거대한 Unilamellar 소포 안에 재구성 된 세포 골격의 신속한 캡슐화

지질 이중층 구획은 밀폐 된 유기 반응 및 막 기반 공정을 연구하기위한 모델 합성 세포 또는 약물 전달 응용 프로그램 ^1,2에서 캐리어 모듈로 사용됩니다. 정제된 성분을 이용한 상향식 생물학은 단백질과 지질 ^3,4와 같은 생체분자 사이의 특성과 상호작용을 탐구하기 위해 최소한의 실험 시스템을 필요로 한다. 그러나 현장의 발전과 함께 생물학적 세포의 조건을 더 잘 모방하는보다 복잡한 실험 시스템에 대한 필요성이 증가하고 있습니다. GUVs에서의 캡슐화는 변형가능하고 선택적으로 투과가능한 지질 이중층 및 제한된 반응 공간을 제공함으로써 이러한 세포 유사 특성 중 일부를 제공할 수 있는 실용적인 접근법이다. 특히, 합성 세포의 모델로서 세포골격계의 시험관내 재구성은 막 구획⁵에 캡슐화함으로써 이익을 얻을 수 있다. 많은 세포골격 단백질은 세포막에 결합하고 상호작용한다. 대부분의 세포골격 어셈블리는 세포 전체에 걸쳐 있는 구조를 형성하기 때문에, 그 형상은 세포 크기의 감금⁶에 의해 자연적으로 결정된다.

팽윤^7,8, 소형 소포 융합^9,10, 에멀젼 전달 11,12, 펄스 젯팅 13, 및 다른 미세유체 접근법(^14,15)과 같은 GUV를 생성하기 위해 상이한 방법이 사용된다. 이러한 방법은 여전히 활용되지만 각 방법에는 한계가 있습니다. 따라서, 높은 수율의 GUV 캡슐화를 갖는 견고하고 직접적인 접근법이 매우 바람직하다. GUVs의 형성을 위해 자발적 팽윤 및 전기팽윤과 같은 기술이 널리 채택되었지만, 이들 방법은 주로 특정 지질 조성물(¹⁶), 낮은 염 농도 완충제(17), 더 작은 캡슐화제 분자 크기(¹⁸)와 양립가능하고, 높은 부피의 캡슐화제를 필요로 한다. 여러 개의 작은 소포를 GUV에 융합시키는 것은 본질적으로 에너지적으로 바람직하지 않으며, 따라서 하전된 지질 조성물⁽⁹) 및/또는 펩티드(¹⁹) 또는 다른 화학물질과 같은 외부 융합 유도제에서의 특이성을 필요로 한다. 한편, 에멀젼 전달 및 미세유체 방법은 각각^18,20개의 이중층 형성 후 계면활성제 및 용매 제거를 통한 액적 안정화를 필요로 할 수 있다. 펄스 분사와 같은 미세유체 기술에서의 실험 셋업 및 장치의 복잡성은 추가적인 도전(²¹)을 부과한다. cDICE는 에멀젼 전달^22,23을 지배하는 유사한 원리로부터 유래된 에멀젼-기반 방법이다. 수용액(outer solution)과 지질-오일 혼합물은 회전하는 원통형 챔버(cDICE chamber)에서 원심력에 의해 층화되어 지질 포화 계면을 형성한다. 회전하는 cDICE 챔버 내로 지질 단층 수성 액적을 떨어뜨리는 것은 액적이 외부 수용액(^22,24) 내로 지질-포화 계면을 가로질러감에 따라 이중층의 지퍼링을 초래한다. cDICE 접근 방식은 GUV 캡슐화를 위한 강력한 기술입니다. 제시된 변형 방법에 의해, 상당히 짧은 캡슐화 시간(수 초)을 갖는 cDICE에 대해 전형적인 높은 소포 수율이 달성될 뿐만 아니라, 시간-의존적 과정(예를 들어, 액틴 시토골격 네트워크 형성)의 관찰을 허용하는 GUV 생성 시간이 상당히 감소된다. 이 프로토콜은 GUV 수집 및 이미징까지 처음부터 약 15-20 분이 걸립니다. 여기에서, GUV 생성은 액틴 및 액틴 결합 단백질 (ABPs)을 캡슐화하기 위한 변형된 cDICE를 사용하는 방법을 사용하여 기술된다. 그러나, 제시된 기술은 바이오폴리머의 조립에서부터 무세포 단백질 발현, 막 융합 기반 화물 전달에 이르기까지 광범위한 생물학적 반응 및 막 상호작용을 캡슐화하는데 적용가능하다.

