 백혈구-내피 세포 상호작용에 미치는 영향을 연구하기 위해, 전산 유체 역학(CFD) 모델이 개발되어 네트워크 전반에 걸친 전단 속도 및 속도의 상응하는 지도를 생성하였다. bMFA는 롤링 속도, 상이한 전단 속도에 반응하는 부착된 백혈구의 수, 이동된 백혈구의 수, 내피 세포 투과성, 부착 분자 발현 및 기타 중요한 변수를 포함하는 백혈구-내피 세포 상호작용의 정량화를 가능하게 한다. 더욱이, 인간 내피 세포 및 백혈구와 같은 인간 관련 샘플을 사용함으로써, bMFA는 그들의 임상 번역성을 증가시키기 위해 잠재적인 치료제의 신속한 스크리닝을 위한 도구를 제공한다.
서론
염증은 감염 및 손상에 대한 숙주 반응이고, 내피는 염증 반응 1,2,3에서 중요한 역할을 한다. 염증성 조절 장애는 패혈증, 심혈관 질환, 천식, 염증성 장 질환, 암 및 COVID-19와 같은 다수의 질병 병리의 근본 원인이다. 백혈구-내피 세포 상호작용은 이러한 염증성 질환에서 중심적인 역할을 한다. 염증 동안, 손상된 조직으로부터 병원균 또는 DAMPS (손상 관련 분자 패턴)로부터의 PAMPS (병원체 관련 분자 패턴)의 방출은 면역 세포를 활성화시켜 내피의 활성화로 이어지는 사이토카인 / 케모카인 및 기타 전염증성 매개체를 방출하여 혈관 내피 장벽 기능의 변화와 투과성 증가를 초래합니다 3,4 . 염증 동안 내피 세포의 활성화가 증가하면 백혈구와 내피 세포 상호 작용이 향상되어 혈관 내피를 가로 질러 활성화 된 백혈구가 주요 기관 1,5,6,7
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프로토콜
Heparinized 인간의 혈액은 템플 대학 (필라델피아, PA, 미국)의 기관 검토위원회 (Institutional Review Board of Temple University, PA, USA)의 승인에 따라 정보에 입각 한 동의에 따라 건강한 성인 기증자 (남성과 여성, 21 세에서 60 세 사이)로부터의 호중구 분리를 위해 얻어집니다.
1. 인간 피브로넥틴으로 장치를 프라이밍하고 코팅합니다.
참고: bMFA에는 두 개의 입구 포트와 두 개의 출구 포트가 혈관 구획에 연결되어 있습니다. 또한 조직 구획에 연결된 하나의 포트가 있습니다(그림 2).
- 튜브(0.06"의 O.D. 및 0.02"의 I.D.)(재료 표s)를 미세점 포셉이 있는 하나의 입구 포트를 제외한 모든 포트에 삽입합니다. 턱 클램프로 두 개의 출구 포트와 조직 구획 포트를 클램프로 고정하십시오. 각 튜브의 길이가 ~ 1 인치인지 확인하십시오.
- 피브로넥틴 원액(1mg/mL)에서 PBS로 인간 피브로넥틴을 100μg/mL로 희석한다. 준비된 피브로넥틴 용액으로 1 mL 주사기를 로딩....
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결과
bMFA에서 전단 유동 하에서 48시간 배양한 후, 내피 세포는 bMFA에서 혈관 채널의 표면을 덮고 유동 방향으로 정렬하였다(도 6). 공초점 현미경 검사는 혈관 채널의 모든 표면이 내피 세포에 의해 덮여 bMFA18에서 완전한 3D 루멘을 형성한다는 것을 나타냈다.
