설치류의 외과적으로 유도된 녹내장에 대한 Limbal Vascular Plexus의 전체 원형 소작

요약

이 프로토콜의 목표는 아급성 안구 고혈압을 유발하는 변연 혈관 신경총의 360° 열 소작을 기반으로 하는 녹내장 신경 퇴행의 새로운 모델을 특성화하는 것입니다.

초록

전 세계적으로 실명의 두 번째 주요 원인인 녹내장은 시신경 및 망막 신경절 세포(RGC) 변성의 구조적 손상을 특징으로 하는 이질적인 안구 질환군으로, 눈에서 뇌로의 시각 정보 전달을 방해하여 시각 기능 장애를 초래합니다. 안압 상승은 가장 중요한 위험 요소입니다. 따라서 안구 고혈압의 여러 모델은 질병의 원인과 효과를 조사하기 위해 유전적 또는 실험적 접근 방식으로 설치류에서 개발되었습니다. 그 중 외과적 침습성, 부적절한 기능 평가, 광범위한 교육의 필요성, 망막 손상의 매우 다양한 확장과 같은 몇 가지 제한 사항이 보고되었습니다. 본 연구는 수액 배출의 주요 구성 요소인 윤부 혈관 신경총의 저온, 전원형 소작을 기반으로 설치류에서 안구 고혈압을 유도하는 간단하고 저렴하며 효율적인 방법을 특성화합니다. 새로운 모델은 진행성 망막 신경절 암 및 시신경 변성과 관련된 기술적으로 쉽고 비침습적이며 재현 가능한 아급성 안구 고혈압과 전기 생리학적 및 행동적 방법 모두에 의한 생체 내 기능 연구를 가능하게 하는 독특한 수술 후 임상 회복률을 제공합니다.

서론

의학 문헌에서는 녹내장을 망막 신경절 세포(RGC), 수상돌기, 소마, 축삭돌기의 점진적인 변성을 특징으로 하는 이질적인 시신경병증 그룹으로 이해하며, 이로 인해 시신경의 구조적 부항(굴착)과 시신경의 기능적 저하가 발생하여 눈에서 뇌로의 시각 정보 전달을 방해하여 조절되지 않는 경우 무뇨증을 유발합니다¹. 녹내장은 현재 전 세계적으로 돌이킬 수 없는 실명의 가장 흔한 원인으로, 2040년에는 약 1억 1,180만 명이 이를 것으로 예상됩니다² 따라서 환자의 삶의 질(QoL)에 큰 영향을 미치고 심각한 사회경제적 문제를 야기합니다³.

안압 상승(IOP)은 녹내장의 발병과 진행에 있어 가장 중요하고 유일하게 수정할 수 있는 위험 요인 중 하나입니다. 여러 유형의 녹내장 중에서 정상 긴장성 녹내장(NTG)을 제외한 모든 녹내장은 질병의 임상 병력에서 어느 시점에 상승된 안압과 관련이 있습니다. IOP를 표적으로 삼고 질병 진행을 늦추거나 멈추기 위한 임상 및 수술의 놀라운 발전에도 불구하고 환자들은 여전히 녹내장으로 인해 시력을 잃습니다 ^4,5

프로토콜

모든 절차는 시력 및 안과 연구 협회(ARVO)의 안과 및 시각 연구에서의 동물 사용에 대한 성명서에 따라 수행되었으며 리우데자네이루 연방 대학교 보건 과학 센터의 과학 실험에서의 동물 사용에 관한 윤리 위원회(프로토콜 083/17)의 승인을 받았습니다. 본 연구에서는 생후 2-3개월, 체중 180-320g의 리스터 후드 쥐를 사용했다. 그러나 이 절차는 다양한 연령대의 다양한 쥐 균주에 적용할 수 있습니다.

1. 고안압증 수술 및 임상적 추적 관찰

1. 표준 펠릿화 감마선 조사 식품(Nuvilab® CR-1, Quimtia S/A, 브라질) 및 물(삼중 필터, 무독성 활성탄 포함)을 사용하여 제어된 온도 환경 및 12시간 조명/어둠 주기(오전 6시: 조명 켜기/오후 6시: 조명 끄기)에서 동물을 사육합니다.
2. 10% 케타민 염산염 3부와 2% 자일라진 염산염 1부(희석제: 멸균수)로 구성된 마취제 혼합물을 준비합니다.
3. 등쪽 피부를 잡고 동물을 부드럽게 제지하고 혼합물 체중의 1μL/g(케타민: 75mg/kg, 자일라진: 5mg/kg)을 복강내 투여하여 마취를 유도합니다. 약 5분 후 발가락 꼬집기 반응을 수행하여 적절한 마취를 확인하십시오.
....

결과

정량적 변수는 평균의 평균 ± 표준 오차(SEM)로 표현됩니다. OHT와 대조군 간의 IOP 역학 비교(그림 1F)를 제외하고, 통계 분석은 양원 분산 분석(two-way ANOVA)을 사용한 후 Sidak의 다중 비교 테스트를 사용하여 수행되었습니다. p-값 < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

그림 1 은 360° 열에 의한 윤부 혈관의 소실과 수술 종료 시 수술된 눈의 경증에서 중등도의 근육증과 같은 중요한 이정표와 함께 전원 변측신경총 소작(LPC) 모델의 수술 단계를 보여줍니다.

