방법 논문

Bathophenanthroline-based Colorimetric Assay를 이용한 조직 비헴철 함량 측정

DOI:

10.3791/63469

⸱

2022년 1월 31일

 , 
1i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 2Basic and Clinical Research on Iron Biology, IBMC - Instituto de Biologia Molecular e Celular, Universidade do Porto, 3Iron and Innate Immunity, IBMC - Instituto de Biologia Molecular e Celular, Universidade do Porto, 4ICBAS - Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서, 동물 조직에서 헴철 함량을 측정하기 위한 프로토콜이 제공되며, 대부분의 실험실에서 쉽게 구현할 수 있는 간단하고 잘 확립된 비색 분석법을 사용한다.

초록

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철분은 필수 미량 영양소입니다. 철분 과부하와 결핍 모두 인간에게 매우 해롭고 조직 철분 수치가 미세하게 조절됩니다. 철분 과부하 또는 결핍의 실험 동물 모델의 사용은 철분 항상성의 전신 및 세포 조절과 관련된 메커니즘에 대한 지식을 향상시키는 데 도움이되었습니다. 동물 조직에서 총 철 수준의 측정은 일반적으로 원자 흡수 분광법 또는 비 헴철과 바토페난트롤린 시약의 반응을 기반으로 한 비색 분석으로 수행됩니다. 수년 동안, 비색 분석은 광범위한 동물 조직에서 비헴철 함량의 측정에 사용되어 왔다. 원자 흡수 분광법과는 달리, 적혈구에 포함 된 헤모글로빈에서 유래 한 헴철의 기여를 배제합니다. 또한 정교한 분석 기술이나 고가의 장비가 필요하지 않으므로 대부분의 실험실에서 쉽게 구현할 수 있습니다. 마지막으로, 비색 분석은 큐벳 기반이거나 마이크로플레이트 형식에 맞게 조정될 수 있으므로 더 높은 샘플 처리량이 가능합니다. 본 연구는 철분 과부하 또는 철분 결핍의 다양한 실험 동물 모델에서 조직 철분 수준의 변화를 검출하는데 적합한 잘 확립된 프로토콜을 제공한다.

서론

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철분은 산소 수송, 에너지 생산 또는 DNA 합성과 같은 중요한 생물학적 과정에 관여하는 단백질의 기능에 필요한 필수 미량 영양소입니다. 중요한 것은 철분 과잉과 철분 결핍 모두 인체 건강에 매우 해롭고 조직 철분 수치가 미세하게 조절된다는 것입니다. 비정상적인식이 철분 흡수, 철분 결핍식이 요법, 반복적 인 수혈 및 만성 염증은 전 세계 수십억 명의 사람들에게 영향을 미치는 철분 관련 장애의 일반적인 원인입니다1,2,3.

철분 과부하 또는 결핍의 실험 동물 모델은 철분 항상성의 전신 및 세포 조절과 관련된 메커니즘에 대한 우리의 지식을 향상시키는 데 도움이되었습니다4. 지난 이십 년 동안 이루어진 상당한 진전에도 불구하고, 많은 주요 측면은 여전히 애매하다. 앞으로 몇 년 동안 동물 조직의 총 철분 수준을 정확하게 측정하는 것은 철 생물학 분야의 연구를 발전시키는 중요한 단계로 남아있을 것입니다.

대부분의 실험실은 원자 흡수 분광법 (AAS), 유도 결합 플라즈마 질량 분광법 (ICP-MS) 또는 비 헴철과 바스토페난트롤린 시약의 반응을 기반으로 한 비색 분석법으로 조직 철분을 정량화합니다. 후자는 50 년 전에 Torrance와 Bothwell이 묘사 한 원래의 방법을 기반으로합니다.5,6. 이 방법의 변형이 바스토페난트롤린7의 대안으로 페로진을 사용하여 개발되었지만, 후자는 문헌에서 가장 널리 인용 된 발색 시약으로 남아 있습니다.

