Micro-CT는 식물 구조를 3차원으로 분석할 수 있는 비파괴 도구입니다. 현재 프로토콜은 기생 식물 구조 및 기능을 분석하기 위해 마이크로 CT를 활용하기 위한 샘플 준비를 설명합니다. 특정 제제와 결합 될 때이 방법의 장점을 강조하기 위해 다른 종이 사용됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
마이크로 CT 스캐닝은 식물의 구조와 기능을 조사하는 데 확립된 도구가 되었습니다. 3차원 시각화 및 가상 절편의 가능성과 결합된 비파괴적 특성으로 인해 복잡한 식물 기관에 대한 새롭고 점점 더 상세한 분석이 가능해졌습니다. 기생 식물과 숙주 사이를 포함하여 식물 간의 상호 작용도 탐구할 수 있습니다. 그러나 스캐닝 전 샘플 준비는 종종 조직 조직과 구성이 다른 이들 식물 간의 상호 작용으로 인해 중요합니다. 또한, 기생충 숙주 물질의 샘플링, 처리 및 준비 중에 고도로 감소된 식물체에서 나무, 허브 및 관목에 이르기까지 기생 꽃 식물의 광범위한 다양성을 고려해야 합니다. 여기에서는 haustorium 분석에 초점을 맞춰 기생충 및/또는 숙주 식물에 대조 용액을 도입하기 위한 두 가지 다른 접근 방식을 설명합니다. 이 기관은 두 식물 사이의 연결과 의사 소통을 촉진합니다. 간단한 접근 방식에 따라 euphytoid, 포도 나무 및 겨우살이 기생 종에 대해 여기에 표시된 것처럼 haustorium 조직 조직의 세부 사항을 3차원으로 탐색할 수 있습니다. 특정 조영제 및 적용 접근법을 선택하면 숙주 체내 기생충 확산을 자세히 관찰하고 여기에 표시된 것처럼 기생충과 숙주 사이의 직접적인 혈관 간 연결을 감지할 수 있습니다. 따라서 여기에서 논의된 프로토콜은 기생 꽃 식물의 광범위한 다양성에 적용하여 발달, 구조 및 기능에 대한 이해를 높일 수 있습니다.
서론
고해상도 X선 마이크로컴퓨터 단층촬영(micro-CT)은 샘플의 여러 방사선 사진(투영)을 서로 다른 시야각에서 기록하고나중에 샘플의 가상 재구성을 제공하는 데 사용하는 이미징 방법입니다1. 그런 다음 이 가상 개체를 분석, 조작 및 분할하여 3차원에서 비파괴 탐색이 가능합니다2. 처음에는 의료 분석용으로 설계되었다가 나중에는 산업 응용 분야를 위해 설계된 micro-CT는 침습적 절차 없이 내부 장기와 조직을 시각화할 수 있는 이점도 제공합니다3. 다른 형태의 이미징과 마찬가지로 마이크로 CT는 시야와 픽셀 크기 사이의 균형을 유지하므로 큰 샘플의 고해상도 이미징은 거의 달성할 수 없습니다4. 고 에너지 X 선 소스 (즉, 싱크로트론) 및 2 차 광학 배율 사용의 발전이 지속적으로 이루어지고 있으며, 가장 작은 해상도가 100 nm 5,6 미만에 도달 할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 큰 샘플의 경우 더 긴 스캔 시간이 필요하므로 스캐너 내부의 샘플 이동 또는 변형으로 인한 아티팩트 가능성이 높아집니다. 또한 마이크....
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프로토콜
1. 기생 식물 샘플 선택
- 부착된 숙주 줄기/뿌리 및 기생된 숙주 기관의 근위 및 원위 말단의 세그먼트를 포함하여 전체 기생 식물 haustorium을 수집합니다. 각 세그먼트의 이상적인 길이는 하우스 토리움 직경의 두 배에 해당합니다.
참고: 외측 haustoria의 경우 haustorium이 형성된 기생충 모체 줄기/뿌리의 일부를 포함합니다(그림 1A,B,D). 내부 기생충의 경우 기생충의 징후가 보이는 숙주 줄기/뿌리의 세그먼트를 수집합니다(그림 1B). 단자 연결의 경우 전체 플랜트를 수집해야 합니다(그림 1E). - 전체 샘플을 고정 용액(예: FAA)에 1:10의 부피 비율로 담그십시오(샘플: 고정액). 샘플의 크기에 따라 최소 1일 동안 샘플을 고정액에 두십시오27.
참고: 샘플은 스캔하기 전에 고정액에 보관하거나 보존 용액(예: 에탄올 70%)으로 옮길 수 있습니다. 후속 해부학적 분석이 보증되지 않는 경우에도 신선한 샘플을 사용할 수 있습니다(토론 섹션 참조). 신선한 재료....
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결과
기생 식물의 하우스토리엄(haustorium)은 숙주(host20)로 사용되는 다른 식물의 조직과 서로 얽히고 연결되는 상이한 조직 및 세포 유형을 포함하는 복잡한 기관이다. Micro-CT 스캐닝은 소형(그림 1A-C)과 대형(그림 1D,E)을 모두 분석할 때 비파괴적이고 3차원적인 방식으로 이 복잡한 구조를 더 잘 이해하는 데 활용할 수 있습니다. 이를 위해 대조 용액을 기생충-숙주 인터페이스에 적용할 수 있으므로 그렇지 않으면 X선 흡수가 낮고 균일한 샘플을 분석할 수 있습니다. 이 프로토콜에 설명된 두 가지 간단한 접근 방식은 샘플을 통한 침투를 가속화하기 위해 대조 용액에 압력을 가하는 데 의존합니다. 예상대로 여기에 설명된 프로토콜은 다양한 마이크로 CT 시스템에서 작동합.......
