여기서 우리는 병변 유도 후 DNA를 복제하는 데있어 단일 가닥 DNA 갭을 조사하기 위해 DNA 섬유 분석의 두 가지 변형을 설명합니다. S1 섬유 분석은 ssDNA 특이적 S1 엔도뉴클레아제를 사용하여 복제 후 갭을 검출할 수 있게 하며, 갭 채우기 분석은 갭 복구의 시각화 및 정량화를 가능하게 합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
DNA 섬유 분석을 이용한 인간 세포에서의 복제 후 갭 축적 및 복구 검출
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
DNA 섬유 분석은 인간 세포에서 DNA 합성 중에 혼입되는 뉴클레오티드 유사체의 면역검출에 기초한 복제 포크 역학의 분석을 위한 간단하고 강력한 방법이다. 그러나이 기술은 수천 킬로베이스의 제한된 해상도를 가지고 있습니다. 결과적으로, 수백 염기만큼 작은 복제 후 단일 가닥 DNA (ssDNA) 갭은 표준 검정에 의해 검출 가능하지 않다. 여기에서는 ssDNA를 특이적으로 절단하는 효소인 S1 뉴클레아제를 활용하는 DNA 섬유 분석의 변형된 버전을 설명한다. 복제 후 ssDNA 갭이 있는 경우, S1 뉴클레아제는 틈새를 표적으로 하고 절단하여 진행 중인 포크에서 ssDNA 갭에 대한 판독으로 사용할 수 있는 더 짧은 영역을 생성합니다. 이러한 복제 후 ssDNA 갭은 손상된 DNA가 불연속적으로 복제될 때 형성된다. 그들은 게놈 복제와 결합되지 않은 메커니즘을 통해 갭 채우기 또는 복제 후 수리로 알려진 과정에서 복구 할 수 있습니다. 갭 채우기 메커니즘은 S 단계와 무관하게 DNA 합성을 포함하기 때문에 DNA 섬유 라벨링 체계의 변경은 또한 갭 채우기 이벤트를 모니터링하기 위해 사용될 수 있습니다. 전체적으로, DNA 섬유 분석의 이러한 변형은 복제 후 갭이 인간 세포의 게놈에서 어떻게 형성되고 채워지는지를 이해하는 강력한 전략입니다.
서론
정액 연구는 박테리아1 및 인간 세포 2,3에서 DNA 손상제를 사용한 처리시 복제 후 단일 가닥 (ssDNA) 갭의 축적에 대한 증거를 제공했다. 손상된 DNA 주형의 복제 동안, DNA 합성 기계는 특정 트랜스플레션 합성 DNA 폴리머라제를 사용하거나 주형 스위칭 메커니즘을 통해 병변을 우회할 수 있다. 대안적으로, 리플리솜은 또한 단순히 ssDNA 갭을 남겨두고 병변을 건너 뛰고, 나중에 수리될 수 있다. 보다 최근에, 한 연구는 유전 독성 제제를 사용한 치료가 복제 중간체의 특정 구조를 시각화하기 위해 전자 현미경을 활용하여 진핵생물에서 ssDNA 갭을 유도한다는 것을 분명히 보여주었습니다4. 복제 후 갭의 이들 영역의 형성은 처음에 DNA 복제2의 반불연속 모드의 간단한 결과라고 제안되었다. 이 경우, 뒤쳐진 가닥의 병변은 오카자키 단편의 신장을 차단할 수 있지만, 포크 진행은 ssDNA 갭을 남기고 다음 오카자키 단편에 의해 자연적으로 구출됩니다. 그러나 추가 연구에 따르면 박테리아 5에서 처음 나타난 것처럼 선행 가닥에 틈새 형성이 가능하다는 것이<....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
이 연구는 인간 세포를 사용함에 따라 상파울루 대학의 생물 의학 연구소 윤리위원회 (ICB-USP, 승인 번호 #48347515.3.00005467)에서 인간 샘플을 사용한 연구를 승인했습니다.
참고: 여기에 설명된 프로토콜은 이전 간행물에서 약간의 수정 14,16,28로 사용되었습니다. 여기서 초점은 DNA 손상제로서 자외선 C (UVC)의 사용에 있습니다. 그러나, 시스플라틴 및 히드록시우레아와 같은 다른 DNA 손상 제제도 성공적으로 사용되었다(28). 이러한 프로토콜은 U2OS, HEK293T, 인간 섬유아세포, 및 기타 14,28,29를 포함하는 세포주의 어레이에서 수행될 수 있다. 이 프로토콜을 수행하기 전에 실험적 질문을 결정하는 것이 중요합니다. S1 뉴클레아제를 사용한 DNA 섬유 분석(이후 S1 파이버라고 함)은 복제 후 ssDNA 갭의 존재를 검출하는....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
S1 Fiber 분석에서, 유전 독성제로 처리하면 복제 후 ssDNA 갭이 생기면 S1 처리 된 핵으로부터의 DNA 섬유의 전체 길이는 유전 독성제로 처리되었지만 S1 절단에 제출되지 않은 샘플뿐만 아니라 처리되지 않은 샘플에 비해 DNA 손상으로 처리 할 때 짧아집니다 (그림 1).
