Method Article

단백뇨, 백혈구의 신장 침윤 및 루푸스가 발생하기 쉬운 MRL / lpr 마우스에서 단백질의 신장 침착 분석

DOI:

10.3791/63506

⸱

June 8th, 2022

 , 
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 프로토콜은 마우스에서 루푸스 진행을 추적하는 방법을 기술한다. 세포 침윤과 신장에서의 단백질 침착을 기반으로 루푸스 신염을 특성화하기위한 두 가지 추가 절차가 제시됩니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

전신성 홍반성 루푸스 (SLE)는 알려진 치료법이없는 자가면역 질환이며 신장을 포함한 많은 장기에서 지속적인 염증을 특징으로합니다. 이러한 상황에서 신장은 혈액에서 노폐물을 청소하고 소금과 체액 농도를 조절하는 능력을 상실하여 결국 신부전으로 이어집니다. 여성, 특히 가임기 여성은 남성보다 아홉 배 더 자주 진단됩니다. 신장 질환은 SLE 환자에서 사망의 주요 원인입니다. 본 프로토콜은 수집된 소변에서 배설된 단백질 수준을 측정하여 시간에 따른 루푸스 진행을 추적하는 빠르고 간단한 방법을 기술합니다. 또한, 신장 단핵구를 분리하는 접근법은 백혈구의 신장 침윤을 조사하기 위해 크기 및 밀도 선택에 기초하여 제공된다. 또한, 사구체에서의 단백질 침착과 세뇨관 간질성 공간에서의 백혈구 침윤을 특성화하기 위해 면역조직화학 방법이 개발되었다. 함께, 이러한 방법은 루푸스가 발생하기 쉬운 MRL / lpr 마우스의 신장과 관련된 만성 염증의 진행을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

신장의 주요 기능은 물과 소금의 항상성을 유지하면서 소변을 통해 독성 물질을 제거하는 것입니다1. 이 기능은 전신성 홍반성 루푸스 (SLE) 환자에서 위협받으며, 소위 루푸스 신염 (LN)으로 이어집니다. LN은 면역 체계가 신장을 공격하여 지속적인 신장 염증을 유발하므로 혈액에서 노폐물을 청소하고 소금과 체액 농도를 조절하는 능력을 상실합니다. 이것은 결국 치명적일 수있는 신부전으로 이어질 것입니다. 신장 과정 동안, 순환 B 세포, T 세포 및 단핵구가 신장에 모집되어 케모카인, 사이토카인 및 면역 복합체 형성 자가항체를 분비한다. 이것은 궁극적으로 내피 세포 손상, 막상 손상, 신장 세뇨관 위축 및 섬유증을 초래합니다2.

MRL / Mp-Faslpr (MRL / lpr) 루푸스가 발생하기 쉬운 마우스는 인간 SLE3과 유사한 루푸스 유사 임상 징후를 나타내는 고전적인 마우스 모델입니다. 이 모델은 SLE 환자의 주요 사망 원인 중 하나 인 루푸스 신염 (LN)4을 이해하는 데 도움이되었습니다. 인간 및 마우스 SLE 둘 다에서, LN....

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Protocol

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본 프로토콜은 Virginia Tech의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 루푸스 병은 암컷에서 더 높은 발병률을 보이기 때문에 암컷 MRL / lpr 마우스 만 사용되었습니다. 샘플 수집은 4 주령에서 시작하여 15 주에 완료되었습니다. 마우스를 상업적 공급원으로부터 수득하였고( 물질의 표 참조), 기관 지침에 따라 특정 병원체가 없는 환경에서 사육되고 유지되었다.

1. 단백뇨 검사

  1. 아래 단계에 따라 소변을 수집하십시오.
    1. 70 % 에탄올을 분무하여 후드를 살균하십시오. 멸균 플라스틱 시트를 표면에 놓습니다. 팁, 1.5 mL 튜브, 및 피펫을 준비하여 약 20 μL의 액체를 수집한다.
      참고: 팁과 튜브는 멸균 상태여야 하며 사전 처리 없이 사용해야 합니다.
    2. 케이지를 가져 와서 후드 안에 넣기 전에 70 % 에탄올을 뿌리십시오.
    3. 한 손으로 마우스를 잡고 다른 손을 사용하여 복부 부위를 위에서 아래로 부드럽게 마사지하십시오.
    4. 1.5 mL 튜브 또는 피펫을 사용하여 소변을 직접 수집하거나 샘플이 떨어지면 플라스틱 시....

