인슐린 생성 세포로 분화를 위한 쥐 지방조직 중간엽 줄기세포의 분리

중간엽 기질 세포로도 알려진 중간엽 줄기 세포 (MSCs)는 재생 의학 ^1,2에 가장 널리 사용되는 세포 유형 중 하나입니다. 이들은 성체줄기세포로 분류되며 다계보 분화 가능성과 자가재생능력을 특징으로^한다3. 중간엽 줄기세포는 지방 조직, 골수, 말초 혈액, 탯줄 조직 및 혈액, 모낭 및 치아 ^4,5를 포함하는 다양한 공급원으로부터 단리되고 수득될 수 있다.

지방 조직으로부터 줄기 세포를 분리하는 것은 쉬운 접근, 시험관 내에서의 빠른 팽창 및 높은 수율⁶으로 인해 매력적이고 유망한 것으로 간주됩니다. 지방조직 유래 중간엽 줄기세포(Ad-MSCs)는 인간, 소, 생쥐, 래트 및 보다 최근에는 염소⁷과 같은 상이한 종으로부터 분리될 수 있다. Ad-MSC는 이제 조직 공학 및 유전자 / 세포 요법의 잠재적 인 후보자이며 연조직 손상 또는 결함 ^7,8의 장기적인 복구를위한 자가 대안을 개발하는 데에도 사용할 수 있음이 입증되었습니다.

국제 세포 및 유전자 치료 학회 (ISCT)는 완전한 특성화를 위해 MSC가 전시해야하는 세 가지 최소 기준을 정의했습니다⁹. 첫째, 그들은 플라스틱 지지자이어야합니다. 둘째, 중간엽 줄기세포 표면 마커, 예컨대 CD73, CD90, 및 CD105를 발현하고 조혈 마커 CD45, CD34, CD14 또는 CD11b, CD79α 또는 CD19, 및 HLA-DR의 발현이 결여되어야 한다. 마지막으로, MSCs는 세 개의 중간엽 혈통으로 분화 할 수있는 능력을 나타내야합니다 : 지방세포, 골세포 및 연골 세포. 흥미롭게도, MSCs는 또한 신경 세포, 심근 세포, 간세포 및 상피 세포^10,11과 같은 다른 혈통으로 분화 할 수 ^{있습니다.}

사실, MSC는 다른 질병에 대한 재생 요법에서 잠재적 인 치료제로 적용 될 수있는 독특한 특성을 가지고 있습니다. MSCs는 치료 이점을 제공하는 면역조절 환경을 유도하기 위해 가용성 인자를 분비할 수 있다⁽¹²). 또한, MSCs는 표적 치료를 전달하기 위해 손상 부위 및 종양 미세 환경으로 이동할 수 있습니다. 그러나, 메카니즘은 완전히 해명되지 않았다⁽¹³). 또한, MSCs는 비코딩 RNAs, 단백질 및 가용성 인자의 화물을 운반하는 나노스케일에서 엑소좀, 세포밖 소포를 분비하는 능력을 가지며, 이는 최근 다양한 질병에서 MSCs의 치료 잠재력의 새로운 메카니즘으로서 등장한다¹⁴.

더욱 중요하게는, MSCs는 유전자 변형(^15,16) 또는 시험관내 배양 배지 내의 다양한 외인성 유도 인자를 이용함으로써 인슐린 생산 세포(IPCs)로 분화할 수 있는 그들의 잠재력에 대해 뚜렷한 관심을 불러^{일으켰다.} IPC 유도 기간은 사용 된 유도 프로토콜 및 활용 된 외인성 요인에 따라 다르기 때문에 크게 다릅니다. 분화 과정은 며칠에서 수개월까지 지속될 수 있으며, 다른 단계에서 추가 및 / 또는 철회되어야하는 외인성 유도 인자의 조합이 필요합니다. 내분비 췌장 분화에 사용 된 이러한 요인 중 많은 부분은 인슐린 분비 β 세포의 증식 또는 분화 / 신 생성을 촉진하고 IPC^18,19,20,21의 인슐린 함량을 증가시키는 것으로 밝혀진 생물학적 활성 화합물^입니다. MSCs가 또한 그들의 분비물을 포함한 여러 메커니즘을 통해 당뇨병과 그 합병증에 치료 효과가있는보고뿐만 아니라 면역 조절 작용의 광범위한 배열^22,23,24 인 것으로 여기에서 주목할 만하다.

이 프로토콜에서, 우리는 래트 부고환 지방으로부터 Ad-MSCs의 분리 및 특성화를 위한 상세한 단계적 프로토콜을 제시하고, 이어서 Ad-MSCs로부터 IPCs의 생성을 위한 간단하고 비교적 짧은 프로토콜이 뒤따른다.

모든 실험은 승인 된 지침에 따라 수행되었으며, 모든 절차는 이집트 카이로, 이집트의 영국 대학 (BUE)의 약학 학부 윤리위원회의 승인을 받았습니다. Ad-MSC 격리 프로토콜은 Lopez 및 Spencer에서 채택되었으며 수정¹⁵가 적용되었습니다.

