여기에서는 뮐러 아교 세포 (MGC)에서 2',7'-dichlorofluorescein diacetate probe (DCFH-DA)를 사용하여 세포 반응성 산소 종 (ROS)을 검출하기위한 체계화되고 접근 가능하며 재현 가능한 프로토콜을 제안합니다. 이 방법은 유세포 분석기로 총 세포 ROS 수준을 정량화합니다. 이 프로토콜은 사용하기 매우 쉽고 적합하며 재현 가능합니다.
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방법 논문
뮐러 신경교 세포에서 2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트 프로브 및 유세포 분석기를 사용한 반응성 산소 종의 정량화
이 논문에서
요약
초록
산화 환원 균형은 세포 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을합니다. 반응성 산소 종 (ROS)의 증가된 생성은 단백질, 지질 및 DNA의 변형을 촉진하며, 이는 최종적으로 세포 기능 및 세포 사멸의 변화를 초래할 수 있다. 따라서 세포는 Keap1 / Nrf2와 같은 항산화 경로를 활성화하거나 산화 환원 제거제 (비타민 A, C 및 E, β 카로틴 및 폴리 페놀 등)를 개선함으로써 해로운 모욕에 대한 반응으로 항산화 방어력을 높이는 것이 유익합니다. 염증 및 산화 스트레스는 당뇨병성 망막병증(DR) 및 미숙아 망막병증(ROP)과 같은 망막병증의 병인 및 진행에 관여한다. 뮐러 신경교세포(MGCs)는 신경 망막 조직의 항상성에 중요한 역할을 하기 때문에, 이들은 이러한 세포 보호 메커니즘을 연구하기에 이상적인 모델로 간주됩니다. 이러한 의미에서, 재현 가능하고 간단한 방법으로 ROS 수준을 정량화하는 것은 항산화 세포 방어 메카니즘에 참여하는 경로 또는 분자의 기여도를 평가하는 데 필수적이다. 이 기사에서는 DCFH-DA 프로브를 사용한 ROS 측정 및 MGC의 유세포 분석기를 사용하는 데 필요한 절차에 대한 완전한 설명을 제공합니다. 소프트웨어를 사용한 유세포 분석 데이터 처리를 위한 주요 단계가 여기에 제공되므로 독자는 ROS 수준(FITC의 기하학적 수단)을 측정하고 형광 히스토그램을 분석할 수 있습니다. 이러한 도구는 세포 모욕 후 ROS의 증가뿐만 아니라 세포에 대한 보호 효과를 제공 할 수있는 특정 분자의 항산화 효과를 연구하는 데 매우 유용합니다.
서론
신경 망막은 잘 정의 된 신경 층을 제시하는 매우 조직 된 조직입니다. 이들에서, 뉴런 (신경절, amacrine, 양극성, 수평 및 광수용체 세포)은 서로 상호 연결되고 또한 뮐러 아교 세포 (MGCs) 및 성상 세포와 상호 연결되어 시각 정보의 적절한 광전달 및 처리로 이어진다 1,2. MGCs는 전체 망막 절편을 횡단하기 때문에 망막 항상성의 유지에 중요한 역할을하는 것으로 알려져 있으며, 따라서 여러 보호 과정을 조절하는 모든 세포 유형과 상호 작용할 수 있습니다. MGC는 뉴런에 에너지를 공급하는 당분해, 신경 노폐물의 제거, 신경 전달 물질의 재활용 및 신경 영양 인자의 방출을 포함하여 망막 뉴런의 유지 및 생존을위한 몇 가지 중요한 기능을 가지고 있음이보고되었습니다 3,4,5.
한편, 염증, 산화 및 니트로성 스트레스는 망막병증 6,7,8,....
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프로토콜
참고: 버퍼 조성에 대해서는 표 1을 참조하십시오.
1. 세포 배양 준비
참고: 여기에 기술된 것은 자발적으로 불멸화된 인간 뮐러 신경교세포 세포주인 MIO-M1 세포의 배양 준비이다(무어필드/안과 연구소- 뮐러 1). 항상 적절한 무균 기술을 사용하고 층류 후드에서 작업하십시오.
- Dulbecco의 수정 된 Eagle 's medium (DMEM) 완전 매체를 준비하십시오. 4.5 g/L D-글루코오스 및 110 mg/L 소듐 피루베이트를 함유하는 DMEM에 10% 열 불활성화 FBS, 10 mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES), 2 mM L-글루타민 및 50 U/mL 페니실린/스트렙토마이신을 첨가하십시오. 신선한 배지를 준비하고, MIO-M1 세포를 해동시키는 날에 준비한다.
- 냉동된 MIO-M1 세포를 1일째에 해동시킨다.
- 이렇게 하기 위해, 액체 질소 저장소로부터 10% DMSO로 FBS 중의 5 x 105 MIO-M1 세포를 함유하는 동결을 제거하고 즉시 37°C 수조에 넣는다.
참고: 액체 질소에 저장된 냉동 장치는 해동 시 ....
