지방 조직 유래 중간엽 줄기 세포 (Ad-MSCs)는 인슐린 생산 세포 (IPCs)로 분화되는 MSCs의 잠재적 인 원천이 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 래트 부고환 Ad-MSCs의 분리 및 특성화를위한 상세한 단계를 제공하고, 동일한 래트 Ad-MSCs로부터의 IPC의 생성을위한 간단하고 짧은 프로토콜을 제공한다.
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이 논문에서
요약
초록
중간엽 줄기 세포 (MSCs)-특히 지방 조직 (Ad-MSCs)에서 분리 된 것들 -은 윤리적 인 우려를 제기하지 않는 재생 가능하고 풍부한 줄기 세포 공급원으로 특별한 주목을 받았습니다. 그러나 Ad-MSC를 분리하는 현재의 방법은 표준화되지 않았으며 특수 장비가 필요한 복잡한 프로토콜을 사용합니다. 우리는 간단하고 재현 가능한 방법을 사용하여 Sprague-Dawley 쥐의 부고환 지방으로부터 Ad-MSC를 분리했습니다. 분리된 Ad-MSCs는 부착성 세포가 섬유아세포 형태를 나타내기 때문에 보통 분리 후 3일 이내에 나타난다. 이러한 세포는 격리 후 1 주 이내에 80 %의 합류율에 도달합니다. 그 후, 계대 3-5 (P3-5)에서, CD90, CD73 및 CD105와 같은 특징적인 MSC 클러스터의 분화 표면 마커에 대한 면역표현형에 의해 단리된 Ad-MSCs에 대한 완전한 특성화를 수행하였고, 이들 세포의 분화를 유도할 뿐만 아니라 골형성, 지방형성, 및 연골형성 혈통을 아래로 유도하였다. 이것은 차례로 단리된 세포의 다분화능을 의미한다. 또한, 우리는 고글루코스 둘베코의 변형된 이글 배지 (HG-DMEM), β-메르캅토에탄올, 니코틴아미드 및 엑센딘-4를 통합함으로써 간단하고 비교적 짧은 프로토콜을 통해 인슐린 생산 세포 (IPCs) 계통을 향한 단리된 Ad-MSCs의 분화를 유도하였다. IPCs 분화는 먼저 생성된 IPCs에 대한 디티존 염색뿐만 아니라 MafA, NKX6.1, Pdx-1 및 Ins1과 같은 특이적 β세포 마커의 발현 수준을 측정함으로써 유전적으로 평가되었다. 둘째로, 평가는 또한 글루코스-자극된 인슐린 분비 (GSIS) 검정에 의해 기능적으로 수행되었다. 결론적으로, Ad-MSC는 모든 MSC 특성화 기준을 제시하여 쉽게 분리 될 수 있으며 당뇨병 연구를위한 실험실에서 풍부하고 재생 가능한 IPC 소스를 실제로 제공 할 수 있습니다.
서론
중간엽 기질 세포로도 알려진 중간엽 줄기 세포 (MSCs)는 재생 의학 1,2에 가장 널리 사용되는 세포 유형 중 하나입니다. 이들은 성체줄기세포로 분류되며 다계보 분화 가능성과 자가재생능력을 특징으로한다3. 중간엽 줄기세포는 지방 조직, 골수, 말초 혈액, 탯줄 조직 및 혈액, 모낭 및 치아 4,5를 포함하는 다양한 공급원으로부터 단리되고 수득될 수 있다.
지방 조직으로부터 줄기 세포를 분리하는 것은 쉬운 접근, 시험관 내에서의 빠른 팽창 및 높은 수율6으로 인해 매력적이고 유망한 것으로 간주됩니다. 지방조직 유래 중간엽 줄기세포(Ad-MSCs)는 인간, 소, 생쥐, 래트 및 보다 최근에는 염소7과 같은 상이한 종으로부터 분리될 수 있다. Ad-MSC는 이제 조직 공학 및 유전자 / 세포 요법의 잠재적 인 후보자이며 연조직 손상 또는 결함 ....