1. 오일-지질-혼합물의 제조

참고: 이 단계는 클로로포름 취급에 대한 모든 안전 지침에 따라 흄 후드에서 수행해야 합니다.

1. 0.5 mL의 클로로포름을 15 mL 유리 바이알에 담으십시오. 25mg/mL 디올레오일포스포콜린(DOPC) 88μL, 50mg/mL 콜레스테롤 9.3μL, 1mg/mL 디올레오일-포스포에탄올아민-리사민 로다민 B(로다민 PE)( 로다민 PE) 5μL를 15ml 유리 바이알에 넣습니다.
   참고 : 실리콘 오일 / 미네랄 오일에서 DOCC와 콜레스테롤의 최종 몰분율은 각각 69.9 %와 30 %입니다. 20-30 몰% 콜레스테롤이 제시된 기술^25,26을 사용하여 생성된 GUVs의 막 유동성 및 안정성에 대해 최적화된 농도임을 입증하였다. 생리학적으로, 이들 값은 포유동물 세포 원형질막⁽⁶)에서 발견되는 콜레스테롤 농도 범위 내에 잘 있다. 지질 스톡은 클로로포름 중의 용액으로서 획득되고 -20°C에서 저장된다. 지질 스톡 바이알은 열리기 전에 실온에 적응해야합니다.
2. 두 번째 15 mL 바이알에 7.2 mL의 실리콘 오일 및 1.8 mL의 광유를 피펫 한다 (물자의 표 참조). 일반적으로, 이것은 주로 미네랄 오일이 재사용되는 경우 저습도 글로브 박스에서 수행되어야합니다.
3. 최대 회전 속도 (3200 rpm)에서 10 초 동안 볼텍싱하여 오일을 혼합하고, 혼합물을 지질 인 클로로포름 혼합물을 포함하는 바이알에 첨가하고, 즉시 와류 믹서 상에 놓는다. 최대 회전 속도 (3200 rpm)에서 10-15 초 동안 소용돌이. 생성된 지질-중-유질 혼합은 지질이 오일에 완전히 용해되지 않고 오히려 작은 응집체(²⁴)로서 분산되기 때문에 약간 흐려야 한다.
4. 지질 중-유 분산액을 80W의 초음파 전력과 40kHz의 작동 주파수로 욕조 초음파 처리기 ( 재료 표 참조)에 넣고 실온에서 30 분 동안 사용하십시오. 혼합물을 즉시 사용하거나 최대 24 시간 동안 4°C에서 보관한다.

