자연 형질전환, 단백질 발현 및 필라멘트성 시아노박테리움 포미듐 라쿠나의 동결보존(Cryoconservation of Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna)

요약

Phormidium lacuna 는 해양 암석에서 분리 된 필라멘트 성 시아 노 박테리움입니다. 이 기사에서는 천연 공급원으로부터의 필라멘트의 분리, DNA 추출, 게놈 시퀀싱, 자연 변형, sfGFP의 발현, 냉동 보존 및 운동성 방법에 대해 설명합니다.

초록

시아 노 박테리아는 태양 에너지가 바이오 매스 생산에 사용되는 기본 연구 및 생명 공학 프로젝트의 초점입니다. Phormidium lacuna는 새로 분리 된 필라멘트 성 시아 노박테리움입니다. 이 논문은 새로운 필라멘트 시아 노 박테리아가 해양 암석에서 어떻게 분리 될 수 있는지 설명합니다. 또한 필라멘트에서 DNA를 추출하는 방법과 게놈을 시퀀싱하는 방법을 설명합니다. 많은 단세포 종에 대해 형질전환이 확립되지만, 필라멘트성 시아노박테리아에 대해서는 덜 빈번하게 보고된다. P. lacuna의 자연 변형을위한 단순화 된 방법이 여기에 설명되어 있습니다. P. lacuna는 자연 변형이 확립 된 Oscillatoriales 주문의 유일한 구성원입니다. 이 논문은 또한 자연 변형이 수퍼 폴더 녹색 형광 단백질 (sfGFP)을 발현하는 데 어떻게 사용되는지를 보여줍니다. 내인성 cpcB 프로모터는 Synechocystis sp. PCC6803으로부터의 cpc560, A2813, 또는 psbA2 프로모터보다 약 5배 더 강한 발현을 유도하였다. 또한, P. lacuna 및 Synechocystis sp.CPP 6803의 동결보존을 위한 방법이 확립되었고, 액체 매질 및 한천 및 플라스틱 표면에서의 운동성을 평가하는 방법이 기재되어 있다.

서론

시아노박테리아는 광합성을 에너지원으로 활용하는 원핵생물이다^1,2. 연구는 시아 노 박테리아 종에 점점 더 초점을 맞추고 있습니다. 몇몇 시아노박테리아는 DNA³으로 형질전환될 수 있다. 유전자는 이들 종에서 녹아웃되거나 과발현될 수 있다. 그러나, 형질전환은^{몇몇 종} 4,5,6,7,8,9,10,11 로 제한되며^, 배양 수집 또는 야생 ⁸로부터의 균주에서 형질전환을 확립하는 것은 어려울 수 있다. 필라멘트 종 Phormidium lacuna (그림 1)의 균주는 염 농도 또는 온도와 같은 환경 조건이 시간이 지남에 따라 변동하는 해양 암석 풀에서 분리되었습니다. 이 필라멘트 시아 노 박테리아는 그들이 속한 Oscillatoriales¹² 순서에 대한 모델 유기체로 사용될 수 있습니다.

전기천공에 의한 유전자 전달을 시험하는 시험 동안 ^13,14는 P. lacuna가 자연 형질전환(¹⁵)에 의해 형질전환될 수 있다는 것을 발견하였다. 이 과정에서 DNA는 일부 세포에 의해 자연적으로 흡수됩니다. 변환^16,17의 다른 방법과 비교할 때^, 자연 변환은 절차를 복잡하게 만들 수있는 추가 도구가 필요하지 않다는 장점이 있습니다. 예를 들어, 전기 천공에는 적절한 큐벳, 손상되지 않은 와이어 및 적절한 전압의 선택이 필요합니다. P. lacuna는 현재 자연 변형에 취약한 유일한 Oscillatoriales 회원입니다. 원래 프로토콜은 전기 천공 프로토콜을 기반으로하기 때문에 여전히 불필요 할 수있는 몇 가지 세척 단계가 포함되어 있습니다. 프로토콜을 단순화하기 위해 다양한 접근 방식을 테스트하여 여기에 제시된 변환 프로토콜로 이어졌습니다.

게놈 서열은 유전자 녹아웃 또는 과발현에 기초한 추가 분자 연구에 필수적이다. 게놈 서열은 단기간 내에 차세대 시퀀싱 기계로 얻을 수 있지만, DNA의 추출은 어려울 수 있으며 종에 따라 다릅니다. P. lacuna를 사용하면 몇 가지 프로토콜이 테스트되었습니다. 그런 다음 변형된 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB) 기반 방법이 확립되어 실험실에서 계속 작업하기 위해 각 정제주기의 DNA 순도 및 DNA 수율을 수용할 수 있게 되었습니다. 다섯 균주의 게놈은 이 프로토콜로 시퀀싱될 수 있었다. 다음 논리적 형질전환 단계는 P. lacuna에서 단백질 발현을 확립하는 것이었다.