131마리의 쥐를 대상으로 한 이번 연구에서 전원형 변연신경총 소작술(LPC)은 수술 직후 기준선에서 13.0 ± 0.2mmHg에서 22.7 ± 0.4mmHg로 IOP 상승을 유도했습니다. 수술 후 첫날(25.3 ± .......

토론

Limbal plexus cauterization(LPC)은 결막 또는 장부 절제가 필요하지 않은 쉽게 접근할 수 있는 혈관 구조를 표적으로 한다는 장점이 있는 새로운 섬유주 후 모델입니다^17,28. 맥락막 정맥 배액에 대한 외과적 장애를 기반으로 하는 유명한 OHT 모델인 와류 정맥 소작 모델과 달리 LPC 모델에서는 변부 정맥이 수액 유출의 상류에 위치하기 때문에 정맥 울혈이 IOP 상승에 영향을 미치지 않을 것으로 예상됩니다. 또한 기술적으로 배우기 쉽고 비용이 저렴하여 대부분 저온 열 소작이 필요합니다. 또한, OHT 유도 및 완전한 임상 회복(이전에 보고된 바와 같이 > 90%)²³의 고유한 비율과 관련이 있으며, 이는 실험에 필요한 동물의 수를 줄이고 전기 생리학적 및 행동 분석을 모두 가능하게 합니다. 마지막으로, 녹내장 변성은 수술 후 비교적 짧은 시간 내에 망막 신경.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Acetone	Isofar	201	전자 현미경 조직 준비에 사용됩니다 (단계 5)
전기 레티노그래피를 위한 활성 전극	Hansol Medical	Co-Stainless	스틸 바늘 0.25 mm × 15 mm
Anestalcon	Novartis Biociê ncias S/A	MS-1.0068.1087	Proxymetacaine hydrochloride 0.5%
Calcium chloride	Vetec	560	전자 현미경 조직 준비에 사용(5단계)
Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx	Bovie Medical Corporation	AA00	저온 안과 소작
Cetamin	Syntec do Brasil Ltda	000200-3-000003	케타민 염산염 10%
DAKO	Dako North America	S3023	안티페이드 마운팅 매체
DAPI	Thermo Fisher Scientific	28718-90-3	디아미디노-2-페닐린돌; 청색 형광 핵 대조염색; 452±에서 방출; 3nm
에코필름	크리스트&아큐트; lia Produtos Quí micos farmacê uticos Ltda	MS-1.0298.0487	카멜로스 나트륨 0.5%
EPON 수지	Polysciences, Inc.	-	전자 현미경에 사용되는 에폭시 수지, 4가지 시약의 혼합물로 구성됨: Poly/Bed 812 수지(CAT#08791); DDSA - 도데세닐숙신산 무수물(CAT#00563); NMA - 나딕 메틸 무수물 (CAT # 00886); DMP-30 - 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553)
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16110	전자 현미경 조직 준비에 사용(5단계)
Hyabak	Uniã o Quí 운모 Farmacê utica Nacional S/A	MS-8042140002	히알루론산나트륨 0.15%
Icare Tonolab	Icare Finland	Oy TV02 (모델 번호)	리바운드 휴대용 안압계
IgG 당나귀 마우스 항체 + Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A31570	2차 항체 솔루션
LCD 모니터 23인치	Samsung Electronics Co., Ltd.	S23B550	모델 LS23B550, 망막 전기 그래프 기록용
LSM 510 Meta	Carl	Zeiss-Confocal	epifluorescence microscope
Maxiflox	Cristá lia Produtos Quí micos farmacê uticos Ltda	MS-1.0298.0489	Ciprofloxacin 3.5 mg/g
MEB-9400K	Nihon Kohden	Corporation-System	for electroretinogram recording
monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a	MilliporeSigma	MAB-1585	Brn3a primary antibody solution
Neuropack Manager v08.33	Nihon Kohden		Corporation-electroretinogram signal processing
광	운동 반응 분석을 위한	CerebralMechanics-System
Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19100	전자 현미경 조직 준비에 사용(5단계)
륨 페로시안나이	전자 현미경 Sciences	20150	전자 현미경 조직 준비에 사용(5단계)
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나트륨 카코딜레이트 버퍼	전자 현미경 과학	12300	전자 현미경 조직 준비 (단계 5)
에 사용됨 Ster MD	Uniã o Quí 운모 Farmacê utica Nacional S/A	MS-1.0497.1287	프레드니솔론 아세테이트 0.12%
Terolac	Cristá lia Produtos Quí micos farmacê uticos Ltda	MS-1.0497.1286	Ketorolac trometamol 0.5%
Terramicina	Laborató rios Pfizer Ltda	MS-1.0216.0024	Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g
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TO-PRO-3	Thermo Fisher Scientific	T3605	원적색 형광 핵 대조염색; 661 nm에서 방출
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	비이온 계면활성제
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