이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

유방 종양 미세환경의 생체 내 이미징을 위한 라벨 없는 세분화 접근법

2.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/63413

⸱

2022년 5월 24일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Pathology, University of Wisconsin-Madison, 3Carbone Cancer Center, University of Wisconsin-Madison

이 논문에서

요약

여기에 설명된 생체내 영상화 방법은 대사 보조인자 NAD(P)H로부터의 콜라겐 초고조파 생성 및 내인성 형광을 이용하여 표지되지 않은 종양 미세환경을 종양, 기질 및 혈관 구획으로 비침습적으로 분절하여 4D 생체내 영상의 심층 분석을 한다.

초록

살아있는 종양 미세환경 내에서 수많은 세포 유형과 세포외 매트릭스(ECM) 사이의 복잡하고 역동적인 생리적 상호작용을 시각화하는 능력은 종양 진행을 조절하는 기전을 이해하는 중요한 단계이다. 이것은 현재의 생체 내 이미징 기술을 통해 달성 될 수 있지만, 조직의 이질적 특성과 실험 관찰 내에서 공간 맥락에 대한 필요성으로 인해 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다. 이를 위해 우리는 콜라겐 초고조파 생성 영상화, 대사 보조인자 NAD(P)H로부터의 내인성 형광, 형광 수명 이미징 현미경(FLIM)을 비침습적으로 종양 미세환경을 종양 둥지의 기본 도메인, 주변 스트로마 또는 ECM 및 혈관 구조로 분류하는 수단으로 쌍을 이루는 생체내 이미징 워크플로우를 개발했습니다. 이 비침습적 프로토콜은 유방 종양 모델의 타임랩스 이미지 획득부터 후처리 분석 및 이미지 세분화에 이르기까지 단계별 프로세스를 자세히 설명합니다. 이 워크플로우의 주요 장점은 대사 시그니처를 활용하여 외인성 형광 라벨을 사용하지 않고 동적으로 변화하는 살아있는 종양 미세환경을 맥락화하여 인간 환자 유래 이종이식편(PDX) 모델 및 외인성 형광단이 쉽게 적용되지 않는 미래의 임상 사용에 유리하다는 것입니다.

서론

종양 미세환경 내의 세포외 기질 (ECM)은 질환 진행을 더욱 촉진하기 위해 다수의 세포 유형에 의해 동적으로 침착되고 리모델링되는 것으로 알려져 있다 1,2,3. 이러한 매트릭스 변경은 세포 거동을 변화시키는 기계적 및 생물학적 단서를 모두 제공하며 종종 매트릭스 리모델링의 지속적인 사이클을 초래합니다 4. 종양 세포와 세포외 매트릭스 사이의 동적, 상호적 상호 작용에 대한 조사는 종종 시험관내 배양 또는 미세유체 시스템에서 3차원(3D)을 사용하여 수행된다. 이러한 상향식 접근법은 ECM 리모델링5,6,7, 증식 증가8, 상피에서 중간엽 전이9,10,11,12, 종양 세포 이동 및 침윤 7,13,14,15,16 의 메카니즘을 입증하는 반면, 그들의 초점은 생리학적 조직 내에 존재하는 상호작용의 다양성 및 이질성과 비교하여 동질적인 3D 매트릭스 내의 몇몇 세포 유형 (예를 들어, 종양 세포 또는 섬유아세포)에 주로 집중되어 왔다. 시험관내 시스템 이외에도, 생체외 종양 조직학은 또한 이러한 세포-세포 및 세포-ECM 상호작용(17)에 대한 약간의 통찰을 제공할 수 있다. 면역조직화학은 ECM의 공간적으로 불균질한 조성 및 구조에 대하여 여러 세포 유형을 분석할 수 있다는 장점이 있지만, 고정된 조직의 정적 종점은 세포와 미세환경 사이의 상호작용의 동적 성질을 포착하지 못한다. Intravital 이미징은 네이티브 종양 미세 환경의 생리적 맥락 내에서 다양하고 역동적 인 상호 작용을 조사하는 문을 열었습니다.

생명 내 종양 영상의 기능은 빠르게 발전하고 있습니다. 창문을 이식하기 위한 이미징 윈도우 및 수술 기술의 설계의 개선은 다양한 해부학적 위치(즉, 원발성 종양, 림프절, 전이성 부위18,19,20)에서 장기 종방향 종양 영상화를 가능하게 하였다. 더욱이, 다중 차원(즉, 분광, 공간 형광 강도 및 수명) 및 고해상도 및 속도(비디오 속도)로 데이터를 시각화하고 수집하는 광학 계측의 용량은 널리 접근이 가능해지고 있다. 개선된 기술은 생리학적 환경 내에서 세포 신호전달 및 표현형 역학의 급격한 변화를 탐구할 수 있는 기회를 제공한다. 마지막으로, 광유전학적 도구 및 광범위한 유전자 형광 구축물의 확장은 발달 또는 질병 진행 동안 종양 미세환경 또는 세포 계보 추적에서 세포 이동을 포획하기 위해 특정 세포 유형의 태깅을 허용한다(21,22). CRISPR / Cas9 기술과 함께 이러한 도구를 사용하면 연구원이시기 적절하게 고유 한 동물 모델을 생성 할 수있는 기회를 얻을 수 있습니다.