1. 쥐 부고환 지방 패드에서 Ad-MSC의 분리

1. 생후 1 개월 이하의 체중 250-300g의 수컷 Sprague-Dawley 쥐를 사용하십시오 (격리 당 두 마리). 동물을 마취 한 다음 자궁 경부 탈구로 안락사시킵니다. 안락사된 동물에게 70% 에탄올을 뿌린다. 복부의 아래 부분에서 피부와 근육을 절제한 다음 두 고환을 꺼내 부고환 지방 패드를 노출시킵니다.
2. 부고환 지방 패드를 부드럽게 자르고 혈관을 자르지 않도록주의하십시오.
3. 부고환을 둘러싼 지방 조직을 분리한 다음, 인산완충식염수(PBS)를 함유하는 페트리 접시에 넣는다.
4. 생물 안전 캐비닛에서이 뚱뚱한 패드를 포셉과 메스를 사용하여 작은 조각으로 자릅니다. 이들 절단된 지방 조직 조각을 10 mL의 멸균 PBS를 함유하는 50 mL 원심분리 튜브 내로 옮긴다.
5. 다진 지방 조직을 매번 PBS 10 mL로 5회 세척하여 오염된 혈액을 제거하였다. 다음 세척 절차는 꼼꼼하게 수행해야합니다.
   1. PBS 10 mL를 조직에 첨가하고 45초 동안 완전히 혼합한다. 그런 다음 튜브를 5 분 동안 유지하여 조직이 중력을 통해 침전되도록하여 두 층으로 분리하십시오.
   2. 10 ml 주사기를 사용하여 적외선으로부터 PBS를 흡인하고, 또 다른 세척을 위해 신선한 PBS 10 mL로 교체한다.
   3. PBS가 혈액이 맑아질 때까지 이 세척 단계를 4-5회 반복한다. 이것은 혈액의 대부분이, 전부는 아니더라도 제거된다는 것을 나타냅니다.
6. 세척 후, 지방 조직을 콜라게나제 용액 10 mL에 재현탁시킨다(PBS 중 0.1% 콜라게나제 타입 1). 튜브를 파라필름으로 단단히 밀봉한 다음, 조직이 거의 균질해질 때까지 진탕 수조(37°C, 80rpm, 45분 동안)에서 인큐베이션한다.
   참고 : 조직의 완전한 소화를 피하십시오 (용액이 모든 조직 잔류 물 / 조각이 완전히 사라지면서 완전히 균질 해지는 경우), 나중에 세포의 배양에 악영향을 미치기 때문입니다. 일반적으로 소화에는 30-45 분이 걸립니다.
7. 콜라게나제 소화가 완료되면 튜브를 15초 동안 와류시킨 다음 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 튜브를 다시 10초 동안 소용돌이치고, 이어서 또 다른 5분 원심분리가 이어진다. 그런 다음 세 개의 층이 관찰됩니다. 조심스럽게 오일 층을 버리고, 이어서 기질 혈관 분획 (SVF) 펠릿을 방해하지 않고 수성 층을 버린다.
   참고: 지방세포와 콜라게나제 용액을 포함하는 상층액을 제거하십시오. 먼저, 오일 액적의 완전한 제거를 보장하기 위해 10 mL 피펫으로 지방세포 및 수반되는 오일층을 제거한 다음, 수성층 아래를 제거한다.
8. 튜브 바닥에 SVF 펠렛을 멸균 BSA 용액 10 mL (PBS 중의 1% 알부민, 소 혈청 분획 V 용액)에 재현탁시킨 다음, 튜브를 300 x g에서 5분 동안 원심분리한다.
9. 원심분리 후, 상층액을 버리고 SVF 펠릿을 Ad-MSC용 완전 배지 8.5mL에 현탁시킨다(10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 0.25 μg/mL 암포테리신 B 및 2 mM L-글루타민으로 보충된 둘베코의 변형된 이글 배지/영양 혼합물 F-12[DMEM/F12] 배지로 구성됨).
10. 세포를 5% CO2 하에 37°C에서_{25 cm2} 플라스크에서 배양한다. 다음 날, 부착 된 세포를 확인하고, 정지 된 세포를 제거하고, 배지를 교체하십시오. 그 후, 격일로 미디어를 바꿉니다.
11. 트립신-EDTA를 사용하여 80 % -90 % 합류 할 때 5-7 일마다 세포를 통과시킵니다. 이 프로토콜에 설명된 후속 실험을 위해 계대 3-5 사이에 세포를 사용한다. 모든 격리 단계의 개략적인 프레젠테이션은 그림 1에 나와 있습니다.
    참고 : 일반적으로 트립스 - EDTA 효능은 공급 업체마다 다를 수 있으므로 세포에 대한 독성 영향을 피하기 위해 트립신화 시간을 최소화하십시오.

