방법 논문

단일 핵 RNA 시퀀싱을 위한 마우스 교감신경 신경절의 바코드된 항체를 사용한 저입력 핵 분리 및 멀티플렉싱

DOI:

10.3791/63397

⸱

2022년 3월 23일

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1Department of Anatomy & Embryology, Leiden University Medical Center, 2Department of Cardiology, Leiden University Medical Center, 3Department of Medical Statistics and Bioinformatics, Leiden University Medical Center

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 우수한 자궁경부 및 성상 신경절, 세포 해리, 동결보존, 핵 분리 및 해시태그 바코딩을 포함하는 단일 핵 시퀀싱을 위한 상세하고 낮은 입력 샘플 준비를 설명합니다.

초록

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심장 자율 신경계는 심박수 및 심장 수축과 같은 심장 기능을 제어하는 데 중요하며 교감 신경과 부교감 신경 가지로 나뉩니다. 일반적으로 항상성을 유지하기 위해이 두 가지 사이에는 균형이 있습니다. 그러나 심근 경색, 심부전 및 고혈압과 같은 심장 질환 상태는 불리한 임상 결과와 관련된 심장 신경 과민에 관여하는 세포의 리모델링을 유도 할 수 있습니다.

심장 자율 신경계의 조직 학적 구조와 기능에 대한 방대한 양의 데이터가 있지만, 건강과 질병에서의 분자 생물학적 구조는 여전히 많은 측면에서 수수께끼입니다. 단일 세포 RNA 시퀀싱 (scRNA-seq)과 같은 새로운 기술은 단일 세포 분해능에서 조직의 유전 적 특성화에 대한 약속을 지닙니다. 그러나, 상대적으로 큰 크기의 뉴런은 이들 기술의 표준화된 사용을 방해할 수 있다. 여기서, 이 프로토콜은 건강 및 질병에서 심장 교감 신경세포의 생물학적 구조를 특성화하는 방법인 액적 기반 단일 핵 RNA 시퀀싱(snRNA-seq)을 이용한다. 단계적 접근법이 성인 마우스로부터 해부된 양측 우월한 자궁경부(SCG) 및 성상 신경절(StG)의 snRNA-seq를 수행하는 것으로 입증된다.

이 방법은 장기간 시료 보존을 가능하게 하여 단기간 내에 여러 개인/실험의 샘플을 한꺼번에 수집할 수 없을 때 적절한 RNA 품질을 유지합니다. 해시태그 올리고(HTO)로 핵을 바코딩하면 역다중화 및 시퀀싱 후 별개의 신경절 샘플의 추적이 가능합니다. 후속 분석은 snRNA-seq에 의해 검증 된 교감 신경절의 신경, 위성 신경교 및 내피 세포의 성공적인 핵 포획을 밝혀 냈습니다. 요약하면, 이 프로토콜은 교감신경성 외인성 심장 신경절의 snRNA-seq 에 대한 단계적 접근법을 제공하며, 이는 다른 기관 및 조직의 신경과민에 대한 연구에서 보다 광범위하게 응용될 수 있는 잠재력을 갖는 방법이다.

서론

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자율 신경계 (ANS)는 환경 조건 및 병리학에 대한 적응을 포함하여 신체 항상성을 유지하는 말초 신경계의 중요한 부분입니다1. 그것은 심혈관, 호흡기, 소화 및 내분비 시스템과 같은 신체 전체의 여러 장기 시스템의 조절에 관여합니다. ANS는 교감 신경과 부교감 신경으로 나뉩니다. 교감 신경계의 척추 분지는 교감 신경절의 신경절에서 시냅스, 부추 동맥 위치에 양측으로 위치. 양측 자궁 경부 및 흉부 신경절, 특히 StG는 심장 교감 신경에 참여하는 중요한 구성 요소입니다. 심장 허혈과 같은 질병 상태에서, 뉴런 리모델링이 발생할 수 있고, 교감신경성 과잉구동(sympathetic overdrive)을 초래한다2. 뉴런 리모델링은 인간 및 몇몇 다른 동물 종 3,4,5,6에서 다수의 조직학적 연구에서 입증되었다. 심장 교감신경절에서 심장 허혈 유발 뉴런 리모델링의 상세한 생물학적 특성화는 현재 결여되어 있으며, 심장 교감신경계(SNS) 내의 특수화된 뉴런 세포 유형 또는 아형의 ....