이러한 모든 진보가 생체 내 이미징을 역동적이고 생리적 인 세포 상호 작용을 탐구하는 점점 더 강력한 방법으로 만드는 반면, 조직 수준에서 공간적, 시간적, 구조적 맥락을 이러한 생물학적 상호 작용에 제공하는 전략을 개발하는 것이 여전히 중요합니다. 현재, 많은 생명 내 영상 연구는 형광 염료를 혈관구조에 주입하거나 물리적 특징을 묘사하기 위해 형광 단백질을 외인성으로 발현하는 마우스 모델을 사용하여 혈관과 같은 시각적 랜드 마크의 부족을 보완합니다. 주사용 염료 및 형광 덱스트란과 같은 기질은 활력 내 콜렉션19, 23, 24에서 혈관구조를 성공적으로 표지하기 위해 광범위하게 활용된다. 그러나, 이러한 접근법은 제한이 없는 것은 아니다. 하나는 추가 마우스 조작이 필요하며 그 유용성은 단기 실험으로 제한됩니다. 종단 연구의 경우, 형광 덱스트란은 식세포 세포에서 덱스트란의 축적 또는 시간25에 따른 주변 조직으로의 확산을 관찰 할 때 문제가 될 수 있습니다. 마우스 모델로의 외인성 형광 단백질 혼입은 형광 덱스트란에 대한 대안으로서 제시되어 왔지만 그 자체의 한계를 제시한다. 마우스 모델 내에서 외인성 형광단의 가용성과 다양성은 여전히 제한적이며 만드는 데 비용이 많이 듭니다. 추가적으로, PDX 모델과 같은 특정 모델에서, 유전자 조작은 바람직하지 않거나 가능하지 않다. 또한, 세포 내 형광 또는 생체발광 단백질의 존재는 마우스 내 및 면역적격 마우스 모델 내에서 외래로 인식되며, 이것은 숙주 면역계(26,27)의 반응으로 인한 전이의 양을 감소시킨다는 것이 밝혀졌다. 마지막으로, 공간적 맥락 또는 후속 데이터를 분절하기 위해 사용되는 외인성 형광 단백질 또는 형광 염료는 종종 관심의 생리학적 상호작용을 조사하는데 달리 사용될 수 있는 광 스펙트럼의 프라임 범위를 차지한다.

ECM으로부터의 내재적 신호 또는 조직 내 세포로부터의 내인성 형광의 사용은 보다 심층적인 세포 및 공간 분석을 위해 생체내 데이터를 분절하는 잠재적인 범용 라벨 프리 수단을 나타낸다. 제2고조파 생성(SHG)은 ECM(28)을 시각화하는데 오랫동안 사용되어 왔다. 섬유 조직 29,30,31의 특성화를 돕기 위한 중요한 도구의 후속 개발로, 국소 ECM 구조에 비해 세포 거동을 특성화할 수 있다. 또한, 내인성 대사산물인 NAD(P)H로부터의 자가형광은 생체내에서 종양 미세환경을 구획화하는 또 다른 표지가 없는 도구를 제공한다. NAD(P)H는 종양 세포에서 밝게 형광을 띠며, 성장하는 종양 둥지의 경계를 그의 주변 스트로마21,32로부터 구별하는데 사용될 수 있다. 마지막으로, 혈관구조는 종양 미세환경 및 주요 세포형-특이적 상호작용의 부위에서 중요한 생리학적 구조이다(33,34,35). 적혈구(RBC) 또는 혈장의 여기가 종양 혈관조직을 시각화하는데 사용되어 왔으며, 2- 또는 3-광자 여기(2P; 3P)를 사용하여 혈류 속도의 측정이 가능한 것으로 나타났다(36). 그러나 더 큰 혈관은 내인성 형광 서명으로 쉽게 식별 할 수 있지만 미묘하고 가변적이며 형광이 적은 작은 혈관을 식별하려면 더 많은 전문 지식이 필요합니다. 이러한 내재적 인 어려움은 최적의 이미지 세분화를 방해합니다. 다행스럽게도, 내인성 형광의 이들 공급원(즉, 적혈구 및 혈장)은 또한 형광 수명 이미징(37)에 의해 측정될 수 있으며, 이는 혈관구조의 독특한 광물리적 특성을 이용하고 성장하는 생체내 툴박스에 유용한 부가물을 나타낸다.

이 프로토콜에서는 내인성 형광 및 SHG와 같은 고유 신호를 사용하여 명시 적으로 4 차원 (4D) 생체 내 이미징의 세분화를위한 워크 플로우가 획득에서 분석까지 설명됩니다. 이 프로토콜은 PDX 모델의 경우와 같이 외인성 형광이 실용적이거나 가능하지 않을 수 있는 유방 이미징 창을 통한 종단 연구에 특히 적합합니다. 그러나 여기에 설명 된 세분화 원칙은 종양 생물학, 조직 발달 또는 정상 조직 생리학을 조사하는 생체 내 사용자에게 광범위하게 적용됩니다. 보고된 분석 접근법 모음을 통해 사용자는 정렬된 또는 무작위 콜라겐 섬유 구성의 영역 간에 세포 거동을 구별하고, 종양 미세환경의 특정 영역에 상주하는 세포의 수 또는 거동을 비교하고, 라벨이 없거나 내재적 신호만을 사용하여 혈관을 종양 미세환경에 매핑할 수 있습니다. 함께, 이러한 방법은 유선의 4D 생체 내 이미징에서 얻은 정보의 깊이를 극대화하는 동시에 추가적인 외인성 라벨의 필요성을 최소화하기위한 운영 프레임 워크를 만듭니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

설명 된 모든 실험은 University of Wisconsin-Madison의 Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다. 모든 동물 실험에서 웰빙과 통증 관리가 가장 중요합니다. 따라서 절차의 각 단계에서 동물이 편안하고 잘 보살핌을받을 수 있도록 모든 노력을 기울입니다.

1. 유방 이미징 창 (MIW)의 생성

  1. 유방 이미징 창을 구성하려면 수술 등급 스테인레스 스틸로 14mm 링을 제작하십시오.
  2. 가공 된 창틀을 5 % 세척 세제의 뜨거운 용액을 사용하여 청소하고, 실행 탈이온수 (DI)에서 10 분 동안 헹구고, 10 분 동안 100 % 에탄올에 담근 다음 열 램프로 건조시킵니다. 건조된 MIW 프레임을 오토클레이브하고 나중에 사용할 수 있도록 보관하십시오.
  3. 다음과 같이 MIW 커버 유리를 준비하십시오 : #1.5 12 mm 둥근 커버 유리를 100 % 에탄올에 10 분 동안 담그고 열 램프 아래에서 건조 한 다음 시아 노 아크릴레이트 접착제를 사용하여 금속 MIW 프레임에 고정하십시오. 접착제를 밤새 치료하십시오.
  4. 조립된 과량의 접착제의 MIW를 아세톤 담근 면봉을 사용하여 청소하고, 이를 10분 동안 70% 에탄올에 침지시켜 클렌징한다. 청소 된 창문이 건조되도록하십시오. MIW를 미리 준비하고 수술 이식 전에 멸균 페트리 접시에 보관하십시오.