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프로토콜
모든 실험은 승인 된 지침에 따라 수행되었으며, 모든 절차는 이집트 카이로, 이집트의 영국 대학 (BUE)의 약학 학부 윤리위원회의 승인을 받았습니다. Ad-MSC 격리 프로토콜은 Lopez 및 Spencer에서 채택되었으며 수정15가 적용되었습니다.
1. 쥐 부고환 지방 패드에서 Ad-MSC의 분리
- 생후 1 개월 이하의 체중 250-300g의 수컷 Sprague-Dawley 쥐를 사용하십시오 (격리 당 두 마리). 동물을 마취 한 다음 자궁 경부 탈구로 안락사시킵니다. 안락사된 동물에게 70% 에탄올을 뿌린다. 복부의 아래 부분에서 피부와 근육을 절제한 다음 두 고환을 꺼내 부고환 지방 패드를 노출시킵니다.
- 부고환 지방 패드를 부드럽게 자르고 혈관을 자르지 않도록주의하십시오.
- 부고환을 둘러싼 지방 조직을 분리한 다음, 인산완충식염수(PBS)를 함유하는 페트리 접시에 넣는다.
- 생물 안전 캐비닛에서이 뚱뚱한 패드를 포셉과 메스를 사용하여 작은 조각으로 자릅니다. 이들 절단된 지방 조직 조각을 10 mL의 멸균 PBS를 함유하는 50 mL 원심분리 튜브 내로 옮긴다.
- 다진 지방 조직을 ....
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결과
Ad-MSC의 격리 및 특성화
도 2에 나타난 바와 같이, 지방 조직으로부터 분리된 세포는 단리의 다음날부터 시작하여 둥근 섬유아세포와 같은 세포의 이종 집단을 나타내었다(도 2A). 분리 4일 후, 섬유아세포는 수와 크기가 증가하기 시작했고, 계대 1에 의해 동질적인 집단으로 성장하였다(도 2B,C). 이들 세포는 계대 3까지 나타난 바와 같이 플라스틱 부착성, 섬유아세포-유사 세포로서 계속 성장하여, MSC 특성의 첫 번째 기준을 충족시켰다(도 2D). 이러한 Ad-MSC는 매우 우수한 배양 특성을 보였으며, 이 프로토콜은 Ad-MSC를 부고환 지방 패드로부터 분리하는 적절하고 쉽고 비교적 빠른 프로토콜인 것으로 밝혀졌다.
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토론
이 프로토콜에서, 우리는 쥐 부고환 지방으로부터 Ad-MSCs의 분리 및 이러한 Ad-MSCs를 IPCs로 분화시키는 상세한 프로토콜을 제시 할 수 있었다. 사실, 쥐 epidydimal 지방은 Ad-MSCs를 얻기 위해 지방 조직의 쉽게 얻을 수있는 원천이며 수집 또는15,26,27 처리를 위해 특별한 장비가 필요하지 않습니다. 단리된 Ad-MSCs는 우수한 배양 확장을 나타냈고, MSCs로서 정의되는 모든 기준을 나타내었다. 사용된 프로토콜은 이전에 약간의 변형(15)으로 설명되었다. 이 프로토콜은 효과적이고 재현 가능한 것으로 입증되었습니다. 세포는 분리 후 1일째부터 섬유아세포와 유사한 형태를 보였으며, 동질적인 집단에 도달할 때까지 계속 확장되었다. 흥미롭게도, 우리는 쥐 조직에 필적할만한 성공을 거둔 리포 흡인.......
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공개 사항
모든 공동 저자는이 작품과 관련된 이해 상충이 없다고 선언합니다.
감사의 글
우리는 쥐의 해부를 돕는 Dr. Rawda Samir Mohamed, MSc, Veterinarian Specialist, 약학 학부, 이집트 영국 대학 (BUE)을 인정합니다.
우리는 또한이 원고의 비디오 제작 및 편집을위한 이집트의 영국 대학 (BUE)의 매스 커뮤니케이션 학부의 노력을 인정하고 감사하고 싶습니다.
우리는 미스 Fatma Masoud, 석사, 영어의 보조 강사, 이집트의 영국 대학 (BUE) 원고의 개정 및 영어 교정에 감사드립니다.
