방법 논문

토양 샘플에서 엔토모병원성 곰팡이를 분리하는 방법의 비교

DOI:

10.3791/63353

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2022년 1월 6일

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1Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, 2Laboratório de Taxonomia Bioquímica e Bioprospecção de Fungos/Coleção de Cultura de Fungos Filamentosos, Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 3Departamento de Parasitologia Animal, Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro

이 논문에서

요약

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엔토모병원성 진균 콜로니는 테네브리오 미끼, 갤러리아 미끼 및 선택적 인공 배지, 즉 클로람페니콜, 티아벤다졸 및 시클로헥시미드(CTC 배지)로 보충된 효모 추출물이 풍부한 감자 덱스트로스 한천을 사용하여 열대 토양 샘플로부터 분리된다.

초록

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본 연구의 목표는 토양 샘플로부터 엔토모병원성 진균(EPF)을 분리하기 위한 곤충 미끼 대 인공 선택적 배지 사용의 효과를 비교하는 것이다. 토양은 절지 동물 해충을 조절할 수있는 Metarhizium 및 Beauveria 속에 특히 속하는 EPF를 포함한 미생물의 풍부한 서식지입니다. 곰팡이를 기본으로하는 생물학적 제품은 주로 농업 절지 동물 해충 방제를 위해 시장에서 구입할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 높은 고유 생물 다양성에도 불구하고, 단지 몇 가지 균주만이 전 세계적으로 상업적 바이오 제품에 사용된다. 본 연구에서, 524개의 토양 샘플을 클로람페니콜, 티아벤다졸 및 시클로헥시미드(CTC 배지)로 보충된 효모 추출물이 풍부한 감자 덱스트로스 한천에서 배양하였다. 진균 콜로니의 성장은 3주 동안 관찰되었다. 모든 Metarhizium 및 Beauveria EPF는 속 수준에서 형태학적으로 확인되었습니다. 추가적으로, 일부 단리물은 종 수준에서 분자적으로 확인되었다. 이 524 개의 토양 샘플 중 스물 네 개는 곤충 미끼 방법 (갤러리아 멜로 넬라 및 테네브리오 몰리터)을 사용하여 EPF 발생에 대해 조사되었습니다. 총 51개의 EPF 균주(41개의 메타리지움 spp. 및 10개의 보베리아 spp.)를 524개의 토양 샘플로부터 분리하였다. 모든 곰팡이 균주는 농경지 또는 초원에서 분리되었습니다. 비교를 위해 선택된 24개의 샘플 중 91.7%는 갤러리아 미끼를 사용한 EPF에 대해 양성이었고, 62.5%는 테네브리오 미끼를 사용했으며, 41.7%는 CTC를 사용하여 양성이었다. 우리의 결과는 곤충 미끼를 사용하여 토양에서 EPF를 분리하는 것이 CTC 배지를 사용하는 것보다 더 효율적이라는 것을 시사했습니다. EPF의 식별 및 보존 외에도 분리 방법의 비교는 생물 다양성에 대한 지식에 긍정적 인 영향을 미칩니다. EPF 컬렉션의 개선은 과학 발전과 기술 혁신을 지원합니다.

서론

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토양은 엔토모병원성 진균(EPF)을 포함한 여러 미생물의 공급원입니다. 이 특정 곰팡이 그룹은 절지 동물 숙주, 특히 곤충을 식민지화하고 종종 죽일 수있는 능력에 의해 인식됩니다1. 분리, 특성화, 독성 균주의 선택 및 등록 후, EPF는 절지 동물 해충 방제를 위해 대량 생산되며, 이는 경제적 관련성2을 지원합니다. 따라서, EPF의 분리는 생물농약의 개발을 위한 첫 번째 단계로 간주된다. Beauveria spp. (Hypocreales : Cordycipitaceae)와 Metarhizium spp. (Hypocreales : Clavicipitaceae)는 절지 동물 해충 방제에 사용되는 가장 일반적인 곰팡이입니다3. EPF는 토양, 눈에 보이는 진균증을 가진 절지 동물, 식민지화 된 식물 및 식물 근권 4,5에서 성공적으로 분리되었습니다.

EPF의 분리는 또한이 특정 그룹의 다양성, 분포 및 생태학을 연구하는 데 유용 할 수 있습니다. 최근 문헌들은 EPF의 사용이 과소평....

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프로토콜

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본 연구가 브라질 유전 유산에 접근함에 따라이 연구는 AA47CB6 코드로 유전 유산 및 관련 전통 지식 관리 (Sisgen)를위한 국가 시스템에 등록되었습니다.