2. MIW의 외과 적 이식

  1. 수술 도구를 오토클레이브하고 창 이식 수술을 시작하기 전에 70 % 에탄올로 표면을 소독하십시오.
  2. 멸균 된 밭으로 덮인 따뜻한 담요를 사용하여 소독 된 탁상에서 수술을 수행하십시오. 멸균 필드 상단에서 측정 된 온도가 40 °C가되도록 온난화 담요를 설정하십시오.
  3. 보조 냉간 조명을 사용하여 조직 건조를 방지하십시오. 수술 절차를 용이하게하기 위해 돋보기를 사용하십시오. 외과 모범 사례에서 권장하는 멸균, 일회용 실험실 코트, 수술 슬리브, 장갑, 눈 보호 및 안면 마스크로 구성된 PPE를 착용하십시오.
  4. 이소플루란 설정이 2.0%이고 산소 유량이 2.0L/min인 마취 기화기를 사용하여 마우스를 마취합니다. 진통제 (10 mg / kg 멜록시캄)를 피하 주사로 투여하십시오.
    참고 : 수술 후 처음 2 일 동안 처음 24 시간, 바람직하게는 8-12 시간마다 추가 복용량을 제공하십시오.
  5. 일단 마취되면 (발가락 꼬집음에 반응하지 않음), 눈의 건조를 방지하기 위해 보습 아이 젤을 바르십시오. 탈모 크림을 사용하여 수술 부위 (4번째 사타구니 유선)에서 모피를 제거한 다음 멸균 된 물에 담근 거즈로 헹구십시오.
  6. 3 개의 베타 딘 및 에탄올 스크럽으로 피부 표면을 살균하여 수술을위한 제모 된 수술 부위를 준비하십시오.
  7. 수술을 시작하려면 포셉을 사용하여 4 번째 유선의 4 번 위로 피부를 부드럽게 들어 올립니다. 피부가 체벽에서 멀어지면 외과 용 마이크로 가위로 포셉 끝에있는 진피층의 ~ 1mm 부분을 제거하십시오. 출혈이 발생하면 출혈이 멈출 때까지 멸균 거즈로 부드러운 압력을 가하십시오.
    참고: 일반적으로 큰 종양은 작은 종양이나 정상 조직보다 출혈 가능성이 더 큽니다.
  8. 밑샘이 절단되지 않도록 수술 개구부에서 포셉의 부드러운 움직임으로 진피층에서 유선을 분리하십시오.
  9. 10mm 절개를 만들고 주변부의 진피 층에서 유선을 방출하여 봉합사가 유선을 관통하지 않고 배치 할 수 있도록하십시오. PBS를 추가하여 노출된 샘/종양을 덮고 건조를 방지합니다.
  10. 5-0 실크 꼰 봉합사를 사용하여 개구부 주변을 따라 지갑 끈 봉합사를 만듭니다. 진피층이 MIW의 수신 노치에 맞물리도록 MIW의 가장자리를 삽입합니다.
  11. MIW의 반대쪽에서 상피를 부드럽게 스트레칭하고 진피층이 전체 MIW 둘레 주위에 수신 노치를 완전히 맞물리도록 금속 MIW를 제자리에 밀어 넣습니다. 지갑 끈을 단단히 조여서 진피 층을 노치에 그리고 묶어 MIW를 완전히 고정시킵니다.
  12. MIW에서 진피층에 국소 항생제를 첨가하고, 흉골 잔해를 유지하기에 충분한 의식을 회복할 때까지 마우스를 지속적으로 모니터링한다. MIW 이식 마우스를 케이지에 놓은 이글루로 부드러운 침구에 별도로 보관하고 이미징하기 전에 마우스가 48 시간 동안 회복 할 수 있도록하십시오.

3. 이미징을위한 현미경 단계에서 마우스를 배치하고 유지 관리

  1. 현미경 단계에 가열 챔버를 설치하십시오. 30°C로 설정된 강제 공기 시스템 또는 다른 유사한 시스템을 사용하십시오. z 초점의 드리프트를 피하기 위해 대물 히터를 사용하십시오. 이미징하기 전에 시스템이 최소 1시간 동안 평형에 도달하도록 합니다.
    참고 : 마취 된 마우스는 체온을 적절하게 유지할 수 없으므로 시간 경과를 위해 가열 된 환경이 필요합니다. 대물 히터는 열 팽창의 영향을 방지하는 데 도움이되며, 이는 대물 렌즈와 이미지화되는 조직이 열적 평형에 이르면서 z 초점에서 드리프트를 일으키는 현상입니다.
  2. 현미경 상의 가열 챔버가 30°C에서 안정화되면, 수용자 마우스를 2% 이소플루란의 마취기 설정과 2L/min의 산소 유량으로 마취시킨다.
  3. 마우스가 진정 된 후 (발가락 꼬집음에 대한 반응이 없음으로 확인), 면화 도포기와 유리 클리너로 MIW 유리 외부를 청소하고 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 추가하고 필요한 경우 꼬리 정맥 카테터를 삽입하십시오.
  4. 적절한 수화를 유지하기 위해, 꼬리 정맥 카테터를 통해 0.5 mL PBS를 피하 또는 100 μL의 초기 주사를 수득하였다. 이미징 세션 기간 동안 2시간마다 반복합니다.
  5. 마우스가 제대로 준비되면 이미징을 위해 현미경을 설정하십시오. 타임랩스 측정 중 증발을 줄이려면 침지 매체에 물 대신 수성 겔을 사용하십시오. 이것은 마우스를 무대에 놓기 전에해야합니다. 광학 구성 요소에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
  6. 마우스를 현미경 스테이지에 놓고 이소플루란 호스를 끼운 다음 MIW의 칼라를 스테이지 인서트의 14mm 수용 구멍으로 눌러 이미지를 안정화시킵니다. 현미경 안구를 사용하여 이미징 분야에 초점을 맞추고 밝은 필드 조명을 사용하여 혈류가있는 혈관 구조를 관찰하십시오.
  7. 시야의 안정성을 확인하십시오. 호흡 운동 유물이있는 경우 작은 거품 블록과 팅크 모양의 접착 테이프 조각으로 땀샘 뒷면에 부드러운 압축을 적용하십시오. 압축이 적용된 후, 시야각 전체에 혈류가 유지되는지 확인하십시오.
  8. 이미징 세션 동안 이소플루란 수준을 0.25% 증분으로 주기적으로 조절하여 동물의 호흡을 수동으로 계산하여 적절한 진정 수준을 유지합니다.
  9. 분당 36-40 회 호흡 속도 (rpm)를 유지하여 동물의 수명과 광학 이미징을 향상시킵니다. 호흡률이 낮을수록 마우스가 실험에서 살아남지 못할 수 있는 반면, 60rpm 이상의 호흡률은 진정 작용이 좋지 않아 이미지 데이터에서 호흡 및 모션 아티팩트가 증가할 수 있습니다.