선택 방법은 종종 사용 가능한 전문 지식과 인프라에 달려 있습니다. AAS 및 ICP-MS가 더 민감하지만, 비색 분석은 다음과 같은 중요한 이점을 제시하기 때문에 널리 사용되고 있습니다 : i) 적혈구에 포함 된 헤모글로빈으로부터 유래 된 헴철의 기여를 배제합니다. ii) 정교한 분석 기술이나 고가의 장비가 필요하지 않습니다. iii) 원래의 큐벳-기반 분석은 마이크로플레이트 포맷에 적응될 수 있고, 더 높은 샘플 처리량을 허용한다. 이 연구에서 제시된 비색 접근법은 설치류에서 물고기 및 초파리에 이르기까지 철분 과부하 또는 철분 결핍의 다양한 실험 동물 모델에서 조직 비 헴 철분 수준의 변화를 정량화하는 데 일상적으로 사용됩니다. 여기서, 동물 조직에서 비헴철 함량을 측정하기 위한 프로토콜이 제공되며, 대부분의 실험실에서 구현하기 쉬운 단순하고 잘 확립된 비색 분석을 사용한다.

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프로토콜

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C57BL/6 마우스는 상업적으로 구입하였고, C57BL/6 배경8의 헵시딘-널(Hamp1-/-) 마우스는 소피 발론트(프랑스 코친인스티투트)로부터 일종의 선물이었다. 동물들은 표준 설치류 차우와 물에 자유롭게 접근 할 수있는 온도 및 조명 제어 환경에서 특정 병원체가없는 조건 하에서 i3S 동물 시설에 수용되었습니다. 유럽 농어(Dicentrarchus labrax)는 상업용 어류 농장에서 구입하여 ICBAS 동물 시설, 온도 및 조명 조절 환경에서 수용하고 표준 농어 사료로 매일 광고 리비툼을 공급했습니다. 척추 동물과 관련된 모든 절차는 i3S 동물 윤리위원회와 국가 당국 인 Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV)의 승인을 받았습니다. 상업용 시약, 장비 및 동물에 대한 정보는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 용액 준비

참고: 모든 시약과 용액을 철이 없는 유리 제품 또는 일회용 플라스틱 제품으로 취급하고 준비하십시오. 철 오염의 위험으로 인해 금속 실험실 재료 (예 : 스테인레스 스틸 주걱)가 시약 또는 용액과 접촉하는 것을 허용하지 마십시오. 재사용 가능한 유리 제품은 철분이 없는지 확인하십시오. 재료를 적절한 실험실 세제로 30-60 분 동안 씻고, 탈 이온수로 헹구고, 탈이온수로 1:3으로 희석 된 37 % 질산 용액에 밤새 담그고, 탈이온수로 다시 헹구고, 건조시킵니다.

