방법 논문

정량적 유세포 분석기를 사용하여 형광 표지 단백질과 인공 인지질 마이크로베시클의 상호작용 분석

DOI:

10.3791/63459

⸱

2022년 4월 6일

 ,  ,  ,  , 
1Center for Theoretical Problems of Physicochemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences, 2National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology named after Dmitry Rogachev, 3Faculty of Physics, Lomonosov Moscow State University, 4Faculty of Biological and Medical Physics, Moscow Institute of Physics and Technology

이 논문에서

요약

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여기에서, 우리는 세포 또는 마이크로베시클의 막과 단백질의 상호작용을 특성화하기 위한 일련의 방법을 기술한다.

초록

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인체에서 면역 반응 및 혈액 응고에 관여하는 대부분의 주요 생리 반응은 세포막에서 진행됩니다. 임의의 막 의존성 반응에서 중요한 첫 번째 단계는 인지질 막에 단백질의 결합이다. 지질막과의 단백질 상호작용을 연구하는 접근법은 형광 표지된 단백질과 유세포 분석기를 사용하여 개발되었다. 이 방법은 살아있는 세포와 천연 또는 인공 인지질 소포를 이용한 단백질-막 상호작용의 연구를 허용한다. 이 방법의 장점은 시약 및 장비의 단순성과 가용성입니다. 이 방법에서, 단백질은 형광 염료를 사용하여 표지된다. 그러나, 자가제조 및 상업적으로 입수가능한, 형광 표지된 단백질 둘 모두가 사용될 수 있다. 형광 염료와 컨쥬게이션 한 후, 단백질은 인지질 막 (마이크로베시클 또는 세포)의 공급원과 함께 인큐베이션되고, 샘플은 유세포 분석기에 의해 분석된다. 획득된 데이터는 운동 상수 및 평형Kd를 계산하는데 사용될 수 있다. 또한, 특수 교정 비드를 사용하여 인지질 막 상의 단백질 결합 부위의 대략적인 수를 추정할 수 있다.

서론

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생물막은 동물 세포와 세포외 공간의 내부 내용물을 분리합니다. 막은 또한 세포의 수명주기와 소기관 동안 형성된 마이크로베시클을 둘러싸고 있습니다. 세포막은 주로 지질과 단백질로 구성되어 있습니다. 막 단백질은 신호전달, 구조, 수송 및 접착 기능을 수행합니다. 그러나, 지질 이중층은 또한 동물 세포와 세포외 공간의 상호관계에 필수적이다. 이 논문은 외부 단백질과 지질막의 말초 상호작용을 연구하는 방법을 제안한다.

동물 세포의 외막층에서 일어나는 반응의 가장 두드러진 예는 혈액 응고 반응이다. 혈액 응고의 중요한 특징은 모든 주요 반응이 혈장 1,2,3이 아닌 이들 세포로부터 발생하는 세포 및 마이크로베시클의 인지질 막에서 진행된다는 것입니다. 막-의존성 반응은 (조직 인자의 참여와 함께 침강하피, 염증 내피, 또는 활성화된 면역 세포의 세포막 상에서) 응고를 시작하는 과정을 포함하며, 주요 캐스케이드의 모든 반응-인자 IX, X, 프로트롬빈의 활성화; 트롬빈에 의한 인자 XI의 활성화 (활성화된 혈소판, 적혈구, 지단백질 및 마이크로베시클의 막상); 단백질 C 경로의 반응; 응....

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프로토콜

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1. 형광 단백질 표지

  1. 재료 준비
    1. 1 M 중탄산나트륨 완충액, pH 9.0을 준비하고 4°C에서 보관하고 1주일 이내에 사용한다.
    2. 사용 직전에 1.5 M 하이드록실아민 염산염 완충액, pH 8.5를 준비하십시오.
    3. 디메틸설폭사이드에 형광염료 10mg/mL 용액( 물질표 참조)을 준비한다.
      참고 :이 용액은 어둠 속에서 -20 ° C에서 한 달 동안 저장할 수 있습니다.
    4. 정제 된 항체 또는 다른 단백질의 용액을 1-10 mg / mL로 준비하십시오.
      참고: 암모늄 이온 또는 일차 아민을 포함하는 완충제는 피하십시오. 트리스 또는 글리세롤을 함유하는 완충제를 투석에 의해 포스페이트 완충 식염수 (PBS)로 대체한다. 아지드 나트륨 (≤3 mM) 또는 티메로살 (≤1 mM)은 접합 반응에 유의하게 영향을 미치지 않습니다.
    5. 단백질 정제를 위해 겔 여과 배지 ( 물질의 표 참조)를 실온에서 하룻밤 동안 또는 60°C에서 2시간 동안 PBS에서 인큐베이션한다. 겔 여과 배지를 0.2 μm 멤브레인이 있는 스핀 컬럼 상에 적용한다.
  2. Eq (1....