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토론
식물 조직 대비를 개선하기 위해 중금속 용액을 사용하는 것은 마이크로 CT 분석을 위한 샘플 준비에서 중요한 단계가 되었습니다. Staedler et al.은 식물 미세 형태학 실험실에서 일반적으로 사용할 수있는 몇 가지 화합물을 테스트했으며, 샘플을 관통하고 대비 지수를 높이는 데 가장 효과적인 약제로 포스 포 텅스텐 산염을 사용할 것을 권장합니다8. P. pubera 의 하우스 토리움 분석에서 얻은 결과는이 권장 사항을 뒷받침합니다. 조영제 적용의 관점에서, Steadler et al. 조영제가 1일에서 8일 동안 분석된 물질(1mm에서 10mm 범위의 꽃과 꽃봉오리)을 통해 수동적으로 침투되었다고 설명한다8. 다른 저자들은 내부 기생충 Rafflesiaceae종 28의 30cm 너비의 꽃과 같은 더 큰 샘플을 분석 할 때 장기간(1-4주)에 걸쳐 동일한 수동 침투 프로토콜을 사용했.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
다양한 현미경 촬영 시스템 및 데이터 분석 소프트웨어에 대한 최고의 도움과 필수 사용자 교육을 제공한 Simone Gomes Ferreira 박사(브라질 상파울루 대학교 현미경 촬영 실험실)와 Greg Lin 박사(미국 하버드 대학교 나노스케일 시스템 센터)에게 감사드립니다. 또한 미국 코네티컷 대학의 EEB 온실 직원, 특히 최소 비스쿰 표본을 제공한 클린턴 모스와 매튜 오펠에게도 감사드립니다. John Wenzel 박사는 Pyrularia pubera의 샘플링에 대한 기회와 큰 도움을 제공했습니다. 석사 Carolina Bastos, 석사 Yasmin Hirao 및 Talitha Motta는 Scybalium fungiforme의 샘플링에 큰 도움을 주었습니다. 석사 Ariadne Furtado, Drs. Fernanda Oliveira와 Maria Aline Neves는 내생 균류 분석을 위한 플록신 B의 사용에 대한 참고 자료를 제공했습니다. Vrije Universiteit Brussel의 비디오 녹화는 Philippe Claeys 박사, Christophe Snoeck 박사, Jake Griffith 박사, Barabara Veselka 박사 및 Harry Olde Venterink 박사의 도움으로 가능했습니다. 자금은 고등 교육 인....
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 3D X선 현미경(XRM) 시스템 | Zeiss Versa 620 | Pyrularia pubera | |
| 3D X선 현미경 + A2:D22 | Zeiss | Versa 620 | 종 스캔에 사용 P. pubera |
| CT-Pro 3D 소프트웨어 | Nikon | 버전 XT 3.1.11 | 스캔의 3차원 재구성에 사용 |
| CT-Vox 소프트웨어 | Bruker | 버전 3.3.1 | 이미지 및 비디오의 분석 및 획득에 사용됨 |
| Dragonfly 소프트웨어 | Object Research Systems - ORS | 버전 | 이미지 및 비디오의 분석 및 획득에 사용됨 |
| Glass vials | Glass Vials Inc. SE | V2708C-FM-SP | VWR - USA에서 판매; 바이알이 약 10psi의 진공을 견딜 수 있는지 확인 |
| Inspect-X | Zeiss | 버전 XT 3.1.11 | Nikon X-Tek HMXST225 시스템 제어에 사용 |
| 요오드 용액 0.0282 N | WR Chemicals BDH | BDH7422-1 | VWR에서 판매 - 미국 |
| Lead Nitrate II PA 500 g | Vetec | 361.08 | SPLab |
| Microtomography scanner | Bruker | Skyscan1176 | C. americana, S. martianus, 및 S. fungiforme |
| Microtomography scanner | Nikon | X-Tek HMXST225 | 종 스캔에 사용 V. 최소 |
| NRecon 소프트웨어 | Bruker | 버전 1.0.0 | 3차원 재구성에 사용 |
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| 스캐닝 시스템 | Nikon X-Tek HMXST225 < | em>Viscum minimum | |
| 스캐닝 시스템 | Bruker Skyscan 1176 | C. americana< / em> | |
| Scout-and-ScanTM 소프트웨어 | Zeiss | 버전 16 | Zeiss Versa 620 시스템 제어 및 스캔의 3 차원 재구성에 사용 |
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| VG Studio Max 소프트웨어 | Volume Graphics | 버전 3.0 | 이미지 및 비디오의 분석 및 획득에 사용됩니다 |
참고문헌
- Stock, S. R. Microcomputed tomography: Methodology and applications. , CRC Press/Taylor and Francis. Boca Raton, FL. (2020).
- Hounsfield, G. N. Computerized transverse axial scanning (tomography): I. Description of system. British Journal of Radiology. 46 (552), ....
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재인쇄 및 허가