이 프로토콜에서 마커 단백질로서 사용된 sfGFP는 임의의 형광 현미경으로 검출될 수 있다. 시험된 모든 프로모터는 P. lacuna sfGFP 발현을 위해 사용될 수 있었다. 형질전환으로부터 발생하는 균주의 수가 증가함에 따라 배양물을 저장하는 방법이 필요하게 되었다. 이러한 방법은 에스케리치아 콜라이 및 다른 많은 박테리아⁽¹⁸)에 대해 확립된다. 표준 프로토콜에서, 글리세롤 배양물을 제조하고, 액체 질소로 옮기고, -80°C에서 저장한다. 이 방법은 몇 단계 만 거치면 되며 확립 된 종에 대해 매우 신뢰할 수 있습니다. P. lacuna에 대한 표준 프로토콜은 살아있는 세포가 모든 경우에 회복 될 수 없었기 때문에 실현 가능하지 않았습니다. 그러나 해동 후 글리세롤을 제거했을 때 모든 시험의 세포는 생존했습니다. P. lacuna의 운동성 분석을 위해 간단한 방법이 제시되며, 이는 IV 형 필리 또는 광수용체의 역할을 조사하기 위해 녹아웃 돌연변이 유발과 결합 될 수 있습니다. 이들 검정은 단세포 시아노박테리아^19,20,21의 분석과 다르며 또한 다른 오실라토리아에 유용할 수 있다.

프로토콜

1. 자연 환경으로부터의 격리

참고 : 녹조류, 규조류, 사상 시아 노 박테리아 및 기타 미세 조류를 분리 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 실험실 조건에서 자라는 암석 풀의 모든 미세 조류 종에 사용할 수 있습니다. Oscillatoriales에 속하는 필라멘트 시아 노 박테리아는 움직임과 필라멘트 모양으로 쉽게 인식 할 수 있습니다. 상기 종은 게놈 시퀀싱 또는 16S rRNA 시퀀싱에 의해 반순수 상태로 확인될 수 있다.

1. 해양 암석 수영장 (즉, 바위가 많은 해안의 충치)에서 액체 해수 샘플을 50 mL 플라스크로 옮깁니다. 각 플라스크에 대해 천연 소스의 정확한 장소 또는 좌표를 기록하십시오. 가능하다면 50 μm 그물을 통해 내용물을 여과하여 동물 플랑크톤의 양을 줄입니다. 샘플을 계대배양할 수 있을 때까지 4°C에서 보관한다.
2. 1 mL 배양물을 f /2 배지 ^22,23에 3% 박토-한천을 함유하는 10 cm 페트리 접시에 옮긴다(물자 표 참조). 최대 20 개의 플레이트를 준비하십시오. 50 μmol ^{m-2 s-1}의 백색광 하에서 재배하십시오.
   참고 : 재배에 더 높은 광도를 사용할 수 있습니다. P. lacuna에는 최대 400 μmol ^{m-2 s-1의} 강도를 사용할 수 있지만 다른 종은 빛에 더 민감 할 수 있습니다.
3. 일주일 후, 멸균 포셉을 사용하여 원하는 세포를 신선한 한천 플레이트로 옮깁니다. 세포를 멸균 조건 하에서 쌍안경 현미경으로 분리한다. 세포가 나타날 때까지 오래된 한천 플레이트를 4°C에서 보관하고 새로운 한천 플레이트 상에서 성장시킨다.
4. 오염을 제거하기 위해 매주이 전송 단계를 반복하십시오. 육안으로 심한 오염을 감지하고 400x 배율의 현미경을 사용하여 오염을 추가로 검사하십시오.
5. 샘플에 오염이없는 것처럼 보이면 한천 플레이트에서 박테리아 또는 곰팡이 오염을 테스트하십시오. 접종 루프를 갖는 배양물의 분획을 LB²⁴ 한천 플레이트 (직경 10 cm)로 옮기고, 플레이트를 실온에서 유지하고, 1-3일에 걸쳐 오염물질의 성장을 체크한다.
6. 멸균 된 필라멘트 시아 노 박테리아 종을 얻으면 추가 배양 작업에 사용하십시오. P. lacuna를 액체 또는 박토 한천 접시에 재배하십시오. 250 mL 플라스크에 50 mL의 f/2 배지 또는 f/2⁺ 배지를 액체 배양에 사용하십시오.

2. DNA 추출

참고: 이 방법은 ^{25 26}에서 채택되었습니다. 