2. 소포 생성

1. 검정색 수지로 만든 3D 프린트 샤프트(보충 파일 1)( 자료 표 참조)를 벤치탑 교반판에 장착하고 회전 속도를 1200rpm으로 설정합니다.
2. 투명 수지(재료 표 참조)로 만든 3D 프린트된 cDICE 챔버(보충 파일 2)를 샤프트에 장착합니다(그림 1A,B).
3. 액틴 및 액틴 결합 단백질(ABP) 용액을 20 μL의 총 부피로 별도로 준비한다.
   1. 10% ATTO 488 액틴을 포함하는 구상 액틴 완충액(G-buffer)에서 1-10 μM의 액틴을 제조하였다( 표 참조).
      참고: 1x G-완충액은 5 mM의 Tris-HCl, pH 8.0, 및 0.2 mM의_CaCl2를 포함한다.
   2. 필라멘트성 액틴 중합 완충액(F-완충액)을 첨가하여 얼음 위에서 액틴 중합을 시작한다. 가교제를 첨가하기 전에 액틴 중합을 늦추기 위해 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
      참고: 1x F-버퍼는 10mM의 트리스, pH 7.5에서 50mM의 KCl,_{2mM의 MgCl2} 및 3mM의 ATP를 함유한다.
   3. 원하는 몰비로 관심있는 가교제를 첨가하기 전에 얼음 상에서 액틴 중합의 개시를 허용하도록 15분 동안 기다린다. 캡슐화 될 때까지 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
   4. 액틴 결합 단백질(ABPs)을 마이크로튜브에 별도로 준비한다(도 1C).
      참고: 이 단계는 ABP(예를 들어, 미오신, α-액티닌, 파신, Arp2/3 복합체)의 조합이 액틴^25,26,27로 캡슐화될 때 수행된다. 이러한 경우, 각 ABP의 원하는 양은 재고에서 추출되어 ABP용으로 지정된 마이크로튜브에 추가됩니다. 총 용액이 20 μL가 되어야 하므로, ABPs의 스톡 분취량은 총 ABP 혼합물의 원하는 양이 5-6 μL를 초과하지 않도록 제조되어야 한다. 여기서 대표적인 결과에 사용 된 유일한 ABP는 fascin이며, 그 준비는 아래에 언급되어 있습니다.
      1. 1.75 mg/mL의 파신 스톡으로부터 파신 1.57 μL를 분취하고(표 표 참조), 단계 2.7에서 액틴 용액에 직접 첨가한다. 이것은 용액 중 2.5 μM의 파신에 해당합니다.
4. 7.5%의 밀도 구배 매질( 표 참조)을 액틴 용액에 첨가하여 GUV 침강을 용이하게 하기 위해 외부와 내부 수성상 사이에 밀도 구배를 생성한다.
5. 200 mM의 글루코오스의 외부 용액 700 μL를 챔버 내로 분주한다(도 1D, 왼쪽).
   참고 : 내부 용액의 삼투압은 포도당의 농도를 결정합니다. 이러한 실험에서 내부 용액의 삼투압은 ~ 200mOsm이므로 200mM 포도당 용액이 외부 용액으로 사용됩니다.
6. 챔버의 60%-80%가 채워질 때까지 충분한 양의 지질-오일 혼합물(챔버 크기 기준 >3 mL)을 챔버에 첨가한다(그림 1D, 오른쪽). 지질-오일 혼합물과 외부 용액 사이에 계면이 형성될 것이다.
7. ABP (단계 2.3.4에서 준비)를 액틴 용액으로 옮깁니다. 규칙적인 100-1000 μL 피펫을 사용하여, 즉시 700 μL의 지질-오일 혼합물을 액틴-ABP 혼합물로 옮긴다(도 1E, 왼쪽). 피펫을 8회 상하로 하여 직경이 7-100 μm 범위인 세포 크기의 지질단층 액적을 생성한다(도 1E, 중간).
   참고: 캡슐화하기 전에 actin 네트워크 어셈블리를 피하기 위해 2.7단계를 몇 초 안에 완료해야 합니다. 따라서 단계를 수행하기 전에 피펫 팁이 이미 피펫에 삽입되어 혼합물을 옮길 준비가되었는지 확인하십시오.
8. 동일한 100-1000 μL 피펫을 사용하여 즉시 전체 에멀젼을 회전 챔버 내로 분배하십시오. 액적은 오일-외부 용액 계면에서 지질 단일층을 교차시켜 지질의 두 번째 전단지를 획득하고, 이에 따라 GUVs를 형성한다(도 1E, 오른쪽).
9. 교반 플레이트로부터 챔버를 제거하고, 지질-오일 혼합물의 큰 부분이 챔버의 중앙에 있는 큰 개구로부터 배수되도록 폐기물 용기 내의 챔버를 기울임으로써 대부분의 지질-오일 혼합물을 버린다.
   참고: 이런 식으로, 지질-오일 혼합물은 챔버 밖으로 인출되어, 다음 단계에서 지질-오일 혼합물과 외부 용액의 혼합을 피한다.
10. 뚜껑이 사용자 쪽으로 향하도록 챔버를 잡으십시오. 챔버 뚜껑을 열고 챔버를 사용자 쪽으로 약간 기울입니다. GUVs를 함유하는 외부 용액과 지질-오일 혼합물 사이의 계면은 챔버 개구부(뚜껑이 있는 곳)로부터 볼 수 있다.
11. 피펫을 사용하여 GUV를 포함하는 충분한 외부 용액을 수집하고 50-300 μL의 외부 용액을 96-웰 플레이트에 분주하여 적절한 밀도의 GUV를 얻습니다.
    참고: 이 프로토콜에 따라 챔버 내부의 외부 솔루션에서 총 약 2 x 10^5개의 GUV가 방출됩니다. GUV 분산도는 정량화되지 않았다; 그러나, GUVs의 약 90%의 직경은 12-30 μm의 범위이다. 7-50 μm의 범위 내의 임의의 직경을 갖는 GUVs는 집단에서 발견될 수 있다. 캡슐화된 밀도 구배 매질, GUV 크기 및 웰 플레이트의 용액 깊이에 따라 GUV가 표면에 정착하는 데 2-15분이 걸립니다. 재구성 된 액틴 번들을 가진 GUV의 수율은 약 90 %입니다.