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결과

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본원에 기재된 유세포 분석 방법은 활성화된 혈소판에 대한 혈장 응고 단백질의 결합을 특성화하기 위해 사용된다. 또한, 인지질 소포 PS:PC 20:80을 모델 시스템으로 적용하였다. 이 논문은 주로 인공 인지질 소포를 예로 들어 초점을 맞춥니다. 세포계의 파라미터, 특히, 광승수 튜브 (PMT) 전압 및 보상은 각각의 특정 장치, 연구 목적 (세포, 인공 또는 천연 마이크로베시클) 및 사용된 염료에 대해 선택되어야 한다. 도 1B,C는 혼입된 친유성 형광 염료 DiIC16(3)과 함께 크기가 ∼1 μm인 인공 인지질 소포의 게이팅의 예를 보여준다. 큰 소포 크기와 친유성 형광 염료는 세포계를 사용하여 소포를 검출하는 데 도움이되었습니다. 게이트는 형광 염료가 없는 동일한 크기의 인공 지질 소포를 함유하는 샘플을 기반으로 설정되었다(도 1B). 이 게이트 내부의 이벤트만 분석에 사용되었습니다.<.......

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토론

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제안된 방법은 다양한 공급원 및 조성물로부터의 단백질과 인지질 막의 상호작용의 대략적인 특성화를 위해 적응될 수 있다. 여기에 설명된 정량적 유세포 분석기는 몇 가지 파라미터에서 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 인정합니다. 특히, 낮은 감도 및 시간 분해능을 가지며 단백질의 형광 표지가 필요하다. 형광 표지는 많은 단백질에 대한 입체 형태의 변화 및 활성의 손실을 초래할 수 있으므로 신중한 제어가 필요합니다. 그러나이 기술은 다른 기술에 비해 상당한 이점이 있습니다. 이 방법은 SPR을 사용하여 쉽게 구현되지 않는 천연 세포막과 단백질의 상호 작용을 탐구 할 수있는 기회를 제공합니다. 더욱이, 이 접근법은 막 표면 상의 단백질 결합 부위의 수의 추정을 허용하고, 일부 분석 작업에 대해 효율적일 수 있다.

상업적으로 입수가능한 비드는 결합 부위를 계수하기 위해 일부 형광 염료에 대해 이용가능하다. 그러나, 많은 널리 사용되는 염료에 대해 그러한 비드는 없다. 따라서 자체 제작 된 .......

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공개 사항

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저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 러시아 과학 재단 보조금 20-74-00133의 지원을 받았다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
A23187시그마 AldrichC7522-10MG
Alexa Fluor 647 NHS 에스테르 (숙시니미딜 에스테르)Thermo Fisher ScientificA37573감자의 형광 염료
아피라제Sigma AldrichA2230
BD FACSCantoIIBD Bioscience
소 혈청 알부민VWR 생명 과학 AMRESCOAm-O332-0.1
염화칼슘, 무수, 분말, ≥ 97%Sigma AldrichC4901-100G
Cary Eclipse 형광 분광계Agilent
D-(+)-GlucoseSigma AldrichG7528-1KG
DiIC16(3) (1,1'-Dihexadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate)ThermoFisher ScientificD384
DMSO시그마 AldrichD8418
EDTA 디 소듐 염VWR 생명 과학 AMRESCOAm-O105B-0.1
FACSDivaBD Bioscience세포 분석 데이터 수집 소프트웨어
FlowJoTree Star세포 분석기 소프트웨어 데이터 분석
HEPESSigma AldrichH4034-500G
Human Factor X효소 연구HFX 1010
하이드록실아민 염산염Panreac141914.1209
L-&알파;-포스파티딜콜린(뇌, 돼지)Avanti 극성 지질840053P
L-&알파;-포스파티딜세린(뇌, 돼지)(나트륨염)Avanti 극성 지질840032P
염화마그네슘시그마 AldrichM8266-100G
미니 압출기Avanti 극성 지질610020-1EA
OriginPro 8 SR4 v8.0951OriginLab Corporation통계 소프트웨어
인산염 완충 식염수(PBS) 정제, 생명공학 등급VWR 생명 과학 AMRESCO97062-732
염화칼시그마 AldrichP9541-500G
프로스타글란딘 E1케이맨 화학13010
Sephadex G25GE HealthcareGE17-0033-01단백질 정제용 젤 여과 매체
Sepharose CL-2BSigma AldrichCL2B300-500ML혈소판 정화용 젤 여과 매체
중탄산나트륨Corning61-065-RO
염화나트륨시그마 AldrichS3014-500G
인산나트륨 일염기성 시그마 AldrichS3139-250G
멤브레인 0.2 &마이크로가 있는 스핀 콜럼; mSartoriusVS0171
Trisodium citrate dihydrate시그마 AldrichS1804-1KG
륨

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoffman, M., Monroe, D. M. A cell-based model of hemostasis. Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).
  2. Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M. A cell-based model of thrombin generation. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32, Suppl 1 32-38 (2006).
  3. Pa....

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재인쇄 및 허가

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