2. 유세포 분석을 이용한 면역표현형에 의한 Ad-MSC의 특성화

1. 계대 3에서, 트립신-EDTA를 사용하여 세포를 분할한다. PBS로 2회 세척한 다음, 혈구분석기로 세포를 계수한다.
2. 100,000개의 세포를 암흑에서 4°C에서 20분 동안 인큐베이션하고, 마우스 항-래트 CD90 또는 CD105(중간엽 마커) 또는 CD34(조혈 마커) 플루오레세인-이소티오시아네이트(FITC)로 표지된 모노클로날 항체와 함께 인큐베이션한다.
3. 세포를 세척하고 500 μL의 FACS 완충액에 현탁시킨다. 유세포 분석기로 분석²⁵.

3. 분리된 Ad-MSC를 다양한 중간엽 혈통으로 분화 가능성 평가

1. 아디포제닉 분화
   1. 세포를 완전한 배지 (단계 1.9.에 기재된 바와 같이)에 재현탁시킨 다음, 세포를²⁴ -웰 조직 배양 플레이트에서 3.7 x 10 4 세포/웰의 밀도로 배양한다. 5%_CO2의 가습된 분위기 하에서 37°C에서 인큐베이션한다. 다음으로, 세포가 거의 100 % 합류에 도달 할 때까지 3 일마다 배지를 교체하십시오.이 플루언시는 보통 3 일이 걸립니다.
   2. 세포가 원하는 합류점에 도달하면, 증식 배지를 지방생성을 유도하기 위해 아디포제닉 분화 배지(10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 0.25 μg/mL 암포테리신 B 및 2 mM L-글루타민과 1x 아디포제닉 보충제로 구성된 LG-DMEM 배지로 구성됨)로 교체하여 지방발생을 유도한다. 그런 다음 3 일마다 미디어를 교체하십시오 (0.5 mL / 웰). 지질 액포를 방해하지 않도록 매체 교체를 부드럽게 수행하도록 주의하십시오.
   3. 21일 후, 지질 액포 외관의 현미경 검사 및 Oil Red 염색에 의해 아디포겐 분화를 평가하였다.
   4. 오일 레드 염색 30 mg을 이소프로판올 10 mL에 용해시켜 오일 레드 원액을 준비하고, 실온에서 적어도 20분 동안 유지한다. 그 후, 원액 3부를 이중 증류수 2부(_ddH2O)와 혼합하여 작업액을 준비하고, 잘 섞은 다음, 상온에서 10분간 유지한 다음, 여과지로 여과한다.
   5. 아디포제닉 분화를 문서화하려면 세포를 PBS로 2 번 세척 한 다음 중성 완충 포르말린 10 % (0.75 ml / 웰)를 사용하여 15 분 동안 고정시킵니다. 그 후, 세포를 1 mL/웰을 사용하여 PBS로 2회 세척하고 매번 5분 동안 세포를 인큐베이션한다. Oil Red 작업 용액을 추가하기 전에 PBS를 완전히 흡인하는 것이 중요합니다.
   6. 마지막 세척 후, Oil Red 작업 용액을 세포에 첨가하고, 이를 37°C에서 60분 동안 인큐베이션한다. 그 후, 염색액을 제거하고 PBS로 세포를 2회 부드럽게 세척하였다. 염색된 지질 방울을 현미경으로 관찰한다.
2. 골형성 분화
   1. 시드 7.4 x 10³ 세포/웰 (0.5 mL 배지/웰)을 24-웰 플레이트에 첨가하고, 이들을 완전 배지 (단계 1.9에 기재된 바와 같이)에서 5%_CO2 의 가습된 분위기 하에 37°C에서 3일 동안 인큐베이션하여 거의 70% 컨플루언시에 도달한다.
   2. 10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 0.25 μg/mL 암포테리신 B 및 2 mM L-글루타민이 보충된 LG-DMEM 배지에서 골형성 보충제(키트와 함께 제공됨)로 세포를 유도하였다.
   3. 골형성 유도를 21일 동안 계속하고, 분화 배지를 3일마다 변경한다.
   4. 9 mL의 ddH2O에 Alizarin Red S 염색 200 mg을 용해시킨 다음 수산화암모늄 및 HCl을 사용하여 pH를 4.1-4.3으로 조정하여 Alizarin Red S 염색의 작업 용액을 준비하십시오. 다음으로, 부피를_ddH2O로 10 mL로 구성한다. 이어서, 여과지를 사용하여 여과함으로써 침전물을 제거한다.
   5. 세포를 PBS로 2회 세척한 다음, 10% 완충된 포르말린(0.75mL/웰)을 사용하여 15분 동안 고정시킨다. 그 후, PBS (1 mL/웰)를 사용하여 세포를 2회 세척하였다. 매번, 세포를 5분 동안 인큐베이션한다.
   6. 고정된 세포를 제조된 2% Alizarin-Red S 용액과 함께 37°C 인큐베이터에서 30분 동안 인큐베이션한다.
   7. 그 후, 염색액을 제거하고, 세포를 ddH2O로₂회 세척하고, PBS로 1회 세척한 다음, 염색된 칼슘이 풍부한 세포외 기질을 관찰하여 현미경으로 골형성 분화를 평가하였다.
3. 콘드롬성 분화
   1. 시드 7.4 x 10 3 세포/웰 (0.5 mL 배지/웰)을 24-웰 플레이트에서³ 일 동안 완전 배지 (단계 1.9에 기재된 바와 같이)에서 5%_CO2 의 가습된 분위기에서 37°C에서 인큐베이션하여 거의 70% 컨플루언시에 도달한다.
   2. 원하는 컨플루언시에 도달하면, 인슐린-트랜스페린 셀레늄(ITS), 연골 생성 보충제(키트와 함께 제공), 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 0.25 μg/mL 암포테리신 B 및 2 mM L-글루타민 21을 함유하는 무혈청 DMEM/^F12로 세포의 연골 생성 분화를 유도한다.
   3. 세포를 21일 동안 연골 생성 배지와 함께 인큐베이션하고, 3일마다 연골 분화 배지를 변화시킨다.
   4. 다음과 같이 Alcian Blue 8GX 염색의 작업 용액을 준비하십시오 : 먼저, ddH2O의 97 mL에 빙초산 3 mL를 첨가하여_ddH2O중의 3 % 빙초산 용액을 제조하였다. 그 후, 3% 빙산 용액 100 mL에 0.1 g을 혼합하여 Alcian Blue 8GX 염색의 작업 용액을 제조하고, 여과지를 이용하여 여과하여 침전물을 제거하였다.
   5. 세포를 PBS로 2회 세척한 다음, 10% 완충된 포르말린(0.75mL/웰)을 사용하여 15분 동안 고정시킨다. 그 후, PBS (1 mL/웰)를 사용하여 세포를 2회 세척하였다. 매번, 세포를 5분 동안 인큐베이션한다.
   6. 다음 단계는 제조된 0.1% Alcian Blue 8GX 염색된 세포를 37°C에서 60분 동안 3% 빙초산에서 배양하는 것이다. 염색된 세포를 ddH2O로₂회 세척하고 PBS로 1회 세척한 다음, 염색된 황산화된 프로테오글리칸을 현미경으로 관찰하였다.