1. 50mL의 f/2 배지로 두 개의 플라스크를 준비합니다. 다른 성장하는 배양물에서 ∼1 mL의 P. lacuna 필라멘트로 각각을 접종한다. 배양물을 25°C에서 백색광 (50 μmol ^m-2s-1) 하에 50 rpm에서 교반 (수평 회전) 하에 7일 이상 동안 유지하였다.
2. 문화를 초음파 ( 재료 표 참조)로 2 분 동안 전체 에너지로 치료하십시오. 750 nm에서 OD를 측정하고; ~ 0.5인지 확인하십시오. OD가 너무 낮은 경우 배양물을 계속 성장시킨다.
3. 필라멘트를 5,000 × g, 20분 원심분리하여 수집한다. 상층액을 제거하십시오. 잔류 액체가 있는 필라멘트를 프렌치 프레스²⁷의 챔버로 옮깁니다. 프렌치 프레스의 압력을 20,000 psi로 설정하고 세포를 추출하십시오.
   참고 : 프랑스 언론은 모든 세포를 용해시키고 DNA를 방출합니다. 강한 전단력은 1,500 bp DNA 단편을 생성합니다.
4. 샘플을 10,000 × g 에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하였다.
5. 400 μL의 용해 완충액 (4 M 우레아, 0.1 M Tris/Cl, pH 7.4) 및 50 μL의 프로테이나제 K (10 mg/mL)를 펠렛에 첨가한다. 샘플을 550 rpm에서 진탕하면서 60분 동안 55°C로 가열한다.
6. 1 mL의 DNA 추출 완충액 (3% CTAB, 1.4 M NaCl, 10 mM EDTA, 0.1 M Tris/Cl, 1% 사르코실, 0.1 M DTT, pH 8)을 첨가하고, 55°C 및 550 rpm에서 60분 동안 인큐베이션한다. 용액을 원심분리 튜브로 옮기고 두 부피의 클로로포름 / 이소 아밀 알코올 (24/1)을 첨가하십시오.
7. 진탕 후, 샘플을 9,000 × g에서 5분 동안 원심분리한다. 상부, 수성상을 반응 바이알 내로 옮기고 1 mL의 빙냉 에탄올 및 50 μL의 3 M 아세트산나트륨을 첨가한다.
8. 샘플을 볼텍스하고 -20°C에서 1시간 이상 동안 둔다.
9. 10,000 × g (4°C)에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 버린다. 펠렛을 70% 에탄올로 세척한다.
10. 샘플을 다시 원심분리한다. 상청액을 제거하고 펠렛을 밤새 건조시킨다. DNA를 뉴클레아제가없는 물에 녹입니다. DNA 스펙트럼을 측정하여 OD 260 nm/OD 280 nm가 1.6과 1.9 사이인지 확인합니다.
11. DNA의 크기를 아가로스 전기영동 겔(²⁸) 상에서 분석한다.
12. 게놈 DNA를 300 사이클 동안 차세대 시퀀싱에 의해 서열화하고, 쌍으로 묶인 말단 설정 및 150 염기의 판독 길이를 갖는다 ( 자료의 표 참조).
13. 적절한 컴퓨터 프로그램으로 조립을 수행하는 단계; 재료 표에 주어진 예를 참조하십시오.
14. 주석을 위해 초안 게놈을 RAST 서버에 제출하십시오.
    참고: DNA 서열을 업로드하여 몇 분 안에 완전한 주석을 얻을 수 있습니다.

3. 자연 형질전환 및 GFP 발현

참고: 형질전환은 대장균에서 전파된 플라스미드 벡터에 기초한다; pGEM-T 또는 pUC19는 백본 벡터로서 사용될 수 있다. 복제 기술은 많은 실험실에서 확립됩니다. 또한 표준 프로토콜 28 및 P. lacuna^15,29에 대한 변환 벡터에 대한 기사를 참조하십시오. sfGFP 발현을 위한 벡터에 대한 예는 대표적인 결과 섹션에 기재되어 있다. 아직 게시되지 않은 네 개의 벡터에 대한 자세한 내용은 보충 파일 1에 제공됩니다.