대안적으로, S1 뉴클레아제를 사용한 치료가 처리되지 않은 세포에 비해 DNA 섬유의 길이에 유의한 영향을 미치지 않는다면, 상이한 해석이 가능하다: (1) 사용된 유전독성제를 사용한 치료 시 및/또는 조사된 특정 유전적 배경에서 복제 후 ssDNA 갭의 형성이 없다. 실제로, 우리는 이전에 UV로 유도된 6-4 광생성물 (6-4PP)이 아니라 사이클로부탄 피리미딘 이량체 (CPD)가 뉴클레오티드 절제 복구를 위해 결핍된 세포에서 ssDNA 갭의 형성을 유도한다는 것을 이전에 보여주었다 (NER, XP-C 세포)1.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
표준 DNA 섬유 분석 프로토콜의 중요한 단계는 이전 간행물32에서 논의되었다. 여기에서, 우리는14에서 초기에 기술된 갭 채우기에 의한 그들의 복구뿐만 아니라 복제 후 ssDNA 갭의 존재를 조사하기 위해 표준 DNA 섬유 분석의 변형된 버전을 기술한다. 복제 후 ssDNA 갭 존재의 맥락에서, S1 섬유 프로토콜에서 S1 뉴클레아제를 사용하는 것은 갭 형성 및 후속 검출을 위한 시간을 허용하기 위해 최소 1시간 동안 유전독성제의 노출 후에 적합할 가능성이 가장 높다. 그러나, 일부 세포주 또는 유전적 배경에서, S1 뉴클레아제의 사용은 유전독성제(33,34)를 사용한 추가적인 치료 없이도 더 짧은 관을 생성할 수 있다는 점에 유의하는 것이 필수적이다. 따라서 유전 독성 제제를 사용한 치료가 간격 축적으로 이어지는지에 대한 적절한 결론을 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
C.F.M.M. 실험실에서의 연구는 FAPESP와 네덜란드 과학 연구기구 (NWO, 네덜란드)의 국제 협력 연구에 따라 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, 상파울루, 브라질, 보조금 #2019/19435-3, #2013/08028-1 및 2017/05680-0)의 지원을 받습니다. Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brazil, Grants # 308868/2018-8] 및 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brazil, Finance Code 001).
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아세트산, 빙하 | Synth | 64-19-7 | 대안, BSA - Biosera - REF PM-T1725 / 100 |
| 수산화 암모늄 | Synth | 1336-21-6 | 또는 유사한 |
| 항체 anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005-Antibody | |
| anti-rat Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21470-Antibody | |
| Mouse anti-BrdU | Becton Disckson | 347580 | - |
| 항체 쥐 항-BrdU | Abcam | Ab6326-Biological | |
| security hood | Pachane | PA 410 | 실험실에 존재하는 후드 |
| 사용 BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3294 | 또는 이와 유사한 |
| 세포 스크레이퍼 | Thermo Scientific | 179693 | 또는 이와 유사한 |
| CldU | Millipore-Sigma | C6891-Cloridric | |
| acid | Synth | 7647-01-0 | 또는 유사 |
| Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9) | Zeiss-Or | similar | |
| Cover glass (or coverslips) | Thermo Scientific | 152460 | 대안으로, Olen - Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) - K5-2460 |
| DMEM - High Glucose | LGC/Gibco | BR30211-05/12100046 | 사용된 세포주에 특이적인 배양 배지를 사용하십시오. |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) | Sigma-Aldrich | E5314 | 또는 유사한 |
| epifluorescence microscope Axiovert 200 | Zeiss | - | 또는 유사한 |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 12657-029 | 또는 유사한 |
| Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific 3110 | 13-998-074 | 세포 인큐베이터를 사용하십시오. 실험실 |
| 유리 슬라이드 항아리 | Sigma-Aldrich | S5516 | 또는 유사한 |
| 글리세롤 | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | 또는 유사한 |
| Idu | Millipore-Sigma | I7125-Magnesium | |
| Chloride | Synth | 7791-18-6 | 또는 유사한 |
| 메탄올 | Merck | 67-56-1 | 또는 유사한 |
| 현미경 슬라이드 | Denville | M1021 | 대안적으로, Olen - Kasvi 현미경 슬라이드 - K5-7105 <강한>또는 정밀 유리 라인 - 7105-1 |
| MOPS (Á cido 3-morfolinopropano 1-sulfô 니코) | Synth | 1132-61-2 | 또는 유사한 |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | 31430-18-9-PBS | |
| (인산염 완충액 식염수) | 생명 Thechnologies | 3002 | 또는 유사한 |
| 페니실린 - 스트렙토 마이신 | Gibco | 15140122 | 또는 유사한 |
| ProLong Gold AntiFade Mountant | Invitrogen | P36930 | 모든 안티 페이드 moutant 솔루션 면역형광 |
| Aspergillus oryzae | Invitrogen | 18001-016 | S1 뉴클레아제를 사용할 수 있습니다.S1 뉴클레아제(1/100 - 1/200)를 제조업체가 제공한 S1 뉴클레아제 희석 완충액에 미리 희석하고 분취하고 -20°C에서 보관합니다. C |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | BioRad | 161-0302 | 또는 유사한 |
| 아세테이트 나트륨 Trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-90-4 | 또는 유사한 |
| Sodium Chloride | Synth | 7647-14-5 | 또는 유사한 |
| 자당 | Sigma-Aldrich | 57-50-1 | 또는 유사한 |
| Tris Base | West Lab Research | BP152-1 | 또는 유사한 |
| Triton X-100 | Synth | 9002-93-1 | 또는 유사한 |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | 또는 유사한 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | 또는 유사한 |
| UVC 램프 | Non | Specific-Essential | : 254 nm의 방출 길이 |
| VLX-3W UV 복사계 | Vilber Loumart-Or | similar | |
| Zinc Acetate | Sigma-Aldrich | 557-34-6 | Or Similar |
참고문헌
- Rupp, W. D., Howard-Flanders, P. Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation. Journal of Molecular Biology. 31 (2), 291-304 (1968).
- Meneghini, R.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