4. Ad-MSC를 IPC로 차별화

1. 통로 3에서, 트립신-EDTA를 사용하여 Ad-MSC를 분할한다. 먼저, 배지를 제거한 다음, 배양 플라스크에 여전히 부착되어 있는 동안 세포를 PBS 5 mL로 세척한다. 다음으로, 5 mL의 트립신-EDTA를 75^cm2 플라스크에 첨가하고, 3-10분 동안 37°C에서 인큐베이션한다.
   참고 : 초기 계대, 보통 P3-P5 사이에서 세포를 유도하려고 노력하십시오.늦은 계대는 세포의 특성과 분화 능력에 악영향을 미치기 때문에^17,24.
2. 그 후, 세포가 분리되어 있고 단일 세포 현탁액인지 검사하십시오. 트립신 작용을 억제하기 위해 5 mL의 완전한 DMEM/F12 배지를 플라스크에 첨가하십시오. 세포 현탁액을 수집하여 15mL 튜브로 옮긴 다음 5mL의 완전한 DMEM/F12 배지를 튜브에 추가합니다.
3. 세포를 300 x g에서 2분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화한다.
4. 세포를 PBS로 한번 세척하고, 다시 300 x g에서 2분 동안 원심분리한 다음, 세포 펠릿을 3-5 mL의 완전한 DMEM/F12 배지에 재현탁시켰다.
5. 트리판 블루 배제 염료 및 혈구측정기를 사용하여 세포를 계수한다.
6. 이어서, 세포를 6-웰 플레이트 (1 x 10 6 세포/플레이트) 및 12-웰 플레이트 (GSIS 분석용; 1 x 10⁶ 세포/플레이트)에 시드하고, 3일 동안 완전 배지 (단계 1.9에 기재된 바와 같이)에서 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하여 거의 90% 컨플루언시에 도달한다.
7. 유도 당일, 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척한 다음, 사전 유도 배지(10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 0.25 μg/mL 암포테리신 B, 2 mM L-글루타민, 10 mM 니코틴아미드[NA] 및 1mM β-머캅토에탄올[β-ME]로 보충된 DMEM/F12)에 의해 세포를 미리 유도하였다.
8. 2.5% FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 0.25 μg/mL 암포테리신 B, 2 mM L-글루타민, 10 mM NA 및 1mM β-메르캅토에탄올로 보충된 고포도당 DMEM(HG-DMEM, 4.5g/L 글루코스)을 사용하여 세포를 1일 동안 추가로 유도하였다. 이 단계의 끝에서 세포 펠릿을 수집합니다 (이 프로토콜에서 지정된 D3 세포).
9. 세포를 2.5% FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 0.25 μg/mL 암포테리신 B, 2 mM L-글루타민, 10 mM NA, 1mM β-메르캅토에탄올 및 10 nM 엑센딘-4로 보충된 HG-DMEM으로 구성된 최종 분화 유도 배지에서 추가로 7일 동안 인큐베이션한다.
10. 지정된 기간의 끝에서, 세포 펠릿 (이 프로토콜에서 Final로 명명됨)을 수집하고, 이 프로토콜에서 하기와 같이 DTZ 염색 및 GSIS 검정에 의해 세포의 성공적인 분화를 평가한다.
11. 아래 단계 5 및 6에 따라 생성된 IPC를 평가합니다.