  1. 산 혼합물: 유리 병에 37% 염산 82.2 mL에 트리클로로아세트산 10 g을 첨가하고, 완전히 용해시키고, 탈이온수로 최종 부피를 100 mL로 조정한다. 사용 전에 흔들어 주십시오. 또는 조직 소화를 위해 37 % 염산 만 사용하십시오.
    참고 : 용액은 짙은 갈색 유리 시약 병에 보관할 때 적어도 2 개월 동안 안정적입니다.
    주의: 염산과 트리클로로아세트산은 부식성이 있으며, 농축된 형태는 독성 산성 증기를 방출합니다. 산을 취급 할 때 보호 복, 내화학성 장갑 및 화학 스플래시 고글을 항상 착용하십시오. 그들을 호흡하지 말고 흄 후드 아래에있는 동안 항상 산을 다루십시오.
  2. 포화 아세트산나트륨: 유리병에 탈이온수 400mL에 무수 초산나트륨 228g을 넣고 실온에서 밤새 교반한다. 용액을 쉬게하고 하루 동안 침전시킵니다. 침전이 발생하지 않으면 소량의 아세트산 나트륨을 계속 첨가하십시오. 용액을 유리 병에 보관하십시오.
  3. 염색체 시약: 염색체 시약 1 mL를 준비하기 위해, 탈이온수 500 μL에 4,7-디페닐-1,10-페난트롤린 디술폰산 디소듐염 1 mg을 첨가하고, 농축된 티오글리콜산 10 μL(100%)를 첨가하고, 완전히 용해시킨다. 탈이온수로 최종 부피를 1 mL로 구성한다.
    참고: 필요에 따라 염색체 시약을 준비하십시오. 용액은 빛으로부터 보호 될 때 1 개월 동안 안정적입니다.
  4. 작동 염색체 시약 (WCR) : 5 부피의 포화 아세트산 나트륨과 5 부피의 탈 이온수에 염색체 시약 1 부피를 첨가하십시오.
    참고 :이 솔루션은 사용 당일에 새로 준비해야합니다.
  5. 스톡 철 표준 용액: 20 mM 원철 용액을 제조하기 위해, 111.5 mg의 카보닐 철 분말을 37% 염산 5,480 μL를 함유하는 250 mL 용적 플라스크에 넣는다. 실온에서 밤새 용해되도록 두십시오 (또는 끓는 수조에서 배양하십시오). 이어서, 용액을 탈이온수로 100 mL의 최종 부피로 구성한다.
    참고: 표준 용액은 단단히 밀봉된 용기에 보관할 때 무기한으로 보관할 수 있습니다.
  6. 작동 철 표준 용액 (WISS) : 탈이온수 500 μL에 37 % 염산 13.5 μL를 첨가하십시오. 스톡철 표준 용액 10 μL를 첨가하고 탈이온수(Fe/mL 11.169 μg, 200 μM, AAS로 측정)로 최종 부피를 1 mL로 구성한다.
    참고 : 작업 용액은 사용 당일에 새로 준비해야합니다.

2. 샘플 건조

  1. 메스 블레이드로 무게 10-100mg의 조직 샘플을 자릅니다. 작은 파라필름 조각(신선한 무게)에 대한 분석적/정밀 균형으로 정확하게 무게를 재십시오.
  2. 플라스틱 핀셋을 사용하여 조직 조각을 24-웰 플레이트 (물 증발을 허용하도록 뚜껑을 벗김)에 놓고 65 °C의 표준 인큐베이터에서 48 시간 동안 건조시킵니다.
  3. 또는 조직 샘플을 건조하기 위해 실험실 전자 레인지 소화 오븐을 사용하십시오. 플라스틱 핀셋을 사용하여 칭량된 티슈 조각을 철분이 없는 테프론 컵에 넣고 전자레인지에서 건조시킵니다. 계측기의 사용 설명서에 따라 작동 매개변수를 설정합니다.
    참고: 참고로, 특정 소화 오븐( 재료 표 참조)을 사용하여 간 샘플을 건조하기 위한 작동 파라미터는 표 1에 나와 있습니다.
  4. 플라스틱 핀셋을 사용하여 각 건조 된 조직 조각을 분석 / 정밀 저울 내부의 작은 파라 필름 위에 놓고 정확하게 무게를 측정하십시오 (건조 중량).

3. 샘플 산성 소화

  1. 플라스틱 핀셋을 사용하여 건조된 각 조직 조각을 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
  2. 산 혼합물 1 mL를 첨가하고 마이크로원심분리 튜브를 닫는다. 조직이 생략된 것을 제외하고는 동일한 방법으로 산 블랭크를 준비한다.
    주의: 산 혼합물은 부식성이 있으며 독성 증기를 방출합니다. 산성 혼합물을 취급 할 때 보호 복, 내화학성 장갑 및 화학 스플래시 고글을 착용하십시오. 그것을 호흡하지 말고 흄 후드 아래에있는 동안 항상 그것을 다루십시오.
  3. 마이크로원심분리 튜브를 20시간 동안 65°C의 인큐베이터에서 인큐베이션함으로써 조직을 소화시킨다.
  4. 실온으로 냉각한 후, 500 μL의 투명한(노란색) 산 추출물(상청액)을 플라스틱 팁이 장착된 마이크로피펫을 사용하여 새로운 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다. 명확한 상층액을 얻을 수 없다면, 짧은 원심분리 스핀을 수행하십시오.
    주의: 상청액은 매우 산성입니다. 상층액을 취급 할 때 보호 복, 내화학성 장갑 및 화학 스플래시 고글을 착용하십시오. 흄 후드 아래에서 항상 다루십시오.
    참고: 이 시점에서, 산 추출물은 비색 검정을 위해 즉시 사용되거나 추후 사용을 위해 -20°C에서 동결될 수 있다. 냉동된 샘플을 실온으로 완전히 해동하고 사용 전에 와류합니다.