4. 4D, 강도 기반, 라벨이없는 동적 세포 행동의 생체 내 이미징을 위해 설정

  1. 마우스가 진정되고 거꾸로 된 현미경 단계에 안전하게 배치되면 관심 영역을 찾기 시작하십시오.
  2. MIW를 향한 광원을 사용하여 현미경의 안구를 사용하여 조사를위한 잠재적 인 영역을 식별하십시오. 소프트웨어에서 x, y 위치를 추가하고 저장하여 이러한 위치로 돌아갑니다.
    참고 : 종양의 미세한 세부 사항은 이러한 유형의 조명으로 쉽게 볼 수 없습니다. 목표는 단순히 추가 조사를 위해 지역을 식별하는 것입니다. 초점은 혈관 구조와 혈류를 보는 것입니다.
  3. 소프트웨어에 여러 위치를 저장한 후 890nm 여기 및 FAD/SHG 필터 큐브를 사용하여 선택한 시야를 미리 봅니다. 낮은 전력과 높은 PMT 설정으로 4μs의 최대 유지 시간을 사용합니다. 목표는 과도한 레이저 빛에 조직을 과도하게 노출시키지 않고 시야를 미리 보는 것입니다.
  4. 적절한 전력 레벨이 설정되면 z-스택을 설정하십시오. MIW의 유리 표면 아래 20-50 μm에서 풍부한 콜라겐 섬유 (SHG)의 출현을 관찰하십시오. 콜라겐은 현미경 절편이 종양 깊숙이 들어감에 따라 덜 널리 퍼질 것이다(도 1B). SHG의 공극은 종양 덩어리의 위치를 나타냅니다.
  5. 첫 번째 콜라겐 섬유가 ~ 50-100 μm에서 나타나는 독방 세포 층 아래에 상단 Z 슬라이스를 설정하십시오. 하단 z-슬라이스를 ~250μm로 설정하면, 섬유가 페이드아웃되고 불량 신호가 지배적입니다. 저장된 모든 xy 위치에 대해 이 작업을 반복합니다.
  6. z-스택 범위가 설정되면 유지 시간(최대 8μs)을 늘리고 전력 및 검출기 설정을 최적화합니다. 필요에 따라 전력 수준을 최적화하여 각 실험에 대해 조직을 여기시킵니다. 목표물의 후면 조리개에서 750nm에서 최대 90mW 또는 890nm에서 70mW의 전력을 사용하는 것은 허용 가능한 범위 내에 있습니다.
    참고: 이미징 깊이, 조직 내 산란량, 객관적 특성 및 검출기 감도는 모두 이미지를 얻는 데 필요한 전력량에 큰 영향을 미칩니다.
  7. 실험 목표에 따라 시간 간격을 조정합니다. 대부분의 중요한 마이그레이션 동영상의 수집 지점 사이에 10분 간격으로 시작합니다.
  8. 2P 여기가 세포와 조직에 부드럽더라도 세포 출혈이나 급속하게 증가하는 자기 형광 및 과도한 광표백과 같은 광독성의 징후를 인식해야합니다. 레이저 파워를 줄이거나 조건에 따라 타임랩스 간격을 늘립니다.

5. NAD (P) H의 형광 수명 이미징 (FLIM)

  1. 타임랩스 획득에서 xy 위치를 유지하면서 FLIM 스택을 수집하도록 현미경을 설정합니다. GaAsP 검출기 앞의 필터 홀더에 440/80 필터를 삽입하고 소프트웨어에서 GaAsP 검출기 전압을 800으로 설정합니다. 감지기가 켜져 있을 때 실내 조명을 끕니다.
  2. 소프트웨어에서 갈바노미터 기반 강도 이미징에서 FLIM 이미징 모드로 전환합니다.
  3. 혈관 조직을 식별하고 마스킹하기 위해 해상도를 512 x 512 픽셀로 설정하십시오. 보완적인 대사 정보를 수집하려면 해상도를 256 x 256픽셀로 설정하여 평생 서명의 시간 해상도를 높입니다. 체류 시간을 4μs로 설정하고 레이저를 750nm로 조정합니다.
  4. 미리보기 스캔을 시작하고 레이저 파워를 조정하기 시작하십시오. 정수 분율 판별기(CFD)에 대한 판독값이 1 x 105 와 1 x 10 6 사이가 될 때까지 레이저 파워를 조정합니다. 1 x 106 을 초과하지 마십시오.이 경우 광자 더미가 생기고 전반적인 결과가 좋지 않습니다.
  5. 전원 레벨이 설정되면 통합 시간을 90초에서 120초 사이로 설정하고 FLIM 컬렉션을 시작합니다. 할당 된 시간 동안 시야에서 광자를 획득합니다.
  6. 선택 사항: 필요한 모든 수집이 이루어지고 마우스를 스테이지에서 제거한 후 IRF(계측기 응답 기능)를 수집합니다. 동일한 파라미터를 갖는 유리 바닥 접시에서 시판되는 요소 결정의 표면을 이미징하여 IRF를 측정하고 조직을 이미징하는 데 사용되는 설정을 설정합니다.
    참고: IRF는 전자 또는 광학 설정으로 인한 지연 또는 반사를 설명합니다. IRF는 모든 FLIM 획득에 휘말리며, 데이터로부터 IRF를 디컨볼빙하면 계산된 형광 붕괴 곡선의 정확도를 향상시킬 수 있습니다. 즉, 계산 된 IRF는 종종 측정 된 IRF로부터 형광 붕괴 곡선의 품질을 합리적으로 복제 할 수 있습니다. 계산된 IRF가 붕괴 곡선의 등가 적합치를 산출하고 측정된 IRF의 결과를 적절하게 근사화할 것으로 결정될 때까지 IRF를 측정하는 것이 좋습니다.

