이 프로토콜은 식물 뿌리에 토양 매개 미생물을 접종하는 전략에 대한 자세한 요약을 제공합니다. 진균 Verticillium longisporum 및 Verticillium dahliae에 대해 예시된 세 가지 상이한 뿌리 감염 시스템이 기술된다. 잠재적 응용 분야와 가능한 다운스트림 분석이 강조되고 각 시스템에 대한 장단점이 논의됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
근권은 식물 뿌리가 끊임없이 도전받는 매우 복잡한 미생물 공동체를 가지고 있습니다. 뿌리는 다양한 미생물과 밀접한 접촉을하지만, 토양 매개 상호 작용에 대한 연구는 여전히 지상 기관에서 수행 된 연구 뒤에 있습니다. 모델 뿌리 병원균으로 모델 식물을 감염시키기 위한 일부 접종 전략이 문헌에 기술되어 있지만, 포괄적인 방법론적 개요를 얻는 것은 여전히 어렵다. 이 문제를 해결하기 위해, 뿌리-미생물 상호작용의 생물학에 대한 통찰을 얻기 위해 적용될 수 있는 세 가지 상이한 뿌리 접종 시스템이 정확하게 기술된다. 예를 들어, Verticillium 종 (즉, V. longisporum 및 V. dahliae)은 뿌리 침입 모델 병원균으로 사용되었습니다. 그러나, 상기 방법은 병원성 및 유익한 미생물 둘 다의 다른 뿌리 식민지화에 쉽게 적응될 수 있다. 식물 자일렘을 식민지화함으로써, Verticillium spp.와 같은 혈관 토양 매개 진균은 독특한 생활 방식을 나타낸다. 뿌리 침범 후, 그들은 자일렘 혈관을 통해 작물 적으로 퍼지고, 싹에 도달하고, 질병 증상을 유발합니다. 세 가지 대표적인 식물 종들이 모델 숙주로 선택되었다: 애기장대 탈리아나, 경제적으로 중요한 오일시드 유채(브라시카 나푸스), 토마토(솔라눔 리코페르시쿰). 단계별 프로토콜이 제공됩니다. 병원성 분석, 마커 유전자의 전사 분석 및 리포터 구축물에 의한 독립적 확인의 대표적인 결과가 제시된다. 또한, 각 접종 시스템의 장점과 단점이 철저히 논의됩니다. 이러한 입증 된 프로토콜은 뿌리 - 미생물 상호 작용에 대한 연구 질문에 대한 접근 방식을 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다. 식물이 토양의 미생물에 어떻게 대처하는지 아는 것은 농업을 개선하기위한 새로운 전략을 개발하는 데 중요합니다.
서론
자연 토양에는 식물에 중성, 유해 또는 유익 할 수있는 놀라운 수의 미생물이 서식합니다1. 많은 식물 병원균은 토양에서 태어나 뿌리를 둘러싸고 지하 기관을 공격합니다. 이 미생물은 곰팡이, oomycetes, 박테리아, 선충류, 곤충 및 일부 바이러스 1,2와 같은 다양한 클래드에 속합니다. 환경 조건이 감염을 선호하면 감염되기 쉬운 식물이 병에 걸리고 작물 수확량이 감소합니다. 지구 온난화와 극심한 날씨와 같은 기후 변화의 영향은 토양 매개 식물 병원균의 비율을 증가시킬 것입니다3. 따라서 이러한 파괴적인 미생물과 그 미생물이 식량 및 사료 생산뿐만 아니라 자연 생태계에 미치는 영향을 연구하는 것이 점점 더 중요해질 것입니다. 또한 토양에는 뿌리와 밀접하게 상호 작용하고 식물의 성장, 발달 및 면역을 촉진하는 미생물 상호 주의자가 있습니다. 병원균에 직면했을 때, 식물은 병원 균 4,5,6,7을 억제함으로써 숙주 생존을 지원할 수있는 근권의 특정 상대를 적극적으로 모집 할 수 있습니다.
