Langendorff 준비에서 신생아 뮤린 하트의 사용을위한 수정 된 기술

요약

본 프로토콜은 생체외 신생아 뮤린 심장의 대동맥 캐뉼레이션 및 역행 관류를 기술한다. 해부 현미경과 무딘 작은 게이지 바늘을 사용하는 두 사람 전략은 신뢰할 수있는 통조림을 허용합니다. 종방향 수축 장력의 정량화는 좌심실의 정점에 연결된 힘 변환기를 사용하여 달성된다.

초록

생체외 역행 관류 심장의 사용은 한 세기 전에 오스카 랑겐도르프에 의해 개발 된 이래로 허혈 재관류 조사의 초석이었습니다. 이 기술은 지난 25 년 동안 마우스에 적용되었지만,이 종에서의 사용은 성인 동물로 제한되었습니다. 신생아 뮤린 대동맥을 지속적으로 캐뉼레이트하는 성공적인 방법의 개발은 유전자 변형 가능하고 저렴한 종에서 심장 발달의 중요 기간 동안 고립 된 역행 용혈 심장에 대한 체계적인 연구를 가능하게합니다. Langendorff 제제의 수정은 허혈성 시간을 최소화하면서 신생아 뮤린 심장에서 재관류의 정식 및 확립을 가능하게합니다. 최적화를 위해서는 해부 현미경 및 변형된 상업적으로 이용가능한 바늘을 사용하여 신생아 마우스 대동맥의 성공적인 캐뉼레이션을 허용하기 위해 두 사람 기술이 필요합니다. 이 접근법의 사용은 3 분 이내에 역행 관류를 안정적으로 확립 할 것입니다. 신생아 마우스 심장의 취약성과 심실 공동 크기는 풍선을 사용하여 발생하는 심실 내 압력의 직접적인 측정을 방해하기 때문에 봉합사에 의해 좌심실의 정점에 연결된 힘 변환기를 사용하여 종방향 수축 장력을 정량화해야합니다. 이 방법을 통해 조사관은 격리 된 정수 흐름 역행 - 관류 된 신생아 뮤린 심장 준비를 성공적으로 확립하여 생체 외 방식으로 발달 심장 생물학을 연구 할 수 있습니다. 중요하게도, 이 모델은 신생아 심장에서 허혈-재관류에 대한 생리학적 및 약리학적 반응을 조사하는 강력한 도구가 될 것이다.

서론

생체 외 심장 제제는 한 세기 이상 생리, 병리 생리학 및 약리학 연구의 필수품이었습니다. 1860년대 엘리아스 시온(Elias Cion)의 연구에서 비롯된 오스카 랑겐도르프(Oskar Langendorff)는 역행 관류를 위해 분리된 개구리 모델을 채택하여 대동맥 뿌리에 압력을 가하여 산소화된 향수¹로 관상동맥 흐름을 제공했다. 그의 적응을 사용하여, Langendorff는 관상 동맥 순환과 기계적 기능 사이의 상관 관계를 입증 할 수있었습니다². 나중에 Langendorff 기법이라고 불리는 생체 외 역행 관류 된 심장은 생리 학적 조사의 초석으로 남아 있으며, 잠재적 인 혼란이없는 상태에서 고립 된 심장을 강력하게 연구하기 위해 단순성을 활용했습니다. Langendorff 준비는 심장이 배출 될 수 있도록 (소위 "일하는 심장"이라고 함)을 허용하고 향수가 재순환 할 수 있도록 추가로 수정되었습니다³. 그러나 관심의 주요 생리 학적 종점은 변하지 않았습니다. 이러한 종점에는 수축 기능, 전기 전도, 심장 대사 및 관상 동맥 저항의 측정^{이 포함됩니다 4}.

프로토콜

컬럼비아 대학 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인은 설명 된 모든 방법에 대해 획득되었습니다. 야생형 C57Bl/6 수컷 출생 후 10일째 마우스를 연구에 사용하였다.

