본 프로토콜은 P. americana에서 RNAi 조작 기술에 대한 단계별 지침을 설명합니다.
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방법 논문
미국 바퀴벌레에 있는 RNA 간섭의 신청
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
위생 해충 인 바퀴벌레는 쉬운 먹이와 반대사 적 특성으로 인해 곤충 발달 및 변형 연구에서 필수적인 종입니다. 주석이 잘 달린 게놈 서열과 함께, 이러한 장점은 미국 바퀴벌레 인 Periplaneta americana를 중요한 반대사 곤충 모델로 만들었습니다. 녹아웃 전략의 부족으로 제한되는 효과적인 RNA 간섭 (RNAi) 기반 유전자 녹다운은 P. americana의 기능적 유전자 연구에 없어서는 안될 기술이됩니다. 본 프로토콜은 P. americana에서의 RNAi 조작 기술을 기술한다. 프로토콜은 (1) 적절한 발달 단계에서 P. americana 의 선택, (2) 주사 설정을위한 준비, (3) dsRNA 주사, 및 (4) 유전자 녹다운 효율 검출을 포함한다. RNAi는 P. americana의 강력한 역 유전 도구입니다. P. americana 조직의 대부분은 세포외 dsRNA에 민감하다. 그것의 단순성은 연구자가 하나 또는 여러 개의 표적화 dsRNA 주사 하에서 기능 장애 표현형을 신속하게 얻을 수있게하여 연구자가 발달 및 변형 연구에 P. americana를 더 잘 사용할 수있게 해줍니다.
서론
진화적으로 보존된 기전인 RNA 간섭(RNAi)은 앤드류 파이어(Andrew Fire)와 크레이그 멜로 2(Craig Mello2)가 이중 가닥 RNA(dsRNA) 매개 유전자 침묵 전략을 개발했기 때문에 점차 많은 유기체1에서 유전자 발현을 억제하는 필수적인 역유전학적 도구가 된다. dsRNA는 21-23 뉴클레오티드의 단편으로 절단되고, 작은 간섭 RNA (siRNAs)는, 세포 내의 다이서 효소에 의해 RNAi 경로를 활성화시킨다. 그런 다음 siRNA가 표적 mRNA에 결합하고 mRNA 절단을 일으키고, 최종적으로 유전자 기능 3,4,5의 손실을 초래하는 RNA-유도 침묵 복합체 (RISC)에 혼입된다. 곤충 종 중에서, 많은 전신 RNAi 실험은 지금까지 Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera 및 Blattodea 5,6,7,....
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프로토콜
P. americana의 라인은 처음에 Huiling Hao 박사에 의해 제공되었습니다. 이 종은 30 년 동안 근친 교배로 유지되어왔습니다 9.
1. P. americana의 부화 및 먹이주기
- P. americana의 신선한 oothecae (알을 낳는 직후)를 수집하고 ~ 25 일 동안 25 °C 및 60 % 습도의 어두운 인큐베이터에서 배양하십시오. 그런 다음 부화 3 일 전에 온도와 습도를 30 ° C와 75 %로 높입니다.
- 4mm 조리개가있는 체를 사용하여 부화 한 님프를 oothecae에서 분리하십시오.
- 님프를 원통형 용기 (직경 12cm, 높이 10cm)에 28 °C, 70 % 습도의 어둠 속에 보관하십시오. 바퀴벌레가 탈출하는 것을 막기 위해 바셀린으로 용기의 안쪽 가장자리를 닦으십시오. 쥐 음식, 물 및 피난처 (달걀 쟁반)를 제공하십시오. 님프의 활동에주의를 기울이고 정기적으로 대변과 파편을 청소하십시오.
2. 적절한 별에서 님프의 선택
- 유리 튜....
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결과
그림 1은 성공적인 주사를 보여줍니다. 마이크로 직경 바늘이 있는 미세주사 주사기는 부스터 위에 수평으로 놓아야 합니다(그림 1A). 바늘은 표피에 대해 수평으로 두 복부 소마이트 사이의 틈을 통해 삽입됩니다 (그림 1B). 액체가 P. americana 복부에 들어가는지 확인하십시오. 바늘의 너무 가파른 각도는 내부 장기를 손상시키고 (그림 1C), 부적절한 주사는 복부 밖으로 dsRNA 용액이 누출됩니다 (그림 1D). dsRNA가 새어 나오면 동물을 버려야하며 또 다른 주사가 수행됩니다. P. americana는 주사 중에 완전히 마취해야합니다.
다른 생물학적 실.......
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토론
이 보고서는 P. americana의 방법론적 단계별 RNAi 전략을 기술하였다; 참고로, 그것은 또한 다른 바퀴벌레 (예 : Blattella germanica )와 사소한 변화가있는 다른 많은 곤충에도 적용될 수 있습니다. 그러나, RNAi의 유전자 침묵 효율이 항상 충분히 높은 것은 아니며, 유전자 녹아웃 전략(13)과 비교하여 명백한 단점이 있다. 유전자 수준의 다음의 잔류 효과는 실제 표현형을 방해할 수 있다. RNAi 치료가 성공적인지 확인하기 위해서는 동물의 물리적 상태, 대조군의 선택, dsRNA 분자의 길이 및 농도, 오프 타겟 효과 (OTE)의 가능성 회피 및 dsRNA에 대한 조직의 다른 민감도를 포함하여 몇 가지 필수 조건을 고려해야합니다.
P. 아메리카나의 신체 상태
건강한 동물은 RNAi 및.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 번호 32070500, 31620103917, 31330072 및 31572325 C.R., Sh.L.), 광동성 자연 과학 재단 (보조금 번호 2021B1515020044 및 2020A1515011267 ~ C.R.), 광동성 과학 기술부 (보조금 번호 2019B090905003 및 2019A0102006), 광저우 과학 기술부 (보조금 번호 202102020110), 심천 과학 기술 프로그램 (보조금 번호. KQTD20180411143628272 to Sh.L.).
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 701 N 10 &마이크로; L Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | 주입 |
| 인큐베이터 | 닝보 Jiangnan 악기 공장 | RXZ-380A-LED | 바퀴벌레 부화 및 수유용 |
| 마이크로 주입 펌프 | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | 주입 |
| pTOPO-Blunt 클로닝 키트 | Aidlab Biotechnology | CV16 | 유전자 추적 |
| 정량적 Real-Time PCR 시스템용 | Bio-Rad | CFX Connect | qRT-PCR 분석을 위한 |
| T7 RiboMAX Express RNAi 시스템 | Promega | P1700 | dsRNA 합성을 위한 것으로, Rnase A 용액 (4 μ 지/&무; L), 아세트산나트륨, 3.0M(pH 5.2), 효소 혼합물, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase |
| Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | DNA 증폭용 |
참고문헌
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi. PloS One. 7 (10), 47431(2012).
- Fire, A., et al.
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재인쇄 및 허가
