Method Article

TIRF 현미경에 의한 시험관 내에서 가교 및 단일 미세 소 관 의 역학의 동시 시각화

DOI:

10.3791/63377

⸱

February 18th, 2022

 ,  , 
1Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, 2Department of Genetics, Harvard Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서, TIRF 현미경 기반 시험관내 재구성 분석법이 제시되어 두 미세소관 집단의 역학을 동시에 정량화하고 비교한다. 가교된 미세소관 다발 및 단일 미세소관 상에서 다수의 미세소관-관련 단백질의 집단 활성을 동시에 보는 방법이 기술된다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

미세소관은 세포에서 별개의 구조로 조직되는 αβ-튜불린 이종이량체의 중합체이다. 미세소관 기반 아키텍처 및 네트워크에는 종종 동적 특성이 다른 미세소관 어레이의 하위 집합이 포함되어 있습니다. 예를 들어, 분열 세포에서, 가교결합된 미세소관의 안정한 다발은 동적 비가교된 미세소관에 근접하여 공존한다. TIRF-현미경-기반 시험관 내 재구성 연구는 이들 상이한 미세소관 어레이의 역학의 동역학의 동시 시각화를 가능하게 한다. 이 분석에서, 이미징 챔버는 단일 필라멘트로 존재하거나 가교된 다발로 조직되는 표면 고정화된 미세소관으로 조립된다. 튜불린, 뉴클레오티드 및 단백질 조절제의 도입은 관련 단백질 및 단일 및 가교된 미세소관의 동적 특성의 직접적인 시각화를 가능하게 한다. 또한, 동적 단일 미세소관이 번들로 구성될 때 발생하는 변화를 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 여기에 설명 된 방법은 개별 단백질의 활성 및 국소화에 대한 체계적인 평가뿐만 아니라 동일한 실험 조건 하에서 두 개의 서로 다른 미세 소관 하위 집합에 대한 단백질 조절제의 상승 효과를 허용하여 다른 방법으로는 접근 할 수없는 기계론적 통찰력을 제공합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

미세소관은 세포 내 수송 및 소기관 위치에서부터 세포 분열 및 신장에 이르기까지 여러 세포 과정에 필수적인 구조적 스캐폴드를 형성하는 바이오 폴리머입니다. 이러한 다양한 기능을 실행하기 위해 개별 미세 소관은 유사분열 스핀들, 섬모 축삭, 뉴런 번들, 상 간 배열 및 식물 피질 배열과 같은 미크론 크기의 배열로 구성됩니다. 이 구조에서 발견되는 유비쿼터스 건축 모티프는 길이를 따라 가교 된 미세 소관 묶음입니다1. 몇몇 미세소관-기반 구조의 흥미로운 특징은 번들링된 미세소관과 비가교된 단일 미세소관이 가까운 공간적 근접성에서 공존한다는 것이다. 이러한 미세소관 하위집단은 적절한 기능을 위해 필요에 따라 서로 뚜렷하게 다른 중합 역학을 나타낼 수 있습니다2,3,4,5. 예를 들어, 유사분열 스핀들 내에서, 안정한 가교결합된 다발과 동적 단일 미세소관은 세포 중심6에서 미크론 스케일 영역 내에 존재한다. 따라서 공존하는 미세 소관 집단의 동적 특성이 어떻게 지정되는지를 연구하는 것은 ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 시약 준비

  1. 표 1 및 표 2에 요약된 바와 같이 완충제 및 시약을 준비 한다. 실험 중에 달리 명시되지 않는 한 모든 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
용액구성 요소권장 저장 기간노트
5X BRB80400 mM K-파이프, 5 mM MgCl2, 5 mM EGTA, KOH로 pH 6.8, 필터 멸균최대 2년4 °C에서 보관
1X BRB8080 mM K-파이프, 1 mM MgCl2

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

상기 기재된 실험은 647 nm 형광단-표지된 비오티닐화 마이크로소관, 560 nm 형광단-표지된 비오티닐화 마이크로소관, 및 560 nm 형광단-표지된 가용성 튜불린 혼합물을 사용하여 수행되었다. 미세소관은 가교결합 단백질 PRC1 (GFP 표지)에 의해 가교결합되었다. 표면-고정화된 다발 및 단일 미세소관이 생성된 후(단계 5.11), 이미징 챔버를 TIRF 100X 1.49 NA 오일 대물 상에 장착하고 560 nm 및 647 nm 형광 채널에서 관찰하였다. 단일 미세소관은 647 nm 채널에서 그들의 형광 신호에 의해 확인되었다. 두 채널 모두에서 형광 신호를 갖는 미세소관은 미리 형성된 다발로 확인되었다(그림 4). 동일한 형광 표지를 가진 비오티닐화 및 비오티닐화 미세소관으로 실험을 수행하는 경우, 다발에 대한 검출된 형광 강도는 단일 미세소관의 형광 강도보다 약 두 배 또는 그 이상이 될 것이다. 각 개체군의 비율과 밀도에 따라, 단계 5.6 및 5.10에서 미세.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 설명 된 실험은 전통적으로 단일 미세 소관 또는 한 유형의 어레이에서 수행되는 기존의 미세 소관 재구성 분석의 범위와 복잡성을 크게 확장합니다. 현재의 분석은 두 집단, 즉 단일 미세소관 및 가교결합된 다발에 대한 조절 MAP 활성을 동시에 정량화하고 비교하는 방법을 제공한다. 또한,이 분석은 두 가지 유형의 번들을 검사 할 수 있습니다 : 역학이 시작되기 전에 안정적인 씨앗으로 미리 형성된 번들과 두 개의 성장 끝이 서로 만나서 가교 될 때 새로 형성되는 번들. 더욱이, 단백질 농도 및 완충액 조건과 같은 종래의 실험 변수 이외에도, 이들 분석은 다발에서 인접한 필라멘트 사이의 길이 및 각도와 같은 미세소관 어레이의 기하학적 특징의 영향을 평가할 수 있게 하며, 이는 미세소관 역학 및 MAP 활성16의 중요한 결정인자로 부상하고 있다.