6. NADH 평생 이미지 분석

  1. FLIM 소프트웨어를 열고 데이터 세트에서 NAD(P)H 수명 이미지를 가져옵니다. 소프트웨어를 올바르게 사용하는 방법에 대한 자세한 내용은 형광 수명 핸드북(자료표 참조)을 참조하십시오.
  2. 시작하려면 소프트웨어에서 모델 매개 변수를 정의합니다. 메뉴 모음에서 모델 옵션> 클릭합니다. 다중 지수 감쇠> 설정, MLE> 공간 비닝 > 정사각형, 임계값 > 피크 설정 및 이미지 계산 전에 시프트 수정을 선택합니다.
  3. 메뉴 모음의 색> 드롭다운 메뉴에서 A1% 를 클릭합니다. 창의 오른쪽에서 세 가지 구성 요소 맞춤으로 정의합니다. 빈 크기를 3> 설정합니다.
  4. 임계값을 ~10> 조정합니다. 감쇠 행렬이 처음으로 계산된 후 임계값 정확도를 재평가합니다.
  5. τ1을 200ps로 고정합니다. 이것은 적혈구의 짧은 수명을 나타냅니다. 강도 이미지에서 볼 수있는 더 큰 혈관의 여러 반점과 가장 잘 일치하는 값을 찾으십시오. τ2를 1200ps로 고정합니다. 이것은 적혈구의 긴 수명을 나타냅니다.
    참고: 설정 값은 시작점에 불과합니다. 이 값은 혈관구조를 더 많이 끌어내기 위해 최적화되어야 할 것이다. 대부분의 경우 항상 그렇지는 않지만 이러한 값은 감소합니다.
  6. 메뉴 모음의 계산 에서 축소 행렬을 선택합니다. 이것은 높은 값을 갖는 혈관구조를 갖는 초기 A1% 수명 이미지를 생성할 것이다. 커서 (십자선)를 사용하여 혈관 구조 위로 마우스를 가져갑니다. 체계적으로 그리고 한 번에 하나씩 τ1과 τ2를 플로트 ( 수정 상자의 선택 취소)하십시오. 고정 매개 변수를 최적화하는 데 도움이 되므로 이러한 값을 기록합니다.
    참고 : 목표는 반드시 이미지에서 가장 정확한 값을 얻는 것이 아니라 혈관 구조로 확인 된 영역을 극적으로 줄이지 않고 혈관 구조와 조직 간의 불균형을 극대화하는 것입니다.
  7. τ1 및 τ2에 대한 적절한 매개변수가 식별되면 메뉴 막대에서 일괄처리 계산 > 선택합니다. 대부분의 설정이 z-슬라이스 간에 유사한지 확인하십시오.
  8. 다른 설정과 크게 다른 설정이 없는지 확인하십시오. 그렇다면 먼저 시프트를 조정하고 다시 시도하십시오. 문제가 지속되면 새 매개 변수를 사용하여 다시 시도합니다. 잘못된 이동은 적합도에서 소음의 큰 원인이 될 수 있으며 인접한 종양 영역에서 A1 % 값을 증가시킬 수 있습니다.
  9. 메뉴 탭에서 파일을 저장한 다음 A1% 파일을 내보냅니다. 마스킹 및 세분화를 위해 ImageJ에 이러한 파일을 업로드합니다.

7. 혈관구조의 이미지 세분화

  1. ImageJ를 열고 A1% 이미지를 텍스트 이미지로 가져옵니다. 스택 내의 모든 이미지에 대해 이 작업을 반복합니다.
  2. 모든 A1% 이미지를 연 상태에서 Z-프로젝트> 스택 > 이미지를 선택합니다. 최대 강도 투영을 사용하여 이미지를 저장합니다. 대표 이미지는 보충 데이터 1 을 참조하십시오.
  3. 플러그인 > 세분화로 이동하십시오. 훈련 가능한 WEKA 세분화 플러그인38을 선택하십시오.
  4. WEKA 창이 열리면 기본 설정을 사용하고 혈관 구조 (높은 A 1 % 영역)와 비 혈관 구조 (낮은 A1 % 영역)에 대해 두 개의 클래스와 추적 라인을 만들어 소프트웨어 교육을 시작하십시오.
  5. 소프트웨어가 배경 소음의 더 높은 영역을 제거하면서 혈관의 높은 A1 % 영역을 일관되게 식별 할 때까지 두 클래스에 새로운 흔적을 계속 추가하십시오. 대표 적인 분류자 모델에 대해서는 보충 모델을 참조하십시오.
  6. 분류 된 이미지가 생성되면 이미지 > 유형 > 8 비트를 클릭하십시오. 이미지를 임계값으로 설정하고 마스크를 만듭니다. 임계값이 지정된 이미지를 추가로 정리해야 하는 경우 파티클 분석 기능을 사용합니다.
  7. 임계값 이미지의 더 작고 원형 영역이 제외될 때까지 크기와 원형을 조정합니다. 혈관 구조와 배경이 거의없는 깨끗한 마스크가 얻어집니다.
  8. 선택 > 편집을 클릭>여 선택 항목을 만듭니다. ROI 관리자에서 분석 도구 >를 클릭하여 선택> ROI 관리자에게 전송합니다.
  9. 분류된 이미지를 복제합니다. 바이너리 처리로 진행>십시오. 마스크를 확장하고 이미지 분할에 포함될 혈관구조로부터의 거리를 정의하려면 딜레이트를 선택합니다. 마스크가 원하는 범위로 확장될 때까지 반복합니다. 이 관심 영역(ROI)을 ROI 관리자에 기록합니다.
    참고: 이 단계의 목표는 혈관의 특정 근접성 내에서의 양 또는 거동을 정량화하는 것입니다(예를 들어, 혈관의 X μm 내에 존재하는 세포의 수). 필요한 팽창의 양은 전적으로 과학적 질문에 의해 결정됩니다.
  10. 제한 영역 내의 셀 수를 정량화하려면 관심 있는 창(이미지/채널)을 선택합니다. 이것은 혈관 마스크와 동일한 시야각을 공유하는 모든 창일 수 있습니다. 드롭다운 메뉴에서 XOR 기능을 사용하여 ROI를 모두 적용합니다.
    참고 :이 수술은 혈관 구조 자체를 제외한 혈관 구조에서 원하는 거리 내의 항목을 측정합니다. 이 결합 된 ROI 접근 방식을 사용하여 강도, 셀 수 또는 이동과 같은 다양한 매개 변수를 측정 할 수 있습니다.