1. 멸균 실험실 조건 (깨끗한 벤치, 멸균 유리 제품)에서 멸균 물질을 사용하여 모든 단계를 수행하십시오.
2. 실행 중인 배양물로부터 2 x 1 mL의 P. lacuna 필라멘트와 함께 2개의 250 mL 플라스크에 f/2 액체 배지 2 x 50 mL를 접종한다. ²⁵°C에서 ∼5일 동안 교반(수평 회전, 50 rpm) 하에 백색광(50 μmol m-2s-1)에서 재배한다.
3. 제조업체의 지침에 따라 미디 준비 키트 ( 재료 표 참조)를 사용하여 ~ 200 μg의 형질전환 벡터 DNA를 준비하십시오.
4. 100 mL의 P. lacuna 세포 현탁액 ( 물질 표 참조)을 10,000 rpm에서 3분 동안 균질화한다. 750nm에서 OD를 측정합니다(원하는 값 = 0.35).
5. 세포 현탁액을 6,000 × g에서 15분 동안 원심분리한다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 잔여 액체 및 추가 f/2⁺ 매질의 800 μL(잔류 액체 및 필라멘트를 포함하는 총 부피)에 현탁시킨다.
6. 120 μg/mL 카나마이신이 들어있는 여덟 개의 f/2⁺ 박토-한천 플레이트(직경 10cm)를 복용하십시오. 10 μg의 DNA를 각 한천 플레이트의 중앙에 피펫한다. 즉시 100 μL의 세포 현탁액을 각 한천 플레이트의 중간(DNA 상부)에 피펫팅한다.
7. 여분의 액체가 증발 할 수 있도록 깨끗한 벤치에 뚜껑이없는 한천 판을 유지하십시오. 플레이트를 닫고 25°C에서 2일 동안 백색광에서 배양한다.
8. 접종 루프가 있는 각 한천 플레이트의 필라멘트를 120 μg/mL 카나마이신을 함유하는 여러 개의 신선한 f/2⁺ 박토-한천 플레이트에 분배하십시오. 플레이트를 25°C에서 백색광으로 재배하고 배양물을 현미경으로 정기적으로 점검한다.
9. 현미경으로 7-28 일 후에 살아있는 변형 된 필라멘트를 확인하십시오. 다른 필라멘트와 다른 건강한 녹색 필라멘트(그림 2)를 찾습니다. 이러한 녹색 필라멘트가 확인될 수 있는 경우, 다음 단계를 계속하십시오; 그렇지 않으면 접시를 7 일 동안 더 보관하십시오.
10. 포셉을 사용하여 확인된 살아있는 필라멘트를 250μg/mL 카나마이신이 있는 50mL의 액체 f/2⁺ 배지로 옮깁니다. 쉐이커(수평 회전, 50 rpm) 상에서 25°C의 백색광에서 재배한다. 최대 네 주 동안 성장을 관찰하십시오.
11. 필라멘트를 250 μg/mL 카나마이신을 함유하는 한천 배지로 다시 옮기고 필라멘트가 자랄 때까지 기다립니다. 며칠 후, 단일 필라멘트를 카나마이신 농도가 더 높은 신선한 한천 플레이트로 옮깁니다(예: 500 μg/mL). 원래 접시를 보관하십시오.
12. 필라멘트가 액체 배양 또는 한천에서 고농도의 카나마이신으로 전파되는지 확인하십시오. 카나마이신 농도를 다시 높여 분리 속도를 높입니다.
    참고: 형질전환된 P. lacuna는 최대 10,000 μg/mL 카나마이신에서 자랍니다. 다른 종들은 그러한 높은 농도를 용납하지 않을 수도 있습니다.
13. 내성 세포가 성장하여 플레이트 위에 광범위하게 분포하는 경우, 외부 및 내부 프라이머로 PCR을 수행하여 P. lacuna 의 게놈 내로의 삽입물의 통합을 시험한다.
    1. 삽입물의 클로닝을 위해 설계된 프라이머를 내부 프라이머로서 사용한다.
    2. 외부 프라이머의 설계를 위해, P. lacuna 의 게놈 상에 제안된 삽입 부위의 5' 및 3'이지만 삽입 외부에 있는 서열을 선택한다.
    3. PCR 반응의 경우 내부 프라이머와 외부 프라이머를 사용하십시오. 내성 균주와 야생형을 사용하십시오.
       참고: 내부 프라이머는 삽입물이 존재함을 나타냅니다. 외부 프라이머는 삽입물이 정확한 유전자좌에 삽입되었음을 보여준다.
14. 각 PCR 반응에 대해 ∼10mg의 필라멘트를 PCR 튜브에 직접 넣고 표준 프로토콜²⁴에 따라 PCR을 수행합니다. 제품이 얻어지지 않으면 어닐링 온도를 변화시키고 필라멘트를 물로 씻으십시오.
    참고: 많은 다른 중합 효소는 PCR에서 사용될 수 있습니다. Taq 중합효소와 같은 표준 중합효소는 오류 검사 중합효소보다 오류율이 높으며, 이는 더 비쌉니다. 이 분석 PCR에는 오류 검사 중합효소가 필요하지 않습니다. 그러나 오류 검사 중합효소는 표준 중합효소로 PCR 산물을 얻을 수 없는 경우 검사해야 합니다.
15. 저항성 라인의 PCR 산물을 아가로스 전기영동²⁴ 상에서 분석한다.
    1. 마커와 밴드 위치를 비교하고 야생형과 변형체를 비교합니다. 내부 및 외부 프라이머를 사용하여 야생형보다 형질전환체에 대한 더 큰 밴드(저항 카세트의 삽입으로 인해) 또는 형질전환체에 대한 두 개의 밴드를 찾으십시오: 하나는 야생형 밴드의 크기와 더 큰 밴드입니다. 후자의 경우는 불완전한 분리를 나타내므로 높은 카나 마이신 농도로 재배를 계속하십시오.
       참고: PCR 및 전기영동에 대한 자세한 내용은^15,24 또는 기타 표준 문헌을 참조하십시오.
16. GFP 발현의 경우: 40x 또는 63x로 설정된 목표물의 배율에서 형광 현미경( 물질의 표 참조)으로 단일 필라멘트를 관찰한다. 밝은 필드 전송 이미지와 형광 이미지를 캡처합니다. GFP에 대해 다음과 같은 설정을 사용하십시오: 여기를 위한 470nm 대역 통과, 방출을 위한 525nm 대역 통과, 495nm 빔 스플리터, 500ms의 초기 노출 시간.
17. 포화 강도를 피하면서 투명한 형광 신호를 위해 노출 시간을 조정하십시오. 모든 샘플에 대해 동일한 설정을 사용해 보십시오.
18. 야생형 필라멘트도 형광을 표시하므로, 이 배경 형광에 대해 위와 동일한 설정으로 이미지를 캡처합니다.
    참고: GFP를 발현하는 균주는 더 높은 신호를 가져야 합니다. 그렇지 않으면, GFP를 발현하지 않는다.
19. 형광 이미지의 노출 시간 및 픽셀 강도에 기초하여, 상이한 필라멘트의 GFP 함량을 계산하고 비교한다.