다중 미세소관 기반 구조물의 시험.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 사업은 NIH (No. 1DP2GM126894-01)의 보조금과 퓨 자선 신탁 및 스미스 가족 재단의 기금으로 R.S.에 지원되었습니다. 저자들은 프로토콜의 개발 및 최적화에 기여한 Shuo Jiang 박사에게 감사드립니다.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(&플러스mn;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)Sigma Aldrich238813
1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES)Sigma AldrichP6757
18x18 mm #1.5 coverslips 전자 현미경 과학63787
2-메르캅토에탄올 (BME)Sigma AldrichM-6250
24x60 mm #1.5 커버슬립전자 현미경 과학63793
405/488/560/647 nm 레이저 쿼드 밴드 ChromaTRF89901-NK
아세톤시그마 Aldrich320110
아데노신 5'-트리포스페이트 디소듐 염 수화물 (ATP)Sigma AldrichA7699-5G
Avidin, NeutrAvidin® 비오틴 결합 단백질(Molecular Probes;)Thermo Fischer ScientificA2666
목욕 초음파 처리기: Branson 2800 클리너BransonCPX2800H
Beckman Coulter 폴리카보네이트 두꺼운 벽 튜브, 11 x 34 mmBeckman-Coulter 
343778 Beckman Coulter 폴리카보네이트 두꺼운 벽 튜브, 8 x 34 mmBeckman-Coulter 
비오틴-PEG-SVA, MW 5,000Laysan Bio#Biotin-PEG-SVA-5000
소 혈청 알부민(BSA)Sigma Aldrich2905
카탈라아제Sigma AldrichC40
Corning LSE 미니 마이크로 원심분리기, AC100-240VCorning6670
섬세한 작업용 물티슈Kimtech34120
디티오트레이톨 (DTT)GoldBioDTT10
방출 필터ChromaET610/75m
에탄올 (200-proof)Decon Labs2705
에틸렌 글리콜 테트라아세트산 (EGTA)Sigma Aldrich3777
글루코스 산화효소Sigma AldrichG2133
GMPCPPJena Bioscience NU-405
구아노신 5'-트리포스페이트 나트륨 소금 수화물 (GTP)Sigma AldrichG8877
Hellmanex III 세제 Sigma AldrichZ805939
이멀젼 오일, Type AFisher Scientific77010
카파-카제인Sigma AldrichC0406
LanolinFisher ScientificS25376
렌즈 세척 조직ThorLabsMC-5
염화마그네슘(MgCl2)SigmaAldrichM9272
메틸셀룰로오스시그마 알드리치M0512
마이크로퓨지 16 벤치탑 원심분리기Beckman-Coulter A46474
현미경 슬라이드, 다이아몬드 화이트 유리, 25 x 75mm, 90도; 그라운드 엣지, WHITE FrostedGlobe Scientific1380-50W
mPEG-숙시니미딜 발레레이트, MW 5,000 레이산 바이오#NH2-PEG-VA-5K
옵티마&트레이드; Max-XP 테이블탑 초원심분리기Beckman-Coulter 
파라핀Fisher ScientificP31-500
PELCO 리버스(자동 폐쇄), 미세 핀셋Ted Pella5377-NM
Petrolatum, WhiteFisher Scientific18-605-050
플라즈마 클리너, 115VHarrick PlasmaPDC-001
수산화칼륨(KOH)Sigma Aldrich221473
소듐 바이카보네이시그마 알드리치S6014
설탕시그마 알드리치S7903
Thermal-Lok 1-위치 건식 열 목욕USA Scientific2510-1101
1.5 및 2.0 mL 튜브용 Thermal-Lok 블록USA Scientific2520-0000
Thermo Scientific™ 피어싱&트레이드; 채권 파괴&거래; TCEP 용액, 중성 pH; 500mMThermo Fischer ScientificPI-77720
TIRF 100X NA 1.49 오일 오브젝티브NikonCFI Apochromat TIRF 100XC 오일
TIRF 현미경NikonEclipse Ti
TLA 120.1 로터Beckman-Coulter 
TLA 120.2 로터Beckman-Coulter 
튜불린 단백질(>99% 순수): 돼지 뇌세포골격T240
튜불린 단백질(비오틴): 돼지 뇌세포골격T333P
튜불린 단백질(형광 HiLyte 647): 돼지 뇌세포골격TL670M
튜불린 단백질(X-로다민): 소 뇌세포골격TL620M
벡타본드® 시약, 조직 절편 접착벡터 BiolabsSP-1800-7
VWR® 개인용 인큐베이터, 120V, 50/60Hz, 0.6AVWR97025-630
343776393315트 362224357656

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
  2. Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. Stability properties of neuronal mic....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

TIRF MicroscopyMicrotubule DynamicsCrosslinked MicrotubulesSingle MicrotubulesIn Vitro ReconstitutionFluorescence ImagingMicrotubule BundlesProtein RegulatorsSurface ImmobilizationMicrotubule Organization

Related Articles