8. 종양 둥지의 이미지 세분화

  1. ImageJ의 고해상도 강도 스캔 또는 FLIM 컬렉션에서 NADH 이미지를 엽니다.
    참고: 이 작업은 개별 z-슬라이스, 전체 스택에서 수행하거나 몇 슬라이스의 z-프로젝션에 적용할 수 있습니다.
  2. 플러그인 > 세분화로 이동하십시오. 교육 가능한 WEKA 세분화 플러그인을 선택합니다.
  3. WEKA 창이 열리면 기본 설정을 사용하고 NADH 상위 지역과 NADH 낮은 지역의 두 클래스로 소프트웨어를 훈련시키기 시작합니다. NADH-high 영역은 핵을 가진 세포의 매우 식별 가능한 패턴을 가질 것이며 소프트웨어는 그것을 쉽게 식별 할 것입니다.
  4. 오버레이를 앞뒤로 계속 토글하여 눈과 종양 형태에 대한 사전 지식에 의해 결정된 종양의 모든 영역을 인식 할 때까지 추가 훈련으로 알고리즘을 구체화하십시오. 이것은 반복적 인 프로세스입니다.
  5. 알고리즘이 종양의 모든 영역을 인식하면 결과 만들기 버튼을 선택합니다. 그러면 새 이미지가 생성됩니다. 이 이미지를 복제하십시오.
  6. 첫 번째 중복 된 이미지를 선택하고 8 비트 의 이미지 > 유형 > 선택하여 8 비트 이미지로 변환하십시오. 이 이미지를 임계값으로 설정하여 이진 마스크를 만듭니다. 그런 다음 선택 항목을 만들어 ROI 관리자로 전송합니다. 이러한 ROI는 스트로마를 정의합니다.
  7. 중복 된 이미지 중 두 번째 이미지를 선택하고 8 비트 이미지로 변환하십시오. 이미지 > 편집 > 반전을 선택하여 이 이미지를 반전시킨 다음 이 이미지를 임계치로 설정하여 이진 마스크를 만듭니다. 다시 한 번 선택 항목을 만들어 ROI 관리자에게 전송하십시오. 이 ROI는 종양 둥지를 정의합니다.

9. 섬유 조직 또는 정렬에 의한 이미지 분할

  1. 시작하려면 SHG 이미지를 열고 z-프로젝션을 준비한 다음 전처리의 필요성을 평가합니다. 좋은 결과를 얻으려면 식별 가능한 섬유와 저잡음이 있는 고품질 이미지가 필요합니다.
  2. 선택 사항: SHG 채널의 신호 대 잡음(SNR)을 증가시키기 위해 ImageJ에서 전처리하려면 롤링 볼 빼기를 사용하여 배경을 뺍니다. 대부분의 응용 프로그램에서는 20픽셀에서 50픽셀 사이의 롤링 볼 빼기를 사용합니다. 그런 다음 이미지를 부드럽게하고 저장하십시오.
  3. OrientationJ 플러그인을 열고 처리 매개 변수를 설정하십시오. OrientationJ 창에서 로컬 텐서 창의 크기를 정의합니다. 이 광섬유 밀도의 20x 이미지의 경우 10픽셀을 15픽셀로 시작점으로 설정합니다.
  4. 큐 빅 스플라인을 그라디언트 모델로 선택하고 색상 조사 상자를 선택합니다. 색상 설문 조사를 정의합니다. 색조 와 채도를 모두 일관성으로 설정 한 다음 밝기 를 원본 이미지로 정의하고 실행을 누르십시오.
  5. 플러그인의 출력 파일은 RGB 컬러맵입니다. 눈에 의해 결정된 정렬된 영역이 파란색 및 자홍색 색조로 제대로 강조 표시될 때까지 로컬 텐서 창의 값을 조정합니다.
  6. 출력 이미지가 만족스러우면 이 RGB 이미지를 3개의 채널로 분리합니다. 분할 채널> 이미지 >색을 선택합니다.
  7. 마스킹을 위해 정렬된 영역의 모양을 향상시키려면 이미지 계산기 > 처리를 선택하여 이미지 계산기를 사용합니다. 이 연산자를 사용하여 파란색 이미지에서 녹색 이미지를 뺍니다. 보다 제한적인 마스크를 사용하려면 빨간색 이미지에서 녹색 이미지를 뺍니다. 임의의 영역의 경우 녹색 채널에서 파란색 채널을 뺍니다.
  8. 모멘트 알고리즘을 사용하여 결과 이미지의 임계값을 지정합니다. 대부분의 경우 추가 조정이 필요하지 않습니다. 그러나 필요한 경우 조정하십시오. 그러면 이진 이미지가 생성됩니다.
  9. 이진 이미지가 만들어지면 파이버 사이> 이진 > 채우기 구멍에서 프로세스를 선택하여 구멍을 채우 고 중앙값 필터를 사용하여 마스크의 경계를 반올림합니다. 10의 중앙값 필터는 좋은 출발점이며 데이터에 적합하도록 조정하십시오. 마스크에 동의가 있는지 수동으로 검사하고 잘못된 ROI를 제거합니다.
  10. 마스크가 만족스러우면 선택 편집 > 선택 항목 만들기를 선택하여 선택 영역> 만듭니다. 이 선택 항목을 ROI 관리자에게 전송하십시오.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

MIW의 설치 및 기본 실험 계획은이 과정의 첫 번째 단계입니다. 이 특별한 MIW 설계 및 프로토콜은 종단 연구19 에 더 적합하며 직립 및 반전 현미경 모두에서 성공적으로 활용되었습니다. 이 경우, 거꾸로 된 현미경이 사용되었는데, 이는 더 적은 호흡 아티팩트로 유선의 더 큰 이미지 안정성을 가져 왔기 때문입니다. 그림 1A에서는 경질 MIW의 치수와 이식 과정의 그래픽 개요를 제공합니다.