4. 냉동 보존

참고: P. lacuna 및 단세포 시아노박테리움 Synechocystis sp. PCC(6803)가 사용된다. 현재의 방법은 P. lacuna에게 더 잘 작동합니다.

1. P. lacuna 또는 Synechocystissp PCC 6803을 각각 f/2⁺ 또는 BG-11 배지 10 mL에서 적어도 10일 동안 교반(수평 회전, 50 rpm) 하에 25°C에서 백색광(50 μmol ^{m-2 s-1}) 하에 배양한다.
2. P. lacuna 배양물을 10,000 rpm에서 3분 동안 또는 초음파 장치(재료 표 참조)로 전체 에너지에서 2분 동안 균질화한다. 어느 한 배양물의 OD750 nm를 확인하여 값이 1과 7 사이인지 여부를 확인한다.
3. 세포를 6,000 × g 에서 15분 동안 원심분리하여 수집한다. 상층액을 제거하십시오.
4. 세포 펠렛을 800 μL의 f/2⁺ 또는 BG-11 배지 (최종 부피)에 현탁시키고 2 mL 동결로 옮긴다. 800 μL의 50% 글리세롤 용액을 세포 현탁액에 첨가한다. 바이알을 닫고 반복 반전으로 혼합하십시오.
5. 동결을 액체 질소로 옮기고 이를 -80°C 냉동고의 냉동 박스에 보관한다. 냉동실 내의 상자의 위치와 상자 내의 샘플의 좌표를 기록하십시오.
6. 세포의 회복을 위해, 냉동 장치를 꺼내고 실온에서 내용물을 해동하십시오. 내용물을 2 mL 반응 튜브로 옮긴다.
7. 샘플을 두 번 씻으십시오. 1^차 세척을 위해, 6,000 × g 에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 f/2⁺ 또는 BG-11 배지 2 mL에 재현탁시킨다. 2^차 세척을 위해, 6,000 × g 에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 펠릿을 f/2⁺ 또는 BG-11 배지 2 mL에 현탁시킨다.
8. 배양 준비가 된 이들 세포의 완전성을 확인하기 위해, 펠렛을 9 mL의 배지로 옮기고 교반 (55 rpm) 하에 백색광 (50 μmol ^{m-2 s-1})에서 배양한다. 배양 첫날과 1주일 후의 OD750 nm를 비교하였다.

5. 포미듐 라쿠나의 운동성

참고: 세 가지 상이한 분석이 설명될 것이다. 모든 경우에 동일한 문화권이 사용됩니다.