4. 색상 개발

  1. 표 2에 나타낸 바와 같이 염색체 반응을 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 준비하거나, 더 높은 처리량을 위해 평평한 바닥, 96-웰, 투명하고 처리되지 않은 폴리스티렌 마이크로플레이트 내로 직접 넣는다. 모든 반응 (산 블랭크, 표준 및 샘플)을 적어도 중복으로 준비하십시오.
  2. 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다.

5. 흡광도 판독

  1. 분광광도계 또는 플레이트 리더에서 탈이온수 기준치에 대해 535 nm의 파장에서 샘플 흡광도를 측정한다. 플레이트는 뚜껑을 닫거나 뚜껑을 덮지 않고 읽을 수 있습니다. 뚜껑이 달린 경우, 흡광도 판독에 방해가 되지 않도록 측정 직전에 뚜껑에서 산성 증기가 방출되어 형성된 응축을 제거하십시오.
    참고: 탈이온수에 대해 판독된 산 블랭크의 광학 흡광도(참조)는 0.015 미만이어야 합니다. 표준 및 샘플의 광학 흡광도는 0.100과 1.000 사이이어야합니다. 철 함량이 매우 높거나 매우 낮은 샘플의 경우 산 추출물 (상청액) 및 diH2O의 부피를 조정해야 할 수도 있습니다 (표 2) : 흡광도가 1.0보다 큰 경우 더 작은 샘플 (상청액) 부피를 사용하십시오. 흡광도가 0.1보다 낮 으면 상층액을 더 많이 사용하십시오. 샘플 부피(Vsmp)는 각 샘플의 조직 철분 함량을 계산할 때 고려된다(단계 6 참조).

6. 조직 철분 함량의 계산

  1. 다음 방정식으로 비 헴 조직 철분 함량을 계산하십시오.
    조직 철분(μg/g 건조 조직) = figure-protocol-1
    AT = 시험 샘플의 흡광도
    AB = 산성 블랭크의 흡광도
    AS = 표준의 흡광도
    Fes = WISS의 철 농도 (μg Fe/mL)
    W = 건조 조직의 중량 (g)
    Vsmp = 샘플 부피 (표 2의 상등액의 가변 부피가 mL로 변환됨)
    Vf = 65°C에서 밤새 인큐베이션한 후 산 혼합물의 최종 부피 (mL의 산 부피 플러스 건조 조직 부피에 상응함; 샘플 중량이 유의하게 다르지 않은 경우, 1 mL≈ 일정한 부피를 가정함)
    Vstd = 철 표준 부피(mL로 변환된 표 2의 WISS의 부피)
    Vrv = 최종 반응 부피 (표 2의 총 부피를 mL로 환산)

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결과

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큐벳 대 96웰 마이크로플레이트 비교
Torrance 및 Bothwell5,6에 의해 원래 기술된 바토페난트롤린 시약과의 반응에 의한 조직 비헴철의 측정은 흡광도 판독을 위한 분광광도계의 사용에 의존한다. 따라서, 염색체 반응에 사용되는 부피는 일반 분광 광도계 큐벳의 크기와 양립 가능하다. 본 연구는 마이크로플레이트 판독기에서 흡광도 측정을 위해 염색체 반응이 96-웰 마이크로플레이트에서 직접 제조되는 방법 적응을 설명하며, 더 작은 시약 부피를 요구하고 더 높은 처리량을 허용한다.