라벨이 없는 MMTV-PyMT39 유방 종양 내의 전형적인 시야(도 1B-E, 도 3A)는 콜라겐 섬유, 수많은 기질 세포, 종양 세포의 질량, 및 혈관구조로 구성된 매우 이질적이다(도 3A).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

4D 생체 내 영상화는 천연 종양 미세환경의 공간적 및 시간적 맥락 내에서 역동적인 생리학적 상호작용을 조사하는 강력한 도구이다. 이 원고는 종양 질량, 인접한 스트로마 또는 두 번째 고조파 생성 또는 NAD(P)H 자가형광으로부터의 내인성 신호만을 사용하여 혈관 네트워크에 근접한 내에서 동적 세포 상호작용을 구획화하는 매우 기본적이고 적응 가능한 작동 프레임워크를 제공한다. 이 프로토콜은 이미징 윈도우의 이식에서 이미지 획득, 분석 및 세분화에 이르기까지 포괄적이고 단계별 방법을 제공합니다. 우리는이 기술이 4D 생체 내 데이터를 분류하고 정량화하는 데 필요한 분석 프레임 워크에 기여할 것이라고 믿습니다.

이 프로토콜은 표지되지 않은 PDX 모델을 포함한 수많은 생체내 마우스 모델과 광범위하게 호환되도록 개발되었다. PDX는 믿을 수 없을 정도로 유익한 모델(45)이지만, PDX 모델의 성질이 유전자 조작에 적합하지 않기 때문에 생체내...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

저자는이 작업에 대한 NCI R01 CA216248, CA206458 및 CA179556 보조금을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 Kevin Eliceiri 박사와 그의 이미징 그룹이 우리의 intravital 프로그램의 초기 개발에 대한 기술적 전문성을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 벤 콕스 박사와 Morgridge Institute for Research의 Eliceiri Fabrication Group의 다른 회원들에게 MIW의 초기 단계에서 필수적인 기술 설계에 감사드립니다. Ellen Dobson 박사는 ImageJ 교육 가능한 WEKA 세분화 도구에 대한 유용한 대화를 도왔습니다. 또한 현미경을 적시에 사용해 주신 Melissa Skala 박사와 Alexa Barres-Heaton 박사에게 감사드립니다. 마지막으로, 우리는 마우스 취급 및 관리에 대한 모든 사려 깊은 토론과 조언에 대해 Brigitte Raabe, D.V.M 박사에게 감사드립니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
#1.5 12mm 원형 커버 유리Warner Instruments# 64-0712MIW 구조
SQ 주입용 1.0mL 주사기BD309659사기
20x 대물렌즈Zeiss421452-988수침
27G 바늘Covidien1188827012바늘
40x 대물렌즈NikonMRD77410Water Immersion
5-0 실크 꼰 봉합EthiconK870MIW 이식용 봉합
인공 눈물 젤AkornNDC 59399-162-35아이 젤
베타딘 솔루션, 5%Fisher ScientificNC1558063수술 방부제
면 팁 애플리케이터Fisher Scientific23-400-101
시아노아크릴레이트 접착제Loctite1365882MIW 구조
형광 덱스트란SigmaT1287-50mg혈관 겸자의 정맥 주사 라벨링
Mckesson.comMiltex #18-782스테인리스, 4인치, 곡선
GaAsP 광전자 증배관Hamamatsu 
난방 담요CARA 72 난방 패드  038056000729온도 선택 가능한
가열 챔버가정용 형
광 수명 핸드북Becker and Hicklhttps://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
도립 현미경 베이스Nikon
IsofluraneAkornNDC 59399-106-01마취
Liqui-NoxFisher 과학적인16-000-125MIW 청소
MeloxicamNorbrookNDC 55529-040-10진통제
마이크로 호스과학적인 필수품 INC.  BB31695-PE/1
다광자 스캔 헤드Bruker Ultima II다광자 스캔 헤드 및 이미징 플랫폼
NADH FLIM 필터Chroma284994ET 440/80 m-2P
NairCVS339826제모 크림
대물 히터Tokai HitSTRG-WELSX-SET
SHG/FAD 필터Chroma320740ET450/ 40m-2P
스파클 유리 세정제B00814ME24Amazon.com이식 된 MIW
SPC-150 광자 계수 보드베커와 히클
수술 용 유리 세정제FAJB06XV1VQVZ마그네틱 LED 구즈넥 라이트
외과 마이크로 가위Excelta366스테인리스, 3 인치
트리플 항생제 연고Actavis 제약NDC 0472-0179-34항생제
TV 카테터사용자 정의BD 30G 바늘 :TV 주입 용 305106 카테터
2 광자 필터크로마320282 ET585 / 65m-2P
2 광자 레이저코 히어 런트 샤멜레온조정 가능한 다중 광자 레이저
초음파 젤ParkerPKR-03-02침수 젤
우레아 결정시그마U5128-5G옵션: FLIM IRF
주 SQ 주입용 사 사