5. 디티존 염색

1. 다음과 같이 디티존(DTZ) 얼룩 원액을 준비한다: 25 mg의 DTZ를 2.5 mL의 디메틸설폭사이드(DMSO)에 완전히 용해시키고, 분취량으로 분할하고, 사용할 때까지 어둠 속에서 -20°C에서 보관한다.
2. 염색을 위해, 원액을 완전한 배지 (5% FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 0.25 μg/mL 암포테리신 B 및 2 mM L-글루타민으로 보충된 HG-DMEM)로 희석하여 작업 용액을 1:100 (부피/부피)로 준비한다. 이어서, 작업 용액을 0.2 μm 시린지 필터를 통해 여과한다.
3. 다음으로, 지정된 DTZ 염색을 위해 6-웰 플레이트에서 배양 세포를 배양하고, 배양 배지를 흡인한 후, 세포를 PBS로 1회 세척한 다음, DTZ 작업 용액 2 mL를 각 웰에 첨가한다. CO2 인큐베이터에서 37°C에서 적어도₂ 시간 동안 인큐베이션한다.
4. 세포를 PBS로 2회 조심스럽게 세척한다. 마지막 세척 후, PBS 2 mL를 각 웰에 첨가한다. 그런 다음 진홍색 적색 염색 된 IPC를 거꾸로 된 현미경으로 관찰하십시오. 완전한 성장 배지 (10% FBS - DMEM/F12)에서 초기에 배양된 유도되지 않은 Ad-MSC를 대조군으로 사용하십시오.

6. RT-qPCR에 의한 β세포 마커의 유전자 발현

1. RNA 추출
   1. 분화 후, 세포 펠릿을 수집하고, 이를 사용할 때까지 -80°C에서 보관한다. 각 세포 펠릿(풀링된 6-웰 플레이트 1개의 6개의 웰로부터 유래)을 1.5mL 뉴클레아제가 없는 튜브에 구아니듐 티오시아네이트 RNA 추출 시약 1mL에 현탁시키고, 피펫팅을 여러 번 위아래로 매달린다. 용해된 샘플을 실온에서 5분 동안 인큐베이션하여 핵단백질 복합체의 완전한 해리를 허용한다.
   2. RNA 추출 시약 1mL당 클로로포름 200μL를 첨가하고, 튜브를 단단히 뚜껑을 닫아 15초 동안 손으로 격렬하게 흔들어 줍니다. 다음에, 실온에서 3분 동안 인큐베이션한다.
   3. 샘플을 4°C에서 15분 동안 13,800 x g 에서 원심분리한다. 이것은 낮은 클로로포름 상, 인터 페이즈 및 무색 상부 수성 상으로의 혼합물 분리로 이어질 것이며, RNA는 수성상에 남아있다.
   4. 상부 수성상을 새 튜브에 넣고 조심스럽게 인터페이즈를 만지지 않도록하십시오.
   5. 600 μL의 100% 이소프로판올을 수성상(1:1 부피)에 첨가한 다음, 샘플을 25회 역전시켜 완전히 혼합하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다.
   6. 샘플을 4°C에서 30분 동안 18,800 x g 에서 원심분리한다. 침전된 RNA는 튜브 측에 작은 겔형 펠렛을 형성한다.
   7. 상청액을 제거하고 펠렛을 1 mL의 80% 빙냉 에탄올로 세척하였다. 에탄올을 첨가한 후, RNA 펠릿의 다중 피펫팅을 10초 동안 천천히 수행한다.
   8. 샘플을 4°C에서 9,600 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 버리고 RNA 펠릿을 5-10분 동안 공기 건조되도록 방치한다.
   9. 건조 후, RNA 펠릿을 25-100 μL의 RNase-free 물(초기 펠릿 크기에 따라)에 용해시키고, 1.5 mL 뉴클레아제가 없는 튜브에서 완전히 가용화될 때까지 여러 번 위아래로 피펫팅한다. RNA 펠릿의 과도한 건조를 피하십시오.
      참고 : 일반적으로 펠릿은 건조 될 때 투명 해집니다. 그러나 일단 맑아지면 펠렛의 과도한 건조를 피하기 위해 즉시 재현탁하십시오.
   10. 뉴클레아제가 없는 물을 블랭크로 사용하여 260nm 및 280nm에서 광학 밀도(OD)를 결정함으로써 RNA를 정량화합니다.
   11. 샘플의 OD260/OD280 = 1.8-2.0인지 확인합니다.
2. cDNA 합성
   1. cDNA 합성 키트를 사용하여 분리된 총 RNA로부터 cDNA를 합성한다.
   2. 제조업체의 지시에 따라 cDNA 합성 반응을 수행하십시오. 200 μL PCR 튜브에서, 0.5 μg의 총 RNA를 함유하는 부피의 RNA 용액을 표 1에 나타낸 반응 마스터 믹스에 첨가한다.
   3. RNA를 마스터 믹스에 첨가한 후, 한 사이클 동안 30분 동안 50°C의 사이클링 프로그램을 통해 혼합물을 입력하고, 이어서 열 사이클러를 사용하여 2분 동안 95°C의 불활성화 사이클을 진행하였다.
   4. 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 cDNA를 2 ng/μL의 최종 농도로 희석하십시오. 후속 RT-qPCR을 위해 -20°C에서 보관하십시오.
3. SYBR 그린 마스터 믹스를 사용한 RT-qPCR
   1. 표 2에 나타낸 반응 믹스에 따라 cDNA 주형을 이용하여 각 표적 유전자에 대한 RT-qPCR 반응을 수행한다. 모든 조치를 삼중으로 수행하십시오.
   2. 사용된 프라이머 세트는 표 3에 나타내었다. 얼음 위에서 모든 RT-qPCR 절차를 수행하십시오.
   3. 기본 프로그램 설정에서 실시간 PCR 기계를 사용하여 RT-qPCR 반응을 수행하십시오. 열 사이클링 조건에는 10분 동안 95°C의 초기 변성이 포함되었고, 그 후 변성 45사이클(95°C, 15초) 및 어닐링/연장(60°C, 1분)이 결합되었습니다.
   4. _Ct값을 결정하고 ^2-ΔΔCt에 따라 발현 수준을 검출하고, β-액틴을 내부 대조군으로 사용한다.