이 프로토콜을 사용하여, 호중구 부착 지도가 획득될 수 있고, bMFA에서 내피 세포에 대한 호중구의 유의한 부착이 있음을 보여준다(도 8). 이 접착 지도에서 호중구의 공간적 분포를 CFD 모델로부터 생성된 전단 속도 맵과 상관시키는 것은 호중구 부착이 전단 의존적이며, 호중구가 낮은 전단 속도 및 분기 영역에서 우선적으로 부착된다는 것을 보여준다(도 9A). TNF-α-활성화된 내피 세포에 대한 호중구의 부착이.......
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토론
bMFA는 생체내 미세혈관 네트워크의 지형 및 유동 조건을 재생하고, 생리학적으로 현실적인 조건 하에서 시험관내에서 백혈구-내피 세포 상호작용 및 내피 기능을 연구하는데 사용될 수 있다. 마우스 또는 인간의 미세 혈관 구조에서 미세 혈관 네트워크의 기하학은 자기 유사하고 프랙탈이며, 레이놀즈 번호<< 1로 혈관 기하학이 흐름 패턴에 큰 영향을 미치지 않는다는 것을 나타냅니다. 따라서, bFMA는 인간을 포함한 다른 종에 대한 백혈구-내피 상호작용을 연구하는데 사용될 수 있지만, 마우스 크레마스터 근육의 미세혈관구조는 bMFA를 제조하기 위해 맵핑되었다.
bMFA는 롤링, 확고한 접착, 조직 구획으로의 호중구의 확산 및 이동을 포함하는 단일 분석에서 호중구 이동 캐스케이드의 개별 단계에 대한 실시간 평가를 허용합니다. 일차 인간 세포 및 임상적으로 관련된 샘플은 bMFA에서 번역성을 증가시키고 잠재적인 치료제를 신속하게 스크리닝하기 위해 사용될 수 .......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 국립 보건원 (National Institutes of Health), 보조금 번호 : GM114359 및 GM134701 (M.F.K. 및 L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.), 국방 위협 감소 기관, 보조금 번호 : HDTRA11910012 (M.F.K. 및 L.E.K.)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 주사기 | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| 생체 모방 미세유체 분석(bMFA) | SynVivo | SMN1-C001 | 독점 |
| Bunt 바늘 | Jensen Global | JG24-0.5 | |
| 염화칼슘 | Fisher Scientific | C70-500 | |
| CFDA, SE | ThermoFisher | C1157 | |
| Dextran, 250,000, Powder | Spectrum Chemical Mfg. Corp | DE-130 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Health Care | 17-5442-02 | 백혈구 분리 매체 |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506 | |
| Hepes | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
| Human fibronectin | Fisher Scientific | 33-016-015 | 사용 다른 세포에 대한 공급업체 권장 ECM |
| 라인 미세혈관 내피 세포 성장 매체-2 BulletKit | Lonza | cc-3202 | 인간 폐 미세혈관 내피 세포 배양 배지(HLMVEC). |
| 인간 폐 미세 혈관 내피 세포 | Lonza | cc-2527 | 사용 vedor remommended 트립신-EDTA 및 TNS |
| 염화 마그네슘 | 피셔 사이언티픽 | BP214-500 | |
| 니콘 이클립스 Ti2 | 니콘 악기 Inc. | 현미경 | |
| NIS 요소, 5.20.01 | Nikon Instruments Inc. | 이미징 소프트웨어 | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21040CV | |
| PhD 울트라 주사기 펌프 | Harvard Apparatus | 70-3007 | 주사기 펌프 |
| 수산화칼 | Fisher Scientific | 02-003-763 | |
| 재조합 인간 TNF-알파 | R& D Systems | 210-TA | |
| 슬라이드 클램프 | SynVivo | ||
| 염화나트륨 | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Synvivo 공압 프라이머 | Synvivo | ||
| 트립신-EDTA, 트립신 중화 용액(TNS) | Lonza | cc-5034 | |
| Tygon 튜빙 | Fisher Scientific | 50-206-8921 | 튜빙 |
참고문헌
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Yang, Q., Wijerathne, H., Langston, J. C., Kiani, M. F., Kilpatrick, L. E.
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재인쇄 및 허가