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프로토콜
1. 곰팡이 배양 및 식물 접종 시스템을위한 미디어
- 액체 감자 덱스트로스 국물 (PDB) : 열 안정 플라스크에서 초순수로 21 g / L PDB를 준비하십시오.
- Liquid Czapek Dextrose Broth (CDB): 열 안정한 플라스크에서 초순수에 42 g/L CDB를 준비합니다.
- 페트리 접시 접종 시스템용 배지: 초순수에 1.5g/L Murashige 및 Skoog 배지(MS)와 8g/L 한천으로 열에 안정한 플라스크를 준비합니다.
참고 :이 배지의 설탕은 접종 후 과도한 곰팡이 성장을 유발할 수 있으므로이 배지에서 설탕을 피하십시오. - 플라스틱 컵 기반 접종 시스템용 배지: 초순수에서 4.4 g/L MS, 0.2 g/L MgSO4, 1 g/L KNO3, 0.5 g/L 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산(MES) 및 6.0 g/L 한천으로 열 안정 플라스크를 준비하고 5 M KOH로 pH를 5.7로 조정하십시오.
참고 :이 배지의 설탕은 접종 후 과도한 곰팡이 성장을 유발할 수 있으므로이 배지에서 설탕을 피하십시오. - 1/4 MS 배지: 초순수에 1.2 g/L MS를 준비합니다.
- 오토클레이브를 사용하여 ....
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결과
프로토콜에 따라, 식물을 재배하고 V. longisporum (균주 Vl4325) 또는 V. dahliae (JR218 단리물)로 접종하였다. 다양한 시나리오는 효과를 입증하고 주어진 프로토콜의 일부 기능을 강조하기 위해 설계되었습니다. 대표적인 결과가 표시됩니다.
항균성 인돌글루코시놀레이트(IG) 생합성에 관여하는 유전자의 발현 유도는 버티실륨 감염 17,19,26의 평가를 위한 신뢰할 수 있는 지표이다. 아라비돕시스에서, MYB51 (MYB 도메인 단백질 51; AT1G18570)은 IG 생합성에 필요한 유전자의 활성화에 관여하는 전사인자
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토론
토양 매개 식물 병원균1로 인한 엄청난 수확량 손실로 인해 농업 전략 또는 작물 품종의 개선이 필요합니다. 토양 매개 질병의 발병기전에 대한 제한된 통찰력은 더 저항력이 강한 식물의 발달을 방해합니다. 근본적인 병리학 적 메커니즘을 탐구 할 필요가 있으며, 이를 위해서는 강력한 방법론 적 플랫폼이 필요합니다. 보고된 접종 절차는 뿌리-미생물 상호작용에서의 다인자 사건이 상이한 시스템(19)을 조합함으로써 잘 해부될 수 있음을 보여주었다. 위에서 설명한 프로토콜은이 분야에 익숙하지 않은 전문가와 연구자 모두에게 일상적인 워크 플로우를 제공하기위한 것입니다. 취급이 간단하고 독립적 인 복제가 가능하며 필요한 기술 장비가 표준 식물 과학 실험실에 있습니다.