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프로토콜

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이 프로토콜은 뮤린 자궁 경부 및 / 또는 자궁 경부 흉부 (스텔레이트) 신경절의 snRNA-seq에 필요한 모든 단계를 설명합니다. 암컷 및 수컷 C57BL/6J 마우스(15주령, 각 성별에 대해 n=2)를 사용하였다. 1개의 추가적인 Wnt1-Cre;mT/mG 마우스가 해부 목적을 위해 신경절을 시각화하는데 사용되었다(17,18). 이 추가 마우스는 B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J 마우스와 B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J 마우스의 교배에 의해 생성되었다. 모든 동물 실험은 NIH가 발표하고 라이덴 대학의 동물 윤리위원회 (라이센스 번호 AVD1160020185325, Leiden, 네덜란드)의 승인을 받아 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드에 따라 수행되었습니다. 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 장비, 소프트웨어 및 동물에 대한 자세한 내용은 자료표를 참조하십시오.

1. 준비

주: 모든 단계는 세포 배양 흐름 캐비닛에서 수행됩니다.

  1. ....

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결과

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단핵 cDNA 라이브러리 제제 및 snRNA-seq의 품질관리 분석
대표적인 결과는 25,000개의 판독/핵 유전자 발현 라이브러리와 5,000개의 판독/핵 해시태그 라이브러리가 있는 단일 풀에서 10,000개의 포획된 핵의 시퀀싱 결과를 설명합니다. 도 3B 는 Bioanalyzer로 체크한1st 가닥 cDNA, 유전자 발현(GEX) 라이브러리, 및 HTO 라이브러리의 품질 관리 결과를 도시한다. HTO 유래 cDNA는 180 bp보다 작은 반면, mRNA 유래 cDNA는 300 bp보다 클 것으로 예상된다. 고품질 GEX 라이브러리는 300 ~ 1,000bp의 넓은 피크로 검출될 수 있으며, HTO 라이브러리는 194bp의 특정 피크로 검출된다. 셀 레인저는 디멀티플렉싱, fastq 파일 생성 및 읽기 정렬에 기본 설정에 사용되었다. Seurat R 패키지(19) 는 이후 품.......

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토론

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여기서, 상세한 프로토콜은 i) 우수한 자궁경부 및 성상 교감신경절의 해부, ii) 신경절이온성 세포의 분리 및 동결보존, iii) 핵 단리, 및 iv) 핵-다중화 목적을 위한 HTO 표지를 이용한 바코딩 및 snRNA-seq에 초점을 맞추는 것을 기술한다.

이 프로토콜로, 교감 신경절 이온성 세포는 일반적으로 사용되는 트립신과 콜라게나제를 사용하여 개별 신경절을 해리시킴으로써 쉽게 얻을 수 있다. 단리된 신경절 세포의 장기 보존은 또한 10% DMSO로 보충된 FBS에서 세포를 동결시킴으로써 쉽게 달성되며, 이는 해동 후 높은 수준의 회복을 보여주었다. 더욱이, 종래의 단일 세포 RNA 시퀀싱과 비교하여, HTO 염색 기반 핵-바코딩의 적용과 결합된 단일 뮤린 교감신경절의 액적 기반 snRNA-seq의 사용은 다음과 같은 이점을 갖는다: i) 샘플은 모든 샘플이 추가 핵 분리를 위해 준비될 때까지 장시간 보존될 수 있다; ii) 다수의 작은 크기 신경절로부터 분리된 양질의 핵은.......