참고문헌

  1. Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (3), 171-198 (2019).
  2. Afik, R., et al. Tumor macrophages are pivotal constructors of tumor collagenous matrix. The Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2315-2331 (2016).
  3. Varol, C., Sagi, I. Phagocyte-extracellular matrix crosstalk empowers tumor development and dissemination. The FEBS Journal. 285 (4), 734-751 (2018).
  4. Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., Werb, Z. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nature Communications. 11 (1), 5120(2020).
  5. Han, W., et al. Oriented collagen fibers direct tumor cell intravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11208-11213 (2016).
  6. Malandrino, A., Mak, M., Kamm, R. D., Moeendarbary, E. Complex mechanics of the heterogeneous extracellular matrix in cancer. Extreme Mechanics Letters. 21, 25-34 (2018).
  7. Lugo-Cintrón, K. M., et al. Breast Fibroblasts and ECM Components Modulate Breast Cancer Cell Migration Through the Secretion of MMPs in a 3D Microfluidic Co-Culture Model. Cancers. 12 (5), 1173(2020).
  8. Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. The Journal of Cell Biology. 163 (3), 583-595 (2003).
  9. Zhang, K., et al. The collagen receptor discoidin domain receptor 2 stabilizes SNAIL1 to facilitate breast cancer metastasis. Nature Cell Biology. 15 (6), 677-687 (2013).
  10. Malik, G., et al. Plasma fibronectin promotes lung metastasis by contributions to fibrin clots and tumor cell invasion. Cancer Research. 70 (11), 4327-4334 (2010).
  11. Bae, Y. K., Choi, J. E., Kang, S. H., Lee, S. J. Epithelial-mesenchymal transition phenotype is associated with clinicopathological factors that indicate aggressive biological behavior and poor clinical outcomes in invasive breast cancer. Journal of Breast Cancer. 18 (3), 256-263 (2015).
  12. Wei, S. C., et al. Matrix stiffness drives epithelial-mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1-G3BP2 mechanotransduction pathway. Nature Cell Biology. 17 (5), 678-688 (2015).
  13. Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophysical Journal. 107 (11), 2546-2558 (2014).
  14. Carey, S. P., et al. Local extracellular matrix alignment directs cellular protrusion dynamics and migration through Rac1 and FAK. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 8 (8), 821-835 (2016).
  15. Ray, A., Morford, R. K., Ghaderi, N., Odde, D. J., Provenzano, P. P. Dynamics of 3D carcinoma cell invasion into aligned collagen. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 10 (2), 100-112 (2018).
  16. Szulczewski, J. M., et al. Directional cues in the tumor microenvironment due to cell contraction against aligned collagen fibers. Acta Biomaterialia. 129, 96-109 (2021).
  17. Esbona, K., et al. The Presence of Cyclooxygenase 2, Tumor-Associated Macrophages, and Collagen Alignment as Prognostic Markers for Invasive Breast Carcinoma Patients. The American Journal of Pathology. 188 (3), 559-573 (2018).
  18. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  19. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  20. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
  21. Boone, P. G., et al. A cancer rainbow mouse for visualizing the functional genomics of oncogenic clonal expansion. Nature Communications. 10 (1), 5490(2019).
  22. Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  23. Leung, E., et al. Blood vessel endothelium-directed tumor cell streaming in breast tumors requires the HGF/C-Met signaling pathway. Oncogene. 36 (19), 2680-2692 (2017).
  24. Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: Bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of The American Society of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
  25. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Research. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  26. Baklaushev, V. P., et al. Modeling and integral X-ray, optical, and MRI visualization of multiorgan metastases of orthotopic 4T1 breast carcinoma in BALB/c Mice. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 158 (4), 581-588 (2015).
  27. Baklaushev, V. P., et al. Luciferase Expression Allows Bioluminescence Imaging But Imposes Limitations on the Orthotopic Mouse (4T1) Model of Breast Cancer. Scientific Reports. 7 (1), 7715(2017).
  28. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  29. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 16007(2014).
  30. Liu, Y., et al. Fibrillar Collagen Quantification With Curvelet Transform Based Computational Methods. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 198(2020).
  31. Püspöki, Z., Storath, M., Sage, D., Unser, M. Transforms and Operators for Directional Bioimage Analysis: A Survey. Advances in Anatomy, Embryology, and Cell Biology. 219, 69-93 (2016).
  32. Saytashev, I., et al. Multiphoton excited hemoglobin fluorescence and third harmonic generation for non-invasive microscopy of stored blood. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3449-3460 (2016).
  33. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  34. von Au, A., et al. Circulating fibronectin controls tumor growth. Neoplasia. 15 (8), New York, N.Y. 925-938 (2013).
  35. Murgai, M., et al. KLF4-dependent perivascular cell plasticity mediates pre-metastatic niche formation and metastasis. Nature Medicine. 23 (10), 1176-1190 (2017).
  36. You, S., et al. Intravital imaging by simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2125(2018).
  37. Yakimov, B. P., et al. Label-free characterization of white blood cells using fluorescence lifetime imaging and flow-cytometry: molecular heterogeneity and erythrophagocytosis. Biomedical Optics Express. 10 (8), 4220-4236 (2019).
  38. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), Oxford, England. 2424-2426 (2017).
  39. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
  40. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38(2006).
  41. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1221-1232 (2011).
  42. Szulczewski, J. M., et al. In Vivo Visualization of Stromal Macrophages via label-free FLIM-based metabolite imaging. Scientific Reports. 6, 25086(2016).
  43. Hoffmann, E. J., Ponik, S. M. Biomechanical Contributions to Macrophage Activation in the Tumor Microenvironment. Frontiers in Oncology. 10, 787(2020).
  44. Pakshir, P., et al. Dynamic fibroblast contractions attract remote macrophages in fibrillar collagen matrix. Nature Communications. 10 (1), 1850(2019).
  45. Dobrolecki, L. E., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models in basic and translational breast cancer research. Cancer and Metastasis Reviews. 35 (4), 547-573 (2016).
  46. Shirshin, E. A., et al. Two-photon autofluorescence lifetime imaging of human skin papillary dermis in vivo: assessment of blood capillaries and structural proteins localization. Scientific Reports. 7 (1), 1171(2017).
  47. Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

2NADPH
유방 종양 미세환경의 생체 내 이미징을 위한 라벨 없는 세분화 접근법
문의하기
사서에게 추천하기

개인정보

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.