초기 Verticillium 감염 사건 (접종 후 6 dpi까지의 시간)은 페트리 접시 시스템, 토양 기반 시스템의 후기 사건 (.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
저자들은 Tim Iven과 Jaqueline Komorek이 이러한 방법에 대한 이전 연구, 볼프강 Dröge-Laser (독일 뷔르츠부르크 대학 제약 생물학과)가이 작업에 필요한 장비와 자원을 제공했으며, Wolfgang Dröge-Laser와 Philipp Kreisz (뷔르츠부르크 대학 모두)가 원고의 비판적 교정을 위해 인정합니다. 이 연구는 "Deutsche Forschungsgemeinschaft"(DFG, DR273/15-1,2)에 의해 뒷받침되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Agar (Gelrite) | Carl Roth | Nr. 0039 | 설명된 모든 시스템에는 잎 |
| Arabidopsis thaliana 야생형 | NASC 스톡 | Col-0 (N1092) | |
| Autoclave | Systec | VE-100 | |
| BlattFlaeche | Datinf GmbH | BlattFlaeche | 소프트웨어가 |
| > Brassica napus wild-type | see Floerl et al., 2008 | rapid-cycling rape | genome ACaacc |
| Cefotaxime sodium | Duchefa | C0111 | |
| Chicanery flask 500 mL | Duran Group / neoLab | E-1090 | Erlenmeyer 플라스크, 4개의 배플이 있는 |
| 수집 튜브 50 mL | Sarstedt | 62.547.254 | 114 x 28 mm |
| Czapek 포도당 육수 매체 | Duchefa | C1714 | |
| 디지털 카메라 | Nikon | D3100 18-55 VR | |
| Exsiccator (Desiccator) | Duran Group | 200 DN, 5.8 L | Seal with lid to hold chlorine |
| gas 형광 현미경 | Leica | Leica TCS SP5 II | |
| HCl | Carl Roth | P074.3 | |
| KNO3 | Carl Roth | P021.1 | ≥ 99 % |
| KOH | Carl Roth | 6751 | |
| Leukopor | BSN medical GmbH | 2454-00 AP | 부직포 테이프 2.5 cm x 9.2 |
| m MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) | Carl Roth | 4256.2 | Pufferan ≥ 99 % |
| MgSO4 | Carl Roth | T888.1 | 마그네슘황산-헵타하이드레이트 |
| 무라시게 & Skoog medium (MS) | Duchefa | M0222 | MS including vitamins |
| NaClO | Carl Roth | 9062.1 | |
| Percival growth chambers | CLF Plant Climatics GmbH | AR-66L2 | |
| Petri-dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | size Ø xH: 92 × 16 mm |
| 플라스틱 컵 (500 mL, 투명) | Pro-pac, 샐러드 boxx | 5070 | 크기: 108 × 81 × 102 mm |
| 주름 셀룰로오스 필터 | Hartenstein | FF12 | 입자 보유 수준 8– 12 &뮤; m |
| poly klima 성장 챔버 | poly klima GmbH | PK 520 WLED | |
| 감자 포도당 육수 매체 | SIGMA Aldrich | P6685 | 미생물학 |
| 냄비 | P & ouml; ppelmann GmbH | TO 7 D 또는 TO 9,5 D | Ø 7 cm resp. Ø 9.5 |
| cmPromMYB51::YFP | see Poncini et al., 2017 | MYB51 리포터 라인 | YFP (즉, 3xmVenus with NLS) |
| 반응 튜브 2 mL | Sarstedt | 72.695.400 | PCR 성능 테스트 |
| 로터리 (오비탈) 쉐이커 | Edmund Bü hler | SM 30 C control | |
| Sand (버드 샌드) | Pet Bistro, Mü ller Holding | 786157 | |
| Soil | Einheitserde spezial | SP Pikier (SP ED 63 P) | |
| Solanum lycopersicum wild-type | see Chavarro-Carrero et al., 2021 | 유형: Moneymaker | |
| Thoma 세포 계수 챔버 | Marienfeld | 642710 | 깊이 0.020mm; 0.0025mm2 |
| 초순수(Milli-Q 정제수) | MERK | IQ 7003/7005 | 정제 후 얻은 물 |
| Verticillium dahliae | see Reusche et al., 2014 | isolate JR2 | |
| Verticillium longisporum | Zeise and von Tiedemann, 2002 | strain Vl43 |
참고문헌
- Mendes, R., Garbeva, P., Raaijmakers, J. M. The rhizosphere microbiome: significance of plant beneficial, plant pathogenic, and human pathogenic microorganisms. FEMS Microbiology Review. 37 (5), 634-663 (2013).
- Yadeta, K. A., Thomma, B. P. H. J.
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