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공개 사항

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저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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Susan L. Kloet (Department of Human Genetics, LUMC, Leiden, the Netherlands)에게 실험 설계 및 유용한 토론에 도움을 주신 것에 감사드립니다. 우리는 Emile J. de Meijer (인간 유전학과, LUMC, Leiden, 네덜란드)에게 단일 핵 RNA 분리 및 시퀀싱을위한 라이브러리 준비에 도움을 주신 것에 감사드립니다. 이 연구는 네덜란드 과학 연구기구 (NWO) [016.196.346 ~ M.R.M.J.]의 지원을 받습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Chemicals and reagents
0.25% Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific25200056
0.4% trypan blue dyeBio-Rad1450021
Antibiotic-AntimycoticGibco15240096
B-27GibcoA3582801
Collagenase type 2WorthingtonLS0041761,400 U/mL
Dimethyl sulfoxideSigma Aldrich67685
Ethanol absolute &ge를 사용합니다. 99.5%VWRVWRC83813.360
소 태아 혈청(저내독소)BiowestS1810-500
L-글루타민Thermo Fisher Scientific25030024
Neurobasal MediumGibco21103049
소 혈청 알부민 10%Sigma-AldrichA1595-50ML세포 세척 완충액
DPBS(Ca2+, Mg2+free)Gibco14190-169Cell wash buffer
Magnesium Chloride Solution, 1 MSigma-AldrichM1028Nucleus Lysis buffer
Nonidet P40 Substitute (nonionic detergent)Sigma-Aldrich74385Nucleus Lysis buffer
Nuclease free water (not DEPC-treated)InvitrogenAM9937Nucleus Lysis buffer
프로텍터 RNase 억제제, 40 U/&마이크로; L시그마-알드리치3335399001핵 용해 완충액
염화나트륨 용액, 5 M시그마-알드리치59222C핵 용해 완충액
트리즈마 염산염 용액, 1 M, pH 7.4시그마-알드리치T2194핵 용해 완충액
소 혈청 알부민 10%시그마-알드리치A1595-50ML핵 세척
DPBS(Ca2+, Mg< sup>2+free)Gibco14190-169Nucleus wash
Protector RNase Inhibitor,40 U/µ LSigma-Aldrich3335399001핵 세척
소 혈청 알부민 10%Sigma-AldrichA1595-50MLST 염색 완충액(ST-SB)
염화칼슘 용액, 1MSigma-Aldrich21115-100MLST 염색 완충액(ST-SB)
염화마그네슘 용액, 1MSigma-AldrichM1028ST 염색 완충액(ST-SB)
뉴클레아제 무함유수(DEPC 아님) 처리)InvitrogenAM9937ST 염색 완충액(ST-SB)
염화나트륨 용액, 5MSigma-Aldrich59222CST 염색 완충액(ST-SB)
Trizma Hydrochloride 용액, 1M, pH 7.4Sigma-AldrichT2194ST 염색 완충액(ST-SB)
Tween-20Merck Millipore822184ST 염색 완충액(ST-SB)
TotalSeq-A0451 항핵 기공 복합 단백질 해시태그 1 항체Biolegend682205해시태그 항체
TotalSeq-A0452 항핵공 복합 단백질 해시태그 2 항체Biolegend682207해시태그 항체
TotalSeq-A0453 항핵공 복합 단백질 해시태그 3 항체Biolegend682209해시태그 항체
TotalSeq-A0461 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 11 항체Biolegend682225Hashtag 항체
TotalSeq-A0462 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 12 AntibodyBiolegend682227Hashtag 항체
TotalSeq-A0463 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 13 항체Biolegend682229Hashtag 항체
TotalSeq-A0464 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 14 AntibodyBiolegend682231Hashtag 항체
TotalSeq-A0465 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 15 AntibodyBiolegend682233Hashtag 항체
TruStain FcX (human)Biolegend422302FC receptor blocking solution
장비 및 소모품
브라이트 라인  헤마사이토미터MerckZ359629-1EA
원심분리기 5702/R A-4-38Eppendorf 
CoolCell LX 세포 동결 용기CorningCLS432003-1EA
CryovialThermo Scientific479-6840
DNA LoBind 0.5 mL Eppendorf tube EppendorfEP0030108035-250EA
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mLEppendorf30121872
Falcon 35 mm Not TC-treated Petri dishCorning
Falcon 15 mL 원뿔형 원심분리기 튜브Fisher 과학10773501
펜치 Dumont #5세밀 과학 도구11252-40
경화 세밀 가위세밀 과학 도구14091-09
  아이스 팬, 직사각형 4 L 오렌지코닝CLS432106-1EA
라이카 MS5라이카현미경
Moria MC50 가위정밀 과학 도구15370-50
Noyes 스프링 가위정밀 과학 도구15012-12
Olympus CK2 ULWCD올림푸스현미경
P10GilsonF144802
P1000GilsonF123602
P200GilsonF123601
사전 분리 필터(30 &마이크로; m)Miltenyi biotecMiltenyi biotec130-041-407
흔들리는 수조GFL1083
실리콘 플레이트고무BV3530해부 보드
< strong> 소프트웨어 및 패키지 < / strong>
Cell rangerV4.0.0
R 프로그래밍V4.1.1
R sudioV1.3.1073
SeuratV4.0
tydiverseV1.3.1
Animals
B6. Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J 마우스The Jackson LaboratoryJAX 주식 #022501
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J 마우스The Jackson LaboratoryJAX 주식 #007576
C57BL/6J 마우스Charles River
데이터 분석용 코드
EP022629905351008https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McCorry, L. K. Physiology of the autonomic nervous system. American Journal of Pharmaceutical Education. 71 (4), 78(2007).
  2. Li, C. -Y., Li, Y. -G. Cardiac sympathetic nerve sprouting and susceptibility to ventricula....

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