1. 추정된 OD750 nm가 0.35가 될 때까지 백색광(50 μmol m-2 ^s-1)에서 수평 교반(50 rpm) 하에 f/2 배지에서 P. lacuna를 경작한다. 샘플을 사용할 때까지 4°C에서 보관한다.
2. 필라멘트를 10,000 rpm에서 3 분 동안 또는 초음파 (재료 표 참조)로 1 분 동안 최대 전력 및 사이클 1 분 동안 균질화하십시오 (재료 표 참조). OD 750 nm를 측정한다. 0.35 이상이면 분획을 f / 2 배지로 희석하십시오. 이 용액을 단계 5.3, 5.4 및 5.5의 운동성 검정에 사용하십시오.
3. 액체 매질에서의 이동에 대한 분석
   1. 운동성의 직접적인 관찰을 위해, P. lacuna 를 함유하는 배지 8 mL (단계 5.2로부터)를 6 cm 페트리 접시에 옮긴다. 샘플이 실온에 도달할 때까지 몇 분 정도 기다립니다. 페트리 접시를 셀로판 호일로 덮으십시오.
   2. 현미경 슬라이드를 카메라로 표준 현미경의 xy 테이블에 놓습니다. 현미경 조명을 켭니다. 이상적으로는 항상 조명에 동일한 전기 및 광학 설정을 사용하십시오. 4x 또는 10x 목표를 빛의 경로로 옮깁니다.
   3. 페트리 접시를 슬라이드 위에 놓습니다. 단일 필라멘트 또는 필라멘트 번들을 테이블의 x, y 및 z 움직임으로 조정합니다.
      참고 : 입체 배열로 인해 관련 섹션의 일부만 초점을 맞출 수 있습니다. 셀로판 호일은 제한없이 초점을 조정할 수 있습니다.
   4. 단일 필라멘트 또는 번들의 움직임을 관찰하십시오. 대물 렌즈가 액체에 닿지 않는지 확인하십시오. 표준 현미경 카메라로 필라멘트의 움직임을 기록하십시오 ( 보충 비디오 S1 참조).
4. 표면에서의 움직임에 대한 분석
   1. 한천 표면에서 필라멘트 운동성을 관찰하려면 f / 2 박토 한천으로 6cm 페트리 접시를 준비하십시오. 한천이 대물 렌즈가 한천 표면에 가까워 질 수있을만큼 충분히 높은지 확인하십시오. 또는 ~ 3mm 두께의 한천 층을 준비하고 한천을 통해 필라멘트를 기록하십시오 (플레이트를 거꾸로 유지하거나 거꾸로 현미경을 사용하십시오).
   2. 피펫 0.5 mL의 P. lacuna를 함유하는 용액 (단계 5.2로부터)을 6 cm 페트리 디쉬의 박토-한천 표면 상에 도말하였다. 액체가 표면에 들어가도록하십시오. 페트리 접시를 닫고 4x 또는 10x 목표를 사용하여 표면에서 필라멘트의 움직임을 관찰하십시오.
   3. 현미경의 동일한 전기 및 광학 설정이 기록 및 후속 녹음 전반에 걸쳐 사용되는지 확인하십시오.
   4. 안구 카메라와 미니컴퓨터 시스템을 사용하여 타임랩스 녹화를 캡처합니다. 후속 이미지 사이의 시간 간격이 5초-1분인지 확인합니다. 미니컴퓨터의 Linux 스크립트를 프로그래밍하여 타임랩스 기록을 제어합니다. 예제 로 보충 파일 2의 예제 스크립트와 보충 비디오 S2 를 참조하십시오.
5. 광택시에 대한 분석
   1. 포토택시 실험을 위해 선택한 5mm LED가 장착된 발광 다이오드(LED) 홀더(여기서는 3D 프린터 사용)를 준비하여 아래에서 위로^20mm2 의 영역을 조사합니다(그림 3). 필요한 경우 많은 LED 홀더를 병렬로 사용하여 저항기와 전위차계를 통해 각 LED를 조정 가능한 전원 공급 장치에 전기적으로 연결합니다. 실험에 따라 LED 강도를 측정하고 조정합니다. 전체 설정이 어두운 방이나 닫힌 어두운 컨테이너에 있는지 확인하십시오.
   2. P. lacuna를 함유하는 배지 8 mL(단계 5.2로부터)를 6 cm 페트리 디쉬에 넣는다. LED의 광도를 조정합니다. 뚜껑이 있는 페트리 접시를 닫고 LED 홀더에 올려 놓고 LED가 페트리 접시의 중앙에 오도록 합니다.
   3. 원하는 기간 (일반적으로 2 일) 후에 광선 처리의 위치를 직접 겨냥한 스마트 폰 카메라로 Petri 접시의 이미지를 캡처하십시오. 시편의 조사를 위해 흰색 LED 패널을 사용하십시오. 카메라의 수동 설정을 사용하십시오. 빛의 반사를 피하십시오; 항상 카메라 렌즈와 시편 사이의 동일한 거리를 갖도록 조정하십시오. 노출 설정이 ImageJ를 사용한 이후 분석에 적합한 이미지를 제공하는지 확인합니다.
   4. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 필라멘트의 중앙 원의 직경을 정량화합니다.
      1. ImageJ를 열고 파일 |를 클릭하십시오. 열고 원하는 파일을 선택한 다음 Enter 키를 클릭합니다.
      2. 직선 단추( 직선 포함)를 선택합니다. 마우스 왼쪽 버튼을 눌러 페트리 접시의 한쪽 끝에서 반대쪽 끝으로 선을 그립니다. 선이 필라멘트 원의 중심을 통과하는지 확인하십시오.
      3. 키보드에서 Ctrl-K 를 누르거나 | 분석을 클릭합니다. ImageJ 메뉴의 플롯 프로파일입니다. 페트리 접시의 1D 프로파일과 비교하여 픽셀 강도가 그려진 xy 창을 찾습니다. 가장 낮은 픽셀 강도가 0보다 약간 높고 가장 높은 값이 255보다 작은지 확인하십시오.
      4. 원 외부의 픽셀 강도에 대한 평균값과 원의 픽셀 강도에 대한 또 다른 평균값을 추정합니다. 이 값 사이의 y- 위치에서 이러한 위치에서 마우스를 가리켜 원의 양쪽의 x-값을 추정합니다. 두 값을 모두 기록하고 차이를 계산합니다.
      5. 마우스를 오른쪽의 y축으로 향하게 하여 가장 높은 x-값을 얻습니다. 이 값 e는 페트리 접시의 직경을 나타냅니다. 이 지름이 5cm이면 중앙 필라멘트 원의 지름을 d/e × 5cm로 계산합니다.