표 1: cDNA 합성 마스터 믹스 부피.

표 2: RT-qPCR 반응 혼합물.

표 3: 정방향 및 역방향 프라이머 서열.

7. 포도당 자극 인슐린 분비

1. 크렙 링거 중탄산염(KRB) 완충액의 제조
   1. 글루코스 자극 인슐린 분비(GSIS) 분석을 위해 2mM 글루코스(저글루코스) 및 20mM 글루코스(고글루코스) 농도의 크렙스 링거 중탄산염(KRB) 완충용액을 준비합니다. KRB 완충액 제제에 사용되는 성분은 표 4에 제시되어 있다.
   2. 1 N HCl을 사용하여 완충제의 pH를 약 7.25-7.35로 조정한다 (즉, 여과 중에 상승할 수 있기 때문에 원하는 pH 7.4보다 0.1-0.2 단위 낮음).
   3. 소 혈청 알부민 (BSA)을 0.1 % (중량 / 부피)의 농도로 신선하게 첨가하십시오.
   4. 그 후 포도당을 첨가하여 (KRB 50 mL에 대해 18 mg을 2 mM 저글루코스 KRB 완충액을 제조하고, KRB 50 mL에 대해 180 mg을 제조하여 20 mM 고글루코스 KRB 완충액을 제조하였다).
   5. 제조된 LG 및 HG KRB 버퍼를 0.2 μm 시린지 필터를 통해 여과하여 멸균하여 GSIS 분석을 준비한다.
2. GSIS 분석
   1. 처음에는 1 x 10⁵ 세포/웰을 12-웰 세포 배양 플레이트에 시드하고 정확히 동일한 분화 유도 프로토콜을 사용하여 이러한 세포를 유도한다.
   2. 유도 프로토콜의 끝에서, 생성된 IPCs를 PBS로 2회 (플레이트 내) 부드럽게 세척하고, LG-KRB로 한 번 세척한다.
   3. 그 후, IPC를 300μL의 LG-KRB/웰로 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 이 버퍼를 버린다.
   4. 다음에, IPCs를 추가 1 시간 동안 300 μL의 2 mM (LG) 또는 20 mM (HG) KRB 완충액과 함께 인큐베이션한다. 인큐베이션 기간이 끝날 때, 상청액을 수집하고 상용 ELISA 키트를 사용하여 후속 분비된 인슐린 분석을 위해 -80°C에서 저장하고 제조자의 지시에 따른다.
      참고: GSIS 분석을 수행할 때 PBS 및 KRB 버퍼를 흡인하거나 첨가하는 동안 가능한 한 부드럽게 하십시오.

표 4: KRB 완충액 제조에 사용되는 성분.