1. 토양 샘플링

  1. 작은 삽을 사용하여 800g의 토양 (입사 보조 식물 뿌리 유무에 관계없이)을 10cm 깊이로 수집하십시오. 실험이 시작될 때까지 실온에서 폴리프로필렌 백에 보관하십시오.
    참고 : EPF가 근권 능력을 갖고있다고보고됨에 따라 작은 뿌리도 수집 할 수 있습니다. 샘플의 처리가 빠를수록 곰팡이 포자가 시간이 지남에 따라 덜 생존 할 수 있기 때문에 더 좋습니다. 본 연구에서, 샘플은 수집 후 7일 이내에 분석되었다.
  2. GPS를 사용하여 위도 및 경도에서 수집된 샘플의 위치를 식별하고 토양의 유형(예: 초원, 토착 열대 우림, 호숫가 또는 농경지)에 따라 수집 지역을 분류합니다.

2. 엔토모병원성 진균에 대한 분리 방법

  1. CTC 선택적 인공 배지를 사용한 분리.
    1. CTC 배지 [0.5 g/L의 클로람페니콜, 0.001 g/L의 티아벤다졸, 0.25 g/L의 시클로헥시미드

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결과

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브라질 리우데자네이루 주에서 2015년부터 2018년까지 가축 목초지(165개 샘플), 토착 열대 우림(90개 샘플), 호숫가(42개 샘플), 경작/농경지(227개 샘플)와 같은 총 524개의 토양 샘플이 초원에서 수집되었습니다. EPF에 대해 양성인 샘플의 지리적 좌표에 대한 세부사항은 보충 표 1에 제시되어 있다.

524개의 토양 샘플 중 500개의 샘플은 CTC 배지를 통해서만 분석되었으며, 24개의 샘플은 세 가지 형태의 분리(갤러리아-미끼, 테네브리오-미끼 및 선택적 CTC 배양 배지)를 사용하여 동시에 분석되었기 때문에 이러한 방법의 상대적 효율을 평가할 수 있었습니다. 총 51개의 EPF 균주를 524개의 샘플로부터 분리하였다(메타 리지움 spp. 41개 및 보베리아 spp. 10개). (그림 1). 일부 단리물의 미세형.......

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토론

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자연 및 농업 토양 서식지는 EPF22 및 우수한 자연 저수지의 전형적인 환경입니다. 본 연구에서, 곤충 미끼 대 선택적 배지를 사용하는 EPF 분리의 두 가지 방법이 다루어졌다. 격리를위한 첫 번째 단계는 토양 샘플의 수집입니다. 토양 샘플의 적절한 저장 및 확인이 중요합니다. 위도, 경도, 토양 유형 및 생물 군계에 대한 정보는 역학, 모델링 및 지리 공간 과목23,24을 포함하는 연구에 필수적입니다. 수집 후, 이러한 토양 샘플에서 코니디아의 생존력이 결국 감소 할 수 있기 때문에 샘플을 가능한 한 빨리 (바람직하게는 7 일 이내에) 처리하는 것이 좋습니다. CTC를 이용한 EPF 분리의 중요한 단계는 a) 배양 후 1 및 2 주 후에 CTC 플레이트의 조사 (1 주간은 나중 단계에서 다른 진균 콜로니가 EPF 발달을 좁힐 수 있기 때문에 중요합니다), b) 그들의 거시 형태학.......

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공개 사항

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저자는 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 브라질의 Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Financial code 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (프로젝트 번호 E-26/010.001993/2015) 및 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) 브라질에서 자금을 조달했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
오토클레이브Phoenix Luferco9451
생물 안전 캐비닛Airstream ESCOAC2-4E3
ChloramphenicolSigma-AldrichC0378
기후 챔버EletrolabEL212/3
CoverslipRBR3871
CycloheximideSigma-AldrichC7698
Drigalski 주걱Marienfeld1800024
GPS 앱지리적 위치 앱2.1.2005
락토페놀 블루 솔루션Sigma-Aldrich61335
현미경Zeiss Axio 스타 플러스1169 149
현미경 카메라Zeiss Axiocam 105 컬러426555-0000-000
현미경 softwereZen lite Zeiss 3.0
현미경 슬라이드Olenk5-7105-1
Microtube브랜드Z336769-1PAK
페트리 플레이트KasviK30-6015
피펫 팁VattenVT-230-200C/VT-230-1000C
피펫HTL - LabmateproLMP 200 / LMP 1000
플라스틱 냄비프라페스타 데카르트&아큐트; veis8314
폴리 프로필렌 백Extrusa38034273 / 5561
감자 포도당 한천KasviK25-1022
프리즘 소프트웨어 9.1.2그래프 패드
삽Tramontina77907009
Tenebrio mollitor< / em>SafariQP98DLZ36
ThiabendazoleSigma-AldrichT8904
Tween 80Vetec60REAVET003662
VortexBiomixerQL-901
효모 추출물KasviK25-1702

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roberts, D. W., St. Leger, R. J. Metarhizium spp., cosmopolitan insect-pathogenic fungi: Mycological aspects. Advances in Applied Microbiology. 54, 1-70 (2004).
  2. do Nascimento Silva, J., et al.

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재인쇄 및 허가

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태그

MetarhiziumBeauveriaCTC

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