결과

상기 언급된 방법에 따라, P. lacuna 의 5개의 상이한 균주를 락풀로부터 분리하고 서열화하였다(도 1 및 표 1). 모든 배양물은 P. lacuna HE10JO를 제외한 계대 배양의 ∼1년 후에 멸균되었다. 이 균주는 여전히 해양 박테리아 인 Marivirga atlantica로 오염되어 있습니다. 후속 헬고랜드 여행 동안, 다른 필라멘트 시아 노 박테리아는 P. lacuna 와 다르며 특성화되어야하는 암석 웅덩이에서 분리되었습니다.

몇몇 DNA 추출 및 정제 방법을 P. lacuna에 대해 시험하였다. 최상의 결과는 전술한 바와 같이 최적화된 CTAB 방법으로 얻어졌다. DNA 수율은 310 ± 50 μg/mL, OD260 nm/OD280 nm는 1.7 ± 0.03, OD260 nm/OD230...

토론

시아노박테리아의 많은 균주가 배양 컬렉션^{32,33,34,35,36}으로부터 이용가능하지만^, 이들 종들이 특정 특성에 적응하기 때문에 야생으로부터 새로운 시아노박테리아에 대한 요구가 여전히 존재한다. P. lacuna는 암석 풀에서 수집되었으며 소금 농도 및 온도³⁰의 변화에 적응됩니다. 이 종의 균주는 2008, 2009 및 2010의 여행 중에 발견되었습니다. 여기에 설명 된 절차에 따라 P. lacuna의 5 균주가 분리되었고,이 균주 중 4 개는 멸균되었습니다. 균주 P. lacuna HE10JO는 rRNA 및 게놈 시퀀싱에 의해 확인된 해양 박테...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
오토클레이브 3870 ELV	Tuttnauer	3870 ELV
Bacto Agar	OttoNorwald	214010
BG-11 담수 솔루션	Sigma Aldrich	C3061
BG-11 매체	Merck	73816-250ML
붕산	Merck	10043-35-3	H3BO3
염화칼슘 이수화물	Carl Roth	10035-04-8	CaCl2 · 2 H2O
세포 배양 플라스크 Cellstar 필터 스크류 캡 포함, sterile, 250 mL	Greiner	658190
세포 배양 플라스크 Cellstar 필터 스크류 캡 포함, sterile, 50 mL	Greiner	601975
Centrifuge LYNX 4000	Thermo Scientific	75006580	및 로터
Centrifuge microstar 17	VWR International	N/A	for up to 13,000
rpm Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB)	PanReac AppliChem	57-09-0	C19H42BrN
클로로포름 : 이소아밀 알코올 24 : 1	PanReac AppliChem	A1935
코발트(II) 클로라이드 헥사하이드레이트	Merck	7791-13-1	CoCl2 · 6 H2O
구리(II) 황산염 펜타하이드레이트	Merck	7758-99-8	CuSO4 · 5 H2O
D(+)-비오틴	Carl Roth	58-85-5	C10H16N2O3S
DNA ladder 1 kb	New England Biolabs	N3232
DNA ladder 100 bp	New England Biolabs	N3231
전기 피펫팅 도움말 accujet-pro S	Brand GmbH	26360	1-25 mL
에탄올	VWR	64-17-5	C2H6O
에틸렌디아민 테트라아세트산 다이소듐 염 이수화물	Carl Roth	6381-92-6	EDTA-Na2 · 2 H2O
형광 현미경 ApoTome	Zeiss
형광 현미경 Axio Imager 2	Zeiss
French Pressure Cell Press	American Instrument Company	N/A
겔 도컴 시스템 Saffe Image	Invitrogen
Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu	ADVANCED Glassware
, different
Glycerol	Carl Roth	56-81-5	C3H8O3
Iron(III) chloride hexahydrate	Merck	10025-77-1	FeCl3 · 6 H2O
카나마이신	시그마-알드리치	25389-94-0
카나마이신 황산염	칼 로스	25389-94-0	C18H36N4O11 · H2SO4
Lauroylsarcosine, 나트륨 염 (Sarcosyl)	Sigma Aldrich	137-16-6	C15H28NO3 · Na
LB Broth (Lennox)	Carl Roth	X964.4
광원, 형광등 L18W/954 일광	OSRAM		시아노박테리아
재배 광원, LED 패널 XL 6500K 140 W	Bloom Star	N/A	시아노박테리아 재배, 최대 1,000 &마이크로; mol m-2 s-1
마그네슘 클로라이드 헥사하이드레이트	Carl Roth	7791-18-6	MgCl2 · 6 H2O
망간(II) 클로라이드 테트라하이드레이트	Serva	13446-34-9	MnCl2 · 4 H2O
현미경 DM750	Zeiss
미디 프렙 플라스미드 추출 키트 NucleoBond Xtra 미디 키트	Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG	REF740410.50
미니컴퓨터 Raspberry Pi 4 +	Conrad Electronics	2138863-YD	타임랩스 녹화용