이 연구는 약물 연구 개발 센터 (CDRD), 약학 학부, 이집트 영국 대학 (BUE), 카이로, 이집트에서 부분적으로 자금을 지원했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 알부민, 소 혈청 분획 V | MP Biomedicals | ||
| Alcian Blue 8GX | Sigma-Aldrich, 미국 | A3157 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich, 미국 | A5533 | |
| 수산화암모늄 | Fisher Scientific, 독일 | ||
| Rat CD90에 대한 항체, FITC | 줄기세포 기술 | 60024FI | |
| 소 혈청 알부민 | Sigma Aldrich | A3912 | |
| 염화칼슘 | Fisher Scientific, 독일 | ||
| CD105 단클론 항체, FITC | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, 미국 | MA1-19594 | |
| CD34 다클론 항체 | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, 미국 | PA5-85917 | |
| 클로로포름 | Fisher Scientific, 미국 | ||
| 콜라겐 분해 효소 유형 I, 분말 | Gibco, Thermo Fisher, 미국 | 17018029 | |
| D-Glucose 무수, 초순수 | Fisher Scientific, 독일 | G / 0450 / 53 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific, 독일 | BP231-100 | |
| 디티 존 염색 | Sigma-Aldrich, 미국 | D5130 | |
| DMEM - 고 포도당 4.5 g / L | Lonza, 스위스 | 12-604F | |
| DMEM - 저혈당 1 g/L | Lonza, 스위스 | 12-707F | |
| DMEM/F12 매체 | Lonza, 스위스 | BE12-719F | |
| DNAse/RNAse 자유수 | Gibco Thermo Fisher, USA | 10977-035 | |
| 에탄올 앱솔루트, 분자생물학 등급 | Sigma-Aldrich, Germany | 24103 | |
| Exendin-4 | Sigma-Aldrich, 독일 | E7144 | |
| 소 태아 혈청(FBS) | Gibco Thermo Fisher, 브라질 | 10270-106 | |
| 포름알데히드 37% | Fisher Scientific | ||
| 염산(HCl) | Fisher Scientific, 독일 | ||
| 이소프로판올, 분자 생물학 등급 | Fisher Scientific, 미국 | BP2618500 | |
| L-글루타민 | Gibco Thermo Fisher, 미국 | 25030-024 | |
| 염화마그네슘(무수) | Fisher Scientific, 독일 | ||
| 중간엽 줄기 세포 기능 식별 키트 | R& D systems Inc., MN, USA | SC006 | |
| 니코틴아미드 | 시그마-알드리치, 독일 | N0636 | |
| 오일 레드 스테인 | 시그마-알드리치, 미국 | O0625 | |
| 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 | Gibco Thermo Fisher, 미국 | 15240062 | |
| 인산염 완충 식염수, 1X, Ca/Mg 없음 | Lonza, 스위스 | BE17-516F | |
| 칼륨 염화물 | Fisher Scientific, 독일 | ||
| 쥐 인슐린 ELISA Kit | Cloud-Clone Corp., 미국 | CEA682Ra | |
| 중탄산나트륨 | Fisher Scientific, 독일 | ||
| 염화나트륨 | Fisher Scientific, 독일 | ||
| 산나트륨 이염기성(무수) | Fisher Scientific, 독일 | ||
| 나트륨 인산염 일염기성(무수) | Fisher Scientific, 독일 | ||
| SYBR Green Maxima | Thermo Scientific, 미국 | K0221 | |
| 주사기 필터, 0.2 미크론 | Corning, 미국 | 431224 | |
| TRIzol | Thermo Scientific, 미국 | 15596026 | |
| Trypan blue | Gibco Thermo Fisher, 미국 | 15250061 | |
| Trypsin-Versene-EDTA, 1X | Lonza, 스위스 | CC-5012 | |
| Verso cDNA 합성 키트 | Thermo Scientific, 미국 | AB-1453/A | |
| β-메르캅토에탄올 | Sigma-Aldrich, 독일 | M3148 |
참고문헌
- Hmadcha, A., Martin-Montalvo, A., Gauthier, B. R., Soria, B., Capilla-Gonzalez, V. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cancer therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 43(2020).
- Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H. Sources and therapeutic strategies of mesenchymal stem cells in regenerative medicine.
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