8. 통계 분석

1. 모든 데이터를 평균± 평균의 표준 오차(SEM)로 표현합니다. 모든 비교는 분산 단방향 분석 (ANOVA)과 통계 소프트웨어를 사용한 Tukey의 사후 테스트를 사용하여 수행되었습니다. p-값 ** p ≤ 0.01 및 *p ≤ 0.05를 사용한 결과는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

Ad-MSC의 격리 및 특성화
도 2에 나타난 바와 같이, 지방 조직으로부터 분리된 세포는 단리의 다음날부터 시작하여 둥근 섬유아세포와 같은 세포의 이종 집단을 나타내었다(도 2A). 분리 4일 후, 섬유아세포는 수와 크기가 증가하기 시작했고, 계대 1에 의해 동질적인 집단으로 성장하였다(도 2B,C). 이들 세포는 계대 3까지 나타난 바와 같이 플라스틱 부착성, 섬유아세포-유사 세포로서 계속 성장하여, MSC 특성의 첫 번째 기준을 충족시켰다(도 2D). 이러한 Ad-MSC는 매우 우수한 배양 특성을 보였으며, 이 프로토콜은 Ad-MSC를 부고환 지방 패드로부터 분리하는 적절하고 쉽고 비교적 빠른 프로토콜인 것으로 밝혀졌다.

다음 단계는 격리된 Ad-MSC를 특성화하는 것이었습니다. ISCT에 따르면, MSCs는 플라스틱 부착, 조혈 마커가 부족한 중간엽 CD의 발현 및 지방세포, 골세포 및 연골세포로 분화 할 수있는 능력의 세 가지 기준을 따라야합니다. 도 3A에 나타난 바와 같이, 유세포 분석 결과, 이들 세포의 대부분은 CD90 및 CD105(각각 76.4% 및 73.6%)를 발현하는 것으로 나타났다. 한편, 그들은 CD34 (0.1 %)에 대해 거의 음성이었다.

더욱이, 이들 세포의 분화를 유도할 때, 그들은 지방세포, 골세포, 연골세포로 분화하는 능력을 보여주었다. 도 3B (상부 패널)에 나타난 바와 같이, 지방세포는 대조군 비유도 세포와 비교했을 때 지질 액포의 오일 레드 염색을 나타내었다. 골세포는 대조군 세포와 비교했을 때 특징적인 Alizarin Red 염색(도 3B, 중간 패널)을 나타내었다. 마지막으로, 연골세포-유도 세포는 대조군 비유도 세포와 비교했을 때 세포외 기질의 청색 염색을 보였다(도 3B, 하단 패널).

이들 데이터는 지방 조직으로부터 분리된 세포가 양호한 배양 특성을 나타낼 뿐만 아니라 MSCs에 대해 제안된 모든 기준을 나타낸다는 것을 명백히 나타낸다.

Ad-MSC를 인슐린 생산 세포 (IPCs)로 분화
도 4A에 도시된 바와 같이, 우리는 Ad-MSC를 IPC로 분화시키기 위해 비교적 간단하고 짧은 프로토콜을 사용하였다. 분화의 유도 후, 유도된 IPCs를 여러 가지 방법으로 평가하였다. 유도된 세포는 현저한 형태학적 변화를 보였다. 도 4B(상부 패널)에 나타낸 바와 같이, 유도된 세포는 Ad-MSCs의 정상적인 섬유아세포-유사 형태학과 비교했을 때 둥글고, 클러스터-유사 형태를 나타내었다. 흥미롭게도, 디티존으로 염색시, 이들 클러스터는 진홍색 염색을 나타내었으며, 이는 β-세포 염색의 아연 과립의 특징이다(도 4B, 하부 패널).

그 후, 생성된 IPCs를 유도되지 않은 대조군 세포와 비교했을 때 특이적 β세포 마커의 발현에 대해 유전적으로 평가하였다. 도 5A-E에 나타난 바와 같이, 유도된 세포는 다양한 특이적 β-세포 마커를 발현할 수 있었고, 이는 IPCs를 생성하는 그들의 능력을 나타낸다. FOXA2-a 결정적인 내배엽 마커 (도 5A에 나타난 바와 같이)-에 관해서는, 대조군과 비교했을 때 D3 분화에서 고도로 발현되었고, 최종 분화된 세포에서 대조군의 단지 10배까지 감소한 후 거의 30배에 도달하였다 (D3: 28.37 ± 0.88; 최종: 12.10 ± 1.27; p < 0.05). Pdx-1 (이는 β 세포의 초기 마커로 간주됨)에 관해서는, D3 및 최종 분화 세포 둘 다에서 상승하였고, 대조군 비유도 세포와 비교했을 때 거의 20배에 도달하였다 (D3: 22.39 ± 5.14; 최종: 17.13 ± 0.342; p < 0.05; 도 5B). 다른 β-세포 마커, 즉 NKX6.1, MafA 및 인슐린-1 (Ins1)과 관련하여, 이들은 모두 D3로부터 시작하여 최종 분화까지 상승을 보였고, 대조군과 비교했을 때 각각 거의 8배, 12배 및 300배에 달했다 (NKX6.1: D3: 1.94 ± 0.86, 최종: 7.97 ± 1.34, p<0.05; MafA : D3 : 6.59 ± 0.4, 최종 : 11.54 ± 2.40, p < 0.05; 및 Ins1 : D3 : 27.29 ± 20.27, 최종 : 318.20 ± 76.09, p < 0.05) (그림 5C-E). 이는 이들 Ad-MSCs가 β-세포 마커를 발현하는 IPCs로 분화할 수 있음을 나타낸다.

