Phormidium lacuna 는 해양 암석에서 분리 된 필라멘트 성 시아 노 박테리움입니다. 이 기사에서는 천연 공급원으로부터의 필라멘트의 분리, DNA 추출, 게놈 시퀀싱, 자연 변형, sfGFP의 발현, 냉동 보존 및 운동성 방법에 대해 설명합니다.
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방법 논문
자연 형질전환, 단백질 발현 및 필라멘트성 시아노박테리움 포미듐 라쿠나의 동결보존(Cryoconservation of Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna)
이 논문에서
요약
초록
시아 노 박테리아는 태양 에너지가 바이오 매스 생산에 사용되는 기본 연구 및 생명 공학 프로젝트의 초점입니다. Phormidium lacuna는 새로 분리 된 필라멘트 성 시아 노박테리움입니다. 이 논문은 새로운 필라멘트 시아 노 박테리아가 해양 암석에서 어떻게 분리 될 수 있는지 설명합니다. 또한 필라멘트에서 DNA를 추출하는 방법과 게놈을 시퀀싱하는 방법을 설명합니다. 많은 단세포 종에 대해 형질전환이 확립되지만, 필라멘트성 시아노박테리아에 대해서는 덜 빈번하게 보고된다. P. lacuna의 자연 변형을위한 단순화 된 방법이 여기에 설명되어 있습니다. P. lacuna는 자연 변형이 확립 된 Oscillatoriales 주문의 유일한 구성원입니다. 이 논문은 또한 자연 변형이 수퍼 폴더 녹색 형광 단백질 (sfGFP)을 발현하는 데 어떻게 사용되는지를 보여줍니다. 내인성 cpcB 프로모터는 Synechocystis sp. PCC6803으로부터의 cpc560, A2813, 또는 psbA2 프로모터보다 약 5배 더 강한 발현을 유도하였다. 또한, P. lacuna 및 Synechocystis sp.CPP 6803의 동결보존을 위한 방법이 확립되었고, 액체 매질 및 한천 및 플라스틱 표면에서의 운동성을 평가하는 방법이 기재되어 있다.
서론
시아노박테리아는 광합성을 에너지원으로 활용하는 원핵생물이다1,2. 연구는 시아 노 박테리아 종에 점점 더 초점을 맞추고 있습니다. 몇몇 시아노박테리아는 DNA3으로 형질전환될 수 있다. 유전자는 이들 종에서 녹아웃되거나 과발현될 수 있다. 그러나, 형질전환은몇몇 종 4,5,6,7,8,9,10,11 로 제한되며, 배양 수집 또는 야생 8로부터의 균주에서 형질전환을 확립하는 것은 어려울 수 있다. 필라멘트 종 Phormidium lacuna (그림 1)의 균주는 염....
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프로토콜
1. 자연 환경으로부터의 격리
참고 : 녹조류, 규조류, 사상 시아 노 박테리아 및 기타 미세 조류를 분리 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 실험실 조건에서 자라는 암석 풀의 모든 미세 조류 종에 사용할 수 있습니다. Oscillatoriales에 속하는 필라멘트 시아 노 박테리아는 움직임과 필라멘트 모양으로 쉽게 인식 할 수 있습니다. 상기 종은 게놈 시퀀싱 또는 16S rRNA 시퀀싱에 의해 반순수 상태로 확인될 수 있다.
- 해양 암석 수영장 (즉, 바위가 많은 해안의 충치)에서 액체 해수 샘플을 50 mL 플라스크로 옮깁니다. 각 플라스크에 대해 천연 소스의 정확한 장소 또는 좌표를 기록하십시오. 가능하다면 50 μm 그물을 통해 내용물을 여과하여 동물 플랑크톤의 양을 줄입니다. 샘플을 계대배양할 수 있을 때까지 4°C에서 보관한다.
- 1 mL 배양물을 f /2 배지 22,23에 3% 박토-한천을 함유하는 10 cm 페트리 접시에 옮긴다(물자 표 참조). 최대 20 개의 플레이트를 준비하십시오. 50 μmol m-2 s-1....
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결과
상기 언급된 방법에 따라, P. lacuna 의 5개의 상이한 균주를 락풀로부터 분리하고 서열화하였다(도 1 및 표 1). 모든 배양물은 P. lacuna HE10JO를 제외한 계대 배양의 ∼1년 후에 멸균되었다. 이 균주는 여전히 해양 박테리아 인 Marivirga atlantica로 오염되어 있습니다. 후속 헬고랜드 여행 동안, 다른 필라멘트 시아 노 박테리아는 P. lacuna 와 다르며 특성화되어야하는 암석 웅덩이에서 분리되었습니다.
몇몇 DNA 추출 및 정제 방법을 P. lacuna에 대해 시험하였다. 최상의 결과는 전술한 바와 같이 최적화된 CTAB 방법으로 얻어졌다. DNA 수율은 310 ± 50 μg/mL, OD260 nm/OD280 nm는 1.7 ± 0.03, OD260 nm/OD230.......