1. 랑겐도르프 장치의 제조

1. 복잡성을 최소화하려면 일정한 흐름 또는 일정한 압력을 통해 Langendorff 장치 (재료 표 참조) 내에서 재순환되지 않는 산소화 방향제를 사용하십시오.
   1. 120 mmol/L의 NaCl, 4.7 mmol/L의 KCl, 1.2 mmol/L의 MgSO4, 1.2 mmol/L의_KH2PO4, 1.25 mmol/L의 CaCl2_, 25 mmol/L의 NaHCO3 및 11 mmol/L의 글루코스를 함유하는 크렙스-헨셀릿 완충액(KHB)을 사용하여 pH 7.4에서 글루코스를 사용하고(표 참조), Langendorff 장치 내에서_O2의 95% 및_CO2의 5%와 평형화시키고 37°C에서 유지한다.
2. 일정한 흐름 접근법의 경우, ~2.5 mL....

결과

P10 마우스는 인간 유아기^26,27에서 시점을 모델링하기 위해 사용되었다. 15개의 분리된 C57Bl/6 신생아 마우스 하트를 수확하고 성공적으로 캐뉼레이션하였다. 심장은 가온된 산소화된 KHB의 2.5 mL ^min-1의 연속 흐름으로 관류되었다. 글루코스 추출, 산소 소비, 젖산 생산, 심박수, 관류 압력 및 관상 동맥 저항성과 같은 생리학적 파라미터를 포함하는 대사 파라미터를 측정하였다. 표면 전극을 사용하여 연속 심전도를 기록하여 고유 속도와 리듬을 결정할 수있었습니다 (그림 2). 종축에서의 수축력은 Langendorff ²⁸에 의해 기술된 방법을 사용하여 결정되었다.

대사 평가는 관류의 적절성을 평가하기 위해 수행되었다. 산소 추출 퍼센트는 퍼퓨세이트.......

토론

본 연구는 고립 된 신생아 마우스 심장에서 성공적인 대동맥 통조림과 역행 관류를 설명합니다. 중요한 것은 연구자들이 젊은 뮤린 나이와 작은 심장 크기가 이전에 제시 한 장벽을 극복 할 수있게 해줍니다⁸. 설계가 복잡하지는 않지만 상당한 수준의 기술 기술이 필요합니다. 가장 기술적으로 능숙한 조사관조차도 필연적으로 도전 할 핵심 단계는 대동맥을 캐뉼레이션하고 캐뉼라를 제자리에 고정시키는 것입니다. 신생아 통조림의 어려움은 대동맥 내강의 작은 크기 때문만은 아닙니다. 오름차순 대동맥의 비교적 짧은 길이 (대동맥 판막과 오른쪽 쇄골 하부 이륙 사이의 대동맥 조직)는 조사관이 대동맥 캐뉼라를 정확하게 제어하도록 도전 할 수 있으며 팀원 간의 신중한 조정이 필요합니다. 이 지역 내에서 캐뉼라를 적절하게 배치하고 확보하지 못하면 준비를 망칠 수 있습니다. 예를 들어, 캐뉼라를 너무 깊게 진행하면 대동맥 판막이 손상되거나 심실 내 캐뉼레이션이 발생할 수 있습니다. 대동맥 아치 내에 캐뉼라를 너무 얕.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
설치류 Langendorff 장치	Radnoti	130102EZ
24G 카테터	BD	381511
26G 바늘 1mL 주사기 콤보	BD	309597
26G 강철 바늘	BD	305111
5-0 실크 봉합	Ethicon	S1173
바이오 앰프	ADInstruments	FE135
바이오 케이블	ADInstruments	MLA1515
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901-100G
순환 온수 목욕	Haake	DC10
곡선 홍채 가위	Medline	MDS10033Z
해부 현미경	Nikon	SMZ-2B
찾기 스프링 가위	Kent
Force Transducer	ADIntruments	MLT1030/D
포도	Sigma-Aldrich	G8270-100G
Heparin	Sagent	400-01
고압 튜빙	Edwards Lifesciences	50P184
아이리스 드레싱 집게	Kent	INS650915-4
Jeweler 스타일 곡선 미세 집게	Miltex	17-307-MLTX
KCl	시그마-알드리치	P3911-25G
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662-25G
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506-500G
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888-25G
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014-25G
롤러 펌프	Gilson	Minipuls 3
스트레이트 해부 가위	Kent	INS600393-G
임시 심장 페이싱 와이어	Ethicon	TPW30
와이드 레인지 포스 트랜스듀서	ADInstruments	MLT1030/A

사 INS600127당