마지막으로, 이들 세포는 포도당의 농도 증가로 도전받을 때 인슐린 분비에 대해 평가되었다. 도 5F에 나타난 바와 같이, 20 mM 글루코스로 도전했을 때 유도된 IPCs의 상청액에서 분비되는 인슐린은 세포가 2 mM 글루코스로 도전받았을 때 분비되는 인슐린보다 유의하게 높았다 (HG: 390 pg/mL ± 33 pg/mL; LG: 234 pg/mL ± 32 pg/mL, p< 0.05; 그림 5F)

이 데이터는 사용 된 프로토콜이 Ad-MSC를 IPC로 분화시키는 데 도움이된다는 것을 확인했으며, 이는 유전적으로 기능적으로 확인되었습니다.

그림 1: Ad-MSC의 격리 및 특성화에 사용되는 프로토콜의 단계에 대한 개략적인 프레젠테이션. Biorender.com 에 의해 생성됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 2: 분리된 Ad-MSCs를 보여주는 현미경 사진. (A) 플라스틱 부착성, 섬유아세포-유사 형태를 나타내는 분리된 세포는 단리 다음 날 나타나기 시작한다. (B) 시간이 지남에 따라, 이들 부착성 Ad-MSCs(섬유아세포-유사 형태학을 갖는)는 증식하고 그 수가 증가하여, (C) P1 및 (D) P3에서 보다 균질한 섬유아세포-유사 집단에 도달한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 3: Ad-MSCs의 특성화. (A) Ad-MSCs의 유세포 분석 결과, 이들 세포는 CD34(상부 패널)에 대해 거의 음성인 반면, 대부분의 세포는 CD90 및 CD105(하부 패널)를 발현한다. Ad-MSCs는 세 개의 중간엽 혈통, 즉 (B) 지방세포 (오일 액적이 오일 레드로 염색되는 곳), (C) 알리자린 레드로 염색된 골세포, 및 (D) 알시안 블루에 의해 염색된 연골세포(대조군 비유도 세포와 비교했을 때)로 분화될 수 있다. 대조군: 유도되지 않은 세포, Diff: 분화된 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 4: Ad-MSCs를 IPCs로의 분화. (A) IPCs로의 분화 유도 동안 각 단계에서 세포에 대한 현미경 사진과 함께 Ad-MSCs로부터 IPCs를 생성하는 데 사용되는 분화 프로토콜의 개략적인 제시. 분화시, 세포는 섬유아세포 형태를 잃고 클러스터를 형성하는 응집하는 경향이 있으며, 이는 현탁액 배지에서 분리되고 성장하는 경향이 있다. (B) 현미경 사진은 유도되지 않은 Ad-MSCs의 섬유아세포-유사 형태학(왼쪽 패널), 염색되지 않은(상부 패널) 또는 DTZ 염색(하부 패널)과 비교했을 때 둥근 군집 형태학적 변화(오른쪽 패널)를 보여주는 상기 프로토콜에 의해 생성된 대조군 Ad-MSC 및 IPC를 보여준다.
대조군: 비-유도된 세포; IPCs: 인슐린 생산 세포; NA: 니코틴아미드; β-ME: 베타 메르캅토에탄올; D3: IPCs로의 분화의 유도 동안 제3일에 유도된 세포; D10: 유도 프로토콜의 끝에서 최종 분화된 IPCs; Ex-4: 엑센딘-4. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 5: IPCs에 대한 β-세포 마커 및 GSIS의 상대적 발현 수준. (A) FOXA2, (B) Pdx-1, (C) NKX6.1, (D) MafA, 및 (E) Ins-1에 대한 qRT-PCR에 의한 상대적 발현 수준. (f) 생성된 IPCs에 도전할 때 상청액에서 분비된 인슐린의 수준은 2mM 글루코스(LG) 또는 20mM 글루코스(HG)로 생성된다. 대조군: 유도되지 않은 Ad-MSCs, Day-3: D3에서 수집된 분화된 세포; 최종: 최종 차별화된 IPC; LG: 저글루코스; HG : 높은 포도당. a: 평균은 p < 0.05에서 대조군과 상이하고; b: 평균은 p에서 3일-3과 0.05< 상이하고; *: LG의 평균은 p < 0.05에서 HG와 다릅니다. 비교는 독립적인 샘플 t-검정을 사용하여 수행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

모든 공동 저자는이 작품과 관련된 이해 상충이 없다고 선언합니다.