3. 이미징 및 3D 이미지 재구성

1. 회전 디스크 (또는 레이저 스캐닝) 공초점 장치, EMCCD 또는 sCMOS 카메라 및 오일 침지 60x 대물 렌즈가 장착 된 반전 현미경 무대에 96 웰 플레이트 를 설치하십시오 (재료 표 참조).
2. 관심 영역(ROI)에 초점을 맞추고 0.5μm의 z-스텝 간격으로 ROI에서 z-스택 이미지 시퀀스를 가져옵니다.
   참고: GUV는 시간이 지남에 따라 표면에서 약간 변위될 수 있기 때문에 여러 형광단이 이미지화되는 경우 각 z-평면에서 다중 파장 이미지 세트를 캡처하는 것이 좋습니다. 즉, 한 번에 각 z-레인에서 561nm 및 488nm 이미지 그룹을 촬영하여 ATTO 488 액틴 및 Rhod PE 이미지를 캡처하는 것이 좋습니다.
3. 각 z-스택 이미지 시퀀스를 .tiff 형식으로 저장합니다.
4. 이미지 처리 소프트웨어(ImageJ/Fiji)에서 관심 있는 이미지 시퀀스를 엽니다. 강도가 가장 높은 이미지를 식별합니다. "ctrl + shift + c"를 눌러 밝기 및 대비 창을 열고 재설정을 클릭하십시오.
5. ImageJ/피지 메뉴에서 분석 > 배율 설정 으로 이동하여 각 이미지 픽셀에 대해 알려진 물리적 거리와 해당 단위를 입력합니다.
6. ImageJ/피지 메뉴에서 이미지 > 스택 > 3D 프로젝트로 이동하여 z- 스택에서 3D 이미지를 재구성합니다. "투영 방법"을 밝기 포인트로, "슬라이스 간격(μm)"을 0.5로 설정하고 보간을 체크오프합니다. 기본 옵션은 나머지 설정에 사용할 수 있습니다.
   참고: 일부 현미경의 z-간격은 보정되지 않을 수 있으며, z 방향의 실제 이동은 입력된 z-간격(즉, 0.5μm)과 약간 다를 수 있습니다. 이러한 경우에, 공지된 직경을 갖는 형광 미소 구체들과 같은 3D 교정 시편이 실제 z-interval을 얻기 위해 사용될 수 있다. 따라서 이 값은 3D 프로젝션의 "슬라이스 간격(μm)"으로 사용됩니다.