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토론
시아노박테리아의 많은 균주가 배양 컬렉션32,33,34,35,36으로부터 이용가능하지만, 이들 종들이 특정 특성에 적응하기 때문에 야생으로부터 새로운 시아노박테리아에 대한 요구가 여전히 존재한다. P. lacuna는 암석 풀에서 수집되었으며 소금 농도 및 온도30의 변화에 적응됩니다. 이 종의 균주는 2008, 2009 및 2010의 여행 중에 발견되었습니다. 여기에 설명 된 절차에 따라 P. lacuna의 5 균주가 분리되었고,이 균주 중 4 개는 멸균되었습니다. 균주 P. lacuna HE10JO는 rRNA 및 게놈 시퀀싱에 의해 확인된 해양 박테.......
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 Karlsruher Institute of Technology의 지원을 받았습니다.
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재료
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| Bacto Agar | OttoNorwald | 214010 | |
| BG-11 담수 솔루션 | Sigma Aldrich | C3061 | |
| BG-11 매체 | Merck | 73816-250ML | |
| 붕산 | Merck | 10043-35-3 | H3BO3 |
| 염화칼슘 이수화물 | Carl Roth | 10035-04-8 | CaCl2 · 2 H2O |
| 세포 배양 플라스크 Cellstar 필터 스크류 캡 포함, sterile, 250 mL | Greiner | 658190 | |
| 세포 배양 플라스크 Cellstar 필터 스크류 캡 포함, sterile, 50 mL | Greiner | 601975 | |
| Centrifuge LYNX 4000 | Thermo Scientific | 75006580 | 및 로터 |
| Centrifuge microstar 17 | VWR International | N/A | for up to 13,000 |
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| DNA ladder 1 kb | New England Biolabs | N3232 | |
| DNA ladder 100 bp | New England Biolabs | N3231 | |
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| 인산이수소나트륨 일수화물 | Carl Roth | 10049-21-5 | NaH2PO4 · H2O |
| 불화나트륨 | Carl Roth | 7681-49-4 | NaF |
| 탄산수소나트륨 | Carl Roth | 144-55-8 | NaHCO3 |
| 몰리브덴산나트륨 이수화물 | Serva | 10102-40-6 | Na2MoO4 · 2 H2O |
| 질산나트륨 | Merck | 7631-99-4 | NaNO3 |
| 황산나트륨 | Carl Roth | 7757-82-6 | Na2SO4 |
| 스트론튬 클로라이드 헥사하이드레이트 | Carl Roth | 10025-70-4 | SrCl2 · 6 H2O |
| 티아민 염산염 | Merck | 67-03-8 | C12H17ClN4OS · HCl |
| TRIS | 칼 로스 | 77-86-1 | C4H11NO3 |
| 초음파 장치 UP100H sonotrode MS3 | Hielscher 초음파 기술 | UP100H | |
| Ultraturrax Silent Crusher M | Heidolph Instruments | Homogenizer | |
| Urea | Carl Roth | 57-13-6 | CH4N2O |
| 비타민 B12 | Sigma | 68-19-9 | C63H88CoN14O14P |
| 비타민 용액 | 0.3 µ M thiamin-HCl, 2.1 nM 비오틴, 0.37 nM 시아노코발라민 | ||
| 증류기, 수처리 | VEOLIA 수처리 기술 | ELGA_21001 | |
| 아연 황산염 헵타하이드레이트 | Sigma | 7446-20-0 | ZnSO4 · 7 H2O |
| software, URL | |||
| gatb-minia DNA 조립 | 을 위한 프로그램https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline | 짧은 DNA 판독으로 큰 스캐폴드를 만들고, | |
| ImageJ | 소프트웨어RAST | ||
| 주석 서버 | https://rast.nmpdr.org | 입력: 게놈 DNA 염기서열, 열린 판독 프레임 감지, 단백질 염기서열 및 그 기능 | |
| Culture media | |||
| 인공 해수 | 0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 µ M SrCl2, 72 &마이크로; M NaF | ||
| f/2 -액체 매체 | 인공 해수, 0.1 % (v/v) 미량 원소 용액, 0.05 % (v/v) 비타민 용액, 0.88 mM NaNO3, 36 µ M NaH2PO4 | ||
| f/2+ 액체 매체 | f/2-매체, 10배 증가 NaNO3 및 NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 µ M NaH2PO4 | ||
| f/2+-한천 | 3 % (w/v) bacto 한천, 인공 해수, 0.1 % (v/v) 미량 원소 용액, 0.05 % (v/v) 비타민 용액, 8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4 | ||
| f/2-한천 | 3 % (w / v) bacto 한천, 인공 해수, 0.1 % (v / v) 미량 원소 용액, 0.05 % (v / v) 비타민 용액, 0.88 mM NaNO 3< / sub>, 36 µ M NaH2PO4 | ||
| Trace 원소 용액 | 0.36 mM NaH2PO4, 12 µ M Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 & 마이크로; M MnCl2 | ||
| 비타민 해결책 | 0.3 &마이크로; M 티아민-HCl, 2.1nM 비오틴, 0.37nM 시아노코발라민 |
참고문헌
- Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories. Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).
- Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. Evalua....
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