두 접근법의 감도를 비교하기 위해, 작동 철 표준 용액 (WISS)의 연속 희석이 초기에 제조되었고, 염색체 반응은 표 2에 표시된 바와 같이 1.5 mL 튜브 또는 96-웰 플레이트에서 조립되었다. 흡광도는 분광광도계(큐벳 포함...

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토론

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동물 조직에서 헴철 함량의 측정을 위한 프로토콜이 제공되며, 원래 Torrance 및 Bothwell5,6에 의해 기술된 바토페난트롤린-기반 비색 분석법의 적응을 이용한다. 상기 방법의 중요한 단계는 조직 샘플 건조; 단백질 변성 및 산 가수분해에 의한 무기 철의 방출; 환원제 티오글리콜산의 존재 하에 철(Fe3+)철을 철 상태(Fe2+)로 환원시키고, 바토페난트롤린 시약과의 반응(염색체 반응); 생성된 철이온/바토페난트롤린 핑크 복합체의 흡광도 판독; 및 조직 철분 함량의 계산.

본 연구는 원래의 큐벳 기반 프로토콜이 분석 감도를 손상시키지 않고 더 높은 처리량을 위해 96-well 기반 형식으로 어떻게 적용될 수 있는지를 보여줍니다. 특히,이 적응은 상당한 시간 절약을 허용하기 때문에 : 1) 더 많은 수의 염색체 반응이 다중 채널 ...

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공개 사항

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저자는 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 UIDB/04293/2020 프로젝트에 따라 FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P.를 통해 National Fund가 자금을 지원했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
96 웰 UV 투명 플레이트Sarstedt82.1581.001
분석 저울KernABJ 220-4M
무수 아세트산나트륨 Merck106268
Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid)Sigma-AldrichB1375
C57BL / 6 마우스 (Mus musculus< / em >)찰스 리버 연구소
카르보닐 철 분말, ≥ 99.5%Sigma-Aldrich44890
폴리메틸메타크릴레이트(PMMA)의 일회용 큐벳VWR634-0678P
이중 증류수 멸균수B. Braun0082479E
형광 마이크로플레이트 리더BioTek InstrumentsFLx800
염산, 37%Sigma-Aldrich258148
전자 레인지 소화 오븐 및 흰색 테프론 컵CEMMDS-2000
질산Fisher Scientific15687290
오븐바인더ED115
설치류 차우Harlan Laboratories2014STeklad Global 14 % 단백질 설치류 유지 관리 다이어트 175 mg / kg 철
농어 ( Dicentrarchus labrax < / em >)Sonrionansa 포함
농어 피드SkrettingL-2 Alterna 1P
단일 빔 UV-Vis 분광 광도계ShimadzuUV 미니 1240
티오 글리콜 산Merck100700
트리클로로 아세트산Merck100807

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. A red carpet for iron metabolism. Cell. 168, 344-361 (2017).
  2. Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. Hepcidin and anemia: A tight relationship. Frontiers in Physiology. 10, 1294(2019).
  3. Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T. Anemia of inflammation. Blood. 133 (1), 40-50 (2019).
  4. Altamura, S., et al. Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models. Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872(2020).
  5. Torrance, J. D., Bothwell, T. H. A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples. South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).
  6. Torrence, J. D., Bothwell, T. H. Tissue iron stores. Methods in Haematology. Cook, J. D. , Churchill Livingston Press. New York. 104-109 (1980).
  7. Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. Microanalysis of non-heme iron in animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).
  8. Lesbordes-Brion, J. C., et al. Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis. Blood. 108, 1402-1405 (2006).
  9. Jumbo-Lucioni, P., et al. Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 11, 297(2010).
  10. Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F. Iron Absorption in Drosophila melanogaster. Nutrients. 5, 1622-1647 (2013).
  11. Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. High-throughput non-heme iron assay for animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).
  12. Adrian, W. J., Stevens, M. L. Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver. Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).

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