- 이렇게 하기 위해, 액체 질소 저장소로부터 10% DMSO로 FBS 중의 5 x 105 MIO-M1 세포를 함유하는 동결을 제거하고 즉시 37°C 수조에 넣는다.
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결과
프로토콜 섹션에 기재된 바와 같이, 우리는 ROS 유도제, A 또는 B로 자극된 MIO-M1 세포로부터의 형광 프로브 DCFH-DA를 사용한 ROS 생산의 유세포 분석 검출을 입증하는 대표적이고 정량적인 데이터를 나타내었다. 예상대로, 우리는 자가형광 수준 이상의 자극되지 않은 세포에서 FITC 형광의 변화를 관찰하였다(도 1A, "기저 대조군" 대 "자가형광 대조군"을 비교, 점도표 그래프). 이는 MIO-M1 세포에서 ROS의 기저 생산으로 인해 발생하였다. (도 1B, "기저 대조군" 대 "자가형광 대조군", 히스토그램 그래프 비교).
흥미롭게도, 세포가 ROS 유도제, A 또는 B로 자극되었을 때 FITC 형광의 유의한 증가가 관찰되었다 (도 1B, "ROS 유도제 A" 샘플 대 "기저 대조군" 및 "ROS 유도제.......
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토론
암, 염증성 질환, 허혈 / 재관류, 허혈성 심장 질환, 당뇨병 및 망막 병증과 같은 몇 가지 병리학 적 상태와 노화와 같은 생리적 상황은 ROS 과잉 생산 6,7,8,9,10,11로 이어집니다. 따라서, ROS의 조절에 관여하는 경로의 검출, 측정 및 이해는 많은 질병에 대한 중요한 표적이다. DCFH-DA와 같은 ROS 수준을 측정하기 위해 프로브를 사용하는 것은 접근 가능하고 널리 설명되며 과학 문헌 26,27,28에서 받아 들여집니다.
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
저자들은 CIBICI의 María Pilar Crespo와 Paula Alejandra Abadie (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina)에게 유세포 측정에 도움을 준 것과 세포 배양 지원을 위해 Gabriela Furlan과 Noelia Maldonado에게 감사하고 싶습니다. 또한 비디오 제작 및 편집에 대한 Victor Diaz (FCQ의 기관 커뮤니케이션 담당 장관)에게 감사드립니다.
이 기사는 Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) 및 Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (모두 M.C.S.)의 보조금으로 자금을 지원받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2′,7′-DCFH-DA | Sigma | 35845-1G | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco by life technologies | 15630-080 | |
| BD FACSCanto II 유세포 분석기 | BD Biosciences | FACSCanto | |
| BD FACSDiva 소프트웨어 | BD Biosciences | ||
| 세포 배양 접시 100x20 mm | Cell Star- Greiner Bio-One | 664 160 | |
| 원심분리기 | Thermo | Sorvall legend micro 17 R | |
| 원심분리기 튜브(15ml) | BIOFIL | CFT011150 | |
| 원심분리기 튜브(50ml) | BIOFIL | CFT011500 | |
| 극저온 | CRYO. S - Greiner Bio-One | 126263 | |
| 디메틸 설폭사이드 | 시그마-알드리치 | W387520-1KG | |
| 디소듐-수소-인산염 헵타하이드레이트 | 머크 | 106575 | |
| DMEM 페놀 레드 | Gibco by life technologies | 31053-028 | |
| Dulbecco' s 변형 된 독수리' s 매체 (DMEM) | 생명 과학의 Gibco | 11995065 | |
| 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 디소듐 염, 이수화 | 머크 | 324503 | |
| 태아 소 혈청 | Internegocios | ||
| FlowJo v10 소프트웨어 | BD Biosciences | ||
| 포도당 | 머크 | 108337 | |
| 혈구계, Neubauer 챔버 | BOECO, 독일 | ||
| 층류 후드 | ESCO | AC2-6E8 | |
| L-글루타민 (GlutaMAX) | Gibco by life technologies | A12860-01 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Gibco by life technologies | 15140-122 | |
| 염화칼 | 머크 | 104936 | |
| 칼륨-인산이수소 | 머크 | 4878 | |
| 원형 폴리스티렌 튜브 5ml(유세포 분석 튜브) | 팔콘 - 코닝 | BD-352008 | |
| 아지드나트륨 | 머크 | 822335 | |
| 염화나트륨 | Merck | 106404 | |
| 수산화나트륨 | Merck | 106462 | |
| SPINWIN 마이크로 원심분리기 튜브 1.5ml | Tarson | 500010-N | |
| 조직 배양 플레이트 6 | BIOFIL | TCP011006 | |
| Trypan Blue | Merck | 111732 | |
| Trypsin-EDTA 0.5% 10X | Gibco by life technologies | 15400-054 | |
| 볼텍스 믹서 | Labnet International, Inc. |
참고문헌
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. L. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
- Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single....
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재인쇄 및 허가