현재의 프로토콜을 사용하여 세포골격 GUVs의 성공적인 생성을 입증하기 위해, GUVs에서의 파신-액틴 다발 구조가 재구성되었다. 파신은 뻣뻣한 병렬 정렬된 액틴 다발을 형성하는 액틴 필라멘트의 짧은 가교결합제이며, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 융합 단백질26으로서 대장균으로부터 정제된다. 5 μM의 액틴은 먼저 액틴 중합 완충액 중의 0.53 μM의 ATTO488 액틴 및 7.5%의 밀도 구배 매질을 포함하여 재구성되었다. 파신을 2.5 μM의 농도로 첨가하고 파신-액틴 혼합물을 캡슐화시, GUVs에서 액틴 다발 구조를 형성하였다. 로다민 PE 표지된 GUVs에서 캡슐화된 액틴 다발 구조의 Z-스택 공초점 이미지 서열은 캡슐화 후 1시간 동안 포획되었다(도 2A). 이 프로토콜을 사용하여, 캡슐화된 액틴 가교결합제, α-액티닌 및 파신의 내재적 경쟁 및 분류는, 함께, GUV 크기 의존적 방식으로 상이한 액틴 번들 패턴을 형성하는, 이전에 입증되었다(26).

여기에 제시된 변형된 반전 에멀젼 접근법과 마찬가지로, 전통적인 cDICE 공정은 높은 수율로 세포골격 GUV를 생성하지만, 초당나노리터 22,28 나노리터 순으로 낮은 유속으로 단백질 용액을 회전 챔버 내로 제어된 주입을 위한 주사기 펌프 및 튜빙 셋업을 필요로 한다. 이러한 접근법에서, 에멀젼은 회전하는 cDICE 챔버에서 직접 생성되고; 얇은 모세관이 오일상에 삽입됩니다. 단백질 용액은 시린지 펌프를 통해 주입된다. 물방울은 수성 외상을 향해 이동하기 전에 모세관 팁에서 형성되고 전단되며, 여기서 이들은 위에서 설명한 방법과 유사하게 GUV로 변합니다. 도 2B는 이러한 접근법을 사용하여 반응 혼합물을 캡슐화하는 소포를 보여준다. 반응 믹스는 0.9 μM의 파신에 의해 번들링되는 6 μM의 액틴을 함유한다. 여기서 두 가지 방법과 그 결과는 비교되지 않지만 둘 다 GUV의 높은 수율을 생성한다는 점에 유의하십시오.

그림 1: GUV를 생성하기 위한 실험 설정 . (A) cDICE 챔버의 상면도 및 측면 단면도. (b) 방사 챔버를 위한 셋업의 사진. (C-E) GUV 생성을 위한 단계적 절차의 개략적인 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 액틴 번들 구조의 캡슐화. (A) 이미지는 GUVs의 대표적인 형광 공초점 조각(왼쪽)과 액틴 및 지질 채널의 공초점 z-스택의 최대 투영(오른쪽)을 보여준다. 파신, 2.5 μM; 액틴, 5 μM (10% ATTO 488 액틴 포함). 스케일 바 = 10 μm. (B) 통상적인 cDICE를 이용한 액틴 다발 구조물의 캡슐화. 이미지는 파신의 존재하에 형성된 캡슐화된 액틴 다발의 공초점 형광 이미지의 대표적인 최대 투사를 보여준다. 파신, 0.9 μM; Actin, 6 μM. 스케일 막대 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1 : 3D 인쇄 샤프트 디자인. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2 : 3D 인쇄 cDICE 챔버 용 설계. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.