본 프로토콜은 대표적인 심장 유전자에 대해 번역 차단 모르폴리노를 설계, 준비 및 미세 주입하는 것을 설명합니다. Heart And Neural Crest Derivatives는 유전자 기능을 무너뜨리기 위해 새로 수정된 제브라피시 배아의 난황에 2(손2) 을 표현했습니다. 또한 이 유전자 산물을 암호화하는 mRNA의 동시 주입에 의한 이러한 "morphants"의 일시적인 구조를 보여줍니다.
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방법 논문
본 프로토콜은 대표적인 심장 유전자에 대해 번역 차단 모르폴리노를 설계, 준비 및 미세 주입하는 것을 설명합니다. Heart And Neural Crest Derivatives는 유전자 기능을 무너뜨리기 위해 새로 수정된 제브라피시 배아의 난황에 2(손2) 을 표현했습니다. 또한 이 유전자 산물을 암호화하는 mRNA의 동시 주입에 의한 이러한 "morphants"의 일시적인 구조를 보여줍니다.
morpholino oligomer 기반 knockdown system은 손실 또는 발현 감소를 통해 다양한 유전자 산물의 기능을 확인하는 데 사용되었습니다. 모르폴리노(MO)는 효소 분해에 취약하지 않기 때문에 DNA 올리고에 비해 생물학적 안정성에서 이점이 있습니다. 최적의 효과를 위해 MO를 1-4개의 세포기 배아에 주입합니다. 넉다운의 시간적 효능은 가변적이지만, MO는 결국 희석으로 인해 효과를 잃는 것으로 여겨집니다. Morpholino 희석 및 주입량을 면밀히 조절하여 on-target 효능을 유지하면서 off-target 효과의 발생을 최소화해야 합니다. CRISPR/Cas9와 같은 추가 보완 도구를 관심 대상 유전자에 대해 수행하여 돌연변이 세포주를 생성하고 이러한 세포주를 가진 morphant 표현형을 확인해야 합니다. 이 논문은 hand2에 대한 번역 차단 모르폴리노를 설계, 준비 및 1-4 세포 단계 제브라피시 배아의 난황에 미세주입하여 hand2 기능을 녹다운하고 해당 cDNA를 인코딩하는 mRNA의 동시 주입을 통해 이러한 "모르펀트"를 구출하는 방법을 보여줍니다. 그 후, 모르폴리노 미세주입제의 효능은 먼저 노른자(페놀 레드와 함께 주입)에 모르폴리노의 존재를 확인한 다음 표현형 분석을 통해 평가합니다. 또한 녹다운 효능을 테스트하기 위한 심장 기능 분석에 대해 논의합니다. 마지막으로, 웨스턴 블로팅(western blotting)을 통한 모르폴리노(morpholino)에 의한 유전자 번역 차단의 효과를 평가하는 것이 설명될 것입니다.
심혈관 발달 및 질병 연구를 위한 모델로 제브라피시를 활용하면 유전자 기능의 높은 보존, 광학 투명도, 빠른 심혈관 발달, 기존 생체 내 모델과 비교할 때 저렴한 비용 등 다양한 이점을 제공합니다1. 모르폴리노 올리고뉴클레오티드(MO)는 제브라피시 모델에 가장 일반적으로 사용되는 안티센스 유전자 녹다운 도구입니다. MO는 표현형을 결정하거나 유전자 기능을 조사하는 데 자주 사용됩니다. 제임스 서머턴(James Summerton) 박사는 인간 발달 결함에 대한 치료제를 개발하기 위한 시도로 mRNA 번역의 생체 내 억제를 위한 모르폴리노 전달 시스템을 처음 개발했습니다 2,3. MO는 유전자를 knockdown하고 표현형에 대한 이러한 knockdown의 결과를 조사하기 위해 in vitro 및 in vivo 모델 유기체에 사용되었습니다. 이것은 예를 들어 심장과 같은 특정 기관의 발달 변화를 관찰함으로써 이루어집니다. WT 제브라피시 배아에서 심장 특이적 유전자의 녹다운은 적절한 심장 박동의 실패로 이어졌으며, 이는 심장 ....