안구 카메라 EC3	Leica		최대 30초 연속 녹화
구 카메라 MikrOkular Full HD	Bresser		라즈베리 파이 미니 컴퓨터
페트리 접시 폴리스티롤, 100 mm x 20 mm	Merck	P5606-400EA
페트리 접시 폴리스티롤, 60 mm x 15 mm	Merck	P5481-500EA
광도계 Nanodrop ND-1000	Peqlab Biotechnologie
광도계 Uvikon XS	Goebel Instrumentelle Analytik GmbH
와 결합 된 타임 랩스 기록의 경우Pipetman 100-1,000 &마이크로; L	Gilson	SKU: FA10006M
Pipetman 10-100 &마이크로; L	Gilson	SKU: FA10004M
플라스틱 피펫 10 mL, 멸균	Greiner	607107
플라스틱 튜브, 멸균, 15 mL	Greiner	188271
플라스틱 튜브, 멸균, 50 mL	Greiner	227261
포타슘 브로마이드	Carl Roth	7758-02-3	KBr
염화칼	Carl Roth	7447-40-7	KCl
전원 공급 장치 Statron 3252-1	Statron Gerä tetechnik GmbH
전원 공급 장치 Voltcraft PPS 16005	Conrad Electronics		for LED
Proteinase K	Promega	MC500C	from Maxwell 16 miRNA 조직 키트 AS1470
Q5 중합효소	New England Biolabs	M0491S
염기서열분석 키트 다음Seq 500/550 v2.5	Illumina
염기서열분석 시스템 다음Seq 550 SY-415-1002	Illumina
Shaker Unimax 2010	Heidolph 재배 기기
아세트산 나트륨	Carl Roth	127-09-3	NaCH3COO
염화나트륨	Carl Roth	7647-14-5	NaCl
인산이수소나트륨 일수화물	Carl Roth	10049-21-5	NaH2PO4 · H2O
불화나트륨	Carl Roth	7681-49-4	NaF
탄산수소나트륨	Carl Roth	144-55-8	NaHCO3
몰리브덴산나트륨 이수화물	Serva	10102-40-6	Na2MoO4 · 2 H2O
질산나트륨	Merck	7631-99-4	NaNO3
황산나트륨	Carl Roth	7757-82-6	Na2SO4
스트론튬 클로라이드 헥사하이드레이트	Carl Roth	10025-70-4	SrCl2 · 6 H2O
티아민 염산염	Merck	67-03-8	C12H17ClN4OS · HCl
TRIS	칼 로스	77-86-1	C4H11NO3
초음파 장치 UP100H sonotrode MS3	Hielscher 초음파 기술	UP100H
Ultraturrax Silent Crusher M	Heidolph Instruments		Homogenizer
Urea	Carl Roth	57-13-6	CH4N2O
비타민 B12	Sigma	68-19-9	C63H88CoN14O14P
비타민 용액			0.3 µ M thiamin-HCl, 2.1 nM 비오틴, 0.37 nM 시아노코발라민
증류기, 수처리	VEOLIA 수처리 기술	ELGA_21001
아연 황산염 헵타하이드레이트	Sigma	7446-20-0	ZnSO4 · 7 H2O
software, URL
gatb-minia DNA 조립	을 위한 프로그램https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline	짧은 DNA 판독으로 큰 스캐폴드를 만들고,
ImageJ		소프트웨어RAST
주석 서버	https://rast.nmpdr.org	입력: 게놈 DNA 염기서열, 열린 판독 프레임 감지, 단백질 염기서열 및 그 기능
Culture media
인공 해수	0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM  KCl, 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 µ M SrCl2, 72 &마이크로; M NaF
f/2 -액체 매체	인공 해수, 0.1 % (v/v) 미량 원소 용액, 0.05 % (v/v) 비타민 용액, 0.88 mM NaNO3, 36 µ M NaH2PO4
f/2+ 액체 매체	f/2-매체, 10배 증가 NaNO3 및 NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 µ M NaH2PO4
f/2+-한천	3 % (w/v) bacto 한천, 인공 해수, 0.1 % (v/v) 미량 원소 용액, 0.05 % (v/v) 비타민 용액, 8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4
f/2-한천	3 % (w / v) bacto 한천, 인공 해수, 0.1 % (v / v) 미량 원소 용액, 0.05 % (v / v) 비타민 용액, 0.88 mM NaNO 3< / sub>, 36 µ M NaH2PO4
Trace 원소 용액	0.36 mM NaH2PO4, 12 µ M Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 & 마이크로; M MnCl2
비타민 해결책	0.3 &마이크로; M 티아민-HCl, 2.1nM 비오틴, 0.37nM 시아노코발라민