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모든 실험은 QU의 IACUC 규정에 따라 허용되는 인도적 동물 관리 표준에 따라 수행되었습니다. 동물들은 카타르 대학 생물 의학 연구 센터(QU-BRC) 산하 제브라피시 시설에 보관되었습니다. 이 실험 연구에 사용된 모든 동물은 수정 후 3일(dpf) 미만이었습니다.
참고: 각 실험 그룹에 대해 통계적 엄격성을 위해 최소 30개의 배아를 사용하는 것이 좋습니다. 실험 그룹은 다음과 같습니다.
대조군: 이 그룹에는 주사 없이 난수에서 배양된 배아가 포함됩니다. 여기의 결과는 제어 기준선을 형성합니다.
부정적 대조군 : 이 그룹에는 스크램블된 MO가 주입된 난수에서 배양된 배아가 포함됩니다.
주입된 그룹: 이 그룹에는 표현형을 구하기 위해 hand2 MO만 주입된 배아와 hand2 mRNA가 포함된 hand2 MO가 포함됩니다. 여기서의 결과는 주입된 MO로 인해 관찰된 표현형이 나타났음을 확인할 것입니다. 실험군을 비교하면 hand2 가 심장 기능에 미치는 ....
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그림 6의 그래프는 HAND2 특이적 MO 및 대조군 스크램블 MO 주입 배아 모두에서 24, 48 및 72 hphf에서 생존하는 배아의 평균 비율을 보여줍니다. 1 mM(8 ng/μL) 및 0.8 mM(6.4 ng/μL) MO 주입 배아는 대조군 스크램블 MO 주입 배아에 비해 생존율이 현저히 감소한 것으로 나타났습니다. 이것은 치사율 또는 기형이 관찰된 측정된 각 시점에서 관찰되었습니다. 그 결과, 고농도의 HAND2MO은 OFF-target 효과와 MO의 독성으로 인해 생존율이 현저히 낮다는 것을 나타냈습니다. 0.4 mM (3.2 ng/nL) HAND2 MO 주입 배아는 생존율의 현저한 감소를 나타내지 않았습니다. 그러나 대조군 스크램블 MO 주입 배아와 비교하여 심장 발달 지연, 길쭉한 욕조 모양의 구조 심장 및 심낭 부종과 같은 일부 유사한 표현형이 관찰되었습니다(그림 6).
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모르폴리노(MO) 기술은 제브라피시, 제노푸스, 성게, 그리고 최근에는 세포 배양 모델 시스템에 광범위하게 사용되었습니다. 대부분의 방법에는 이점과 함께 실험자가 알고 있어야 하는 함정도 있습니다. MO 기술의 주요 함정 중 하나는 MO 매개 유전자 녹다운 접근법에 의해 관찰된 표현형 효과가 일차 유전자 산물과 관련된 기능의 상실에 기인하는 것이 아니라 일차 유전자와 함께 또는 표적화된 일차 유전자와 독립적인 일부 다른 유전자에 기인한다는 우려를 포함합니다. 따라서 이러한 소위 "off-target" 효과가 "관찰된" morphant 표현형의 원인이 됩니다. 이 점은 제브라피시32에서 동일한 유전자에 대한 morphants와 mutants 사이에 좋지 않은 상관관계가 관찰되었을 때 전면에 등장했습니다. 따라서, 제브라피시 밭 2,3<.......
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저자는 재정적 이해관계나 다른 이해관계의 충돌을 선언하지 않는다.
이 기사의 게재는 BARZAN HOLDINGS의 아낌없는 지원으로 다루어졌습니다. RR은 소아과 및 아동 병원의 R61HL154254과 기금으로 부분적으로 지원됩니다.
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