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Results

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이 프로토콜은 루푸스 신장염에 대한 MRL / lpr 마우스를 평가하기 위해 여러 가지 방법을 사용합니다. 첫째, 시간이 지남에 따라 신장 기능 장애로 인한 단백뇨 수치 증가를 연구하는 절차가 설명됩니다. 도 1에 나타난 바와 같이, 암컷 마우스는 대조군으로 200 μL의 인산완충식염수(1x PBS)를, 프로바이오틱 락토바실러스 루테리를 처리군으로 109 cfu/mL의 농도로 1주일에 2회 경구 위관으로 처리하였다. 치료는 3 주령에 시작되어 15 주령에 끝났습니다. L. reuteri를 처리한 마우스 그룹은 대조군보다 더 공격적인 단백뇨 진행을 가졌다.

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Discussion

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LN은 SLE 환자에서 사망의 주요 원인이며, 질병을 악화시키는 요인은 불분명하다. 이 프로토콜의 적용은 단백뇨의 측정, 단리된 신장 백혈구의 FACS 분석, 냉동 신장 절편의 면역 형광 염색을 포함한 여러 방법을 사용하여 신장 기능을 특성화하는 것입니다.

소변을 수집하는 동안 고려해야 할 한 가지 중요한 점은 하루 중 시간 및 소변 수집 위치와 일치해야한다는 것입니다. 마우스는 야행성 동물이므로 마우스가 활성화되기 전에 늦은 오후에 가장 정확한 샘플을 수집합니다. 이 시간을 선택하는 또 다른 이유는 MRL / lpr 마우스가 밤에 많은 물을 마시는 경향이 있기 때문에 희석 된 소변으로 이어지기 때문입니다. 따라서, 잘못된 시간에 수집하면 소변의 농도 및/또는 부피 변동성이 증가할 수 있습니다. 정확한 결과를 얻기 위해 가능한 한 많은 소변을 수집하는 것도 중요합니다.

브래드포드 분석은 얼마나 많은 단백질이 존재하는지에 대한 추정.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Flow Cytometry Core Facility, Histopathology Laboratory, Virginia Polytechnic Institute의 Fralin Imaging Center 및 State University의 기술 지원에 감사드립니다. 이 작업은 다양한 NIH 및 내부 보조금에 의해 지원됩니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x 트리스 완충 식염수(TBS)Thermo Fisher ScientificJ60764. K2
2-메르캅토에탄올Thermo Fisher Scientific21985-023
안티-휴먼/마우스 C3시다레인CL7632F
안티-마우스 CD138 BV711바이오레전드 142519
안티-마우스 CD45 AF700바이오레전드 103127
소 혈청 알부민시그마-알드리치A9418-100G
콜라겐 분해 효소 DSigma-Aldrich11088882001
컨포칼 현미경 LSM 880ZeissLSM 880
Coplin jarFisher Scientific50-212-281
CryomoldFisher ScientificNC9511236
구배 매체GE Healthcare17-1440-02Percoll
DEPC-Treated waterThermo Fisher ScientificAM9906
DNase ISigma-AldrichD4527
dsDNA-ECInvivoGentlrl-ecdna
에틸렌디아민테트라아세트산Fisher ScientificS311-500EDTA
EVOS M5000 현미경 이미징 시스템Thermo Fisher ScientificAMF5000
FACS 융합 세포 분류기BD BiosciencesFACS 퓨전
소 태아 세럼 - 프리미엄, 열 비활성화R& D 시스템S11150H
Fisherbrand 96-웰 폴리스티렌 플레이트Fisher Scientific12-565-501
Graphpad 프리즘GraphPadN/A
Hank' s Balanced Salt SolutionThermo Fisher Scientific14175-079
HEPES,Thermo Fisher Scientific15630-080
ImageJ 소프트웨어, National Institutes of Health,N/A
, Lactobacillus reuteri, Kandler et al.ATCC23272
MEM 비필수 아미노산Thermo Fisher Scientific11140-050
MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr)Jackson Lab485
네일 에나멜N/AN/AAny conventional
store O.C.T compoundTisse-Tek4583
PAP penSigma-AldrichZ377821
Peel-A-Way 일회용 임베딩 금형PolysciencesR-30
페니실린-스트렙토마이신Thermo Fisher Scientific15140-122
인산염 완충 식염수(PBS)Thermo Fisher Scientific70011069
피어스 20x TBS 버퍼Thermo Fisher Scientific28358
Pierce Coomassie Plus(Bradford) 분석 키트Thermo Fisher Scientific23236알부민 표준물질 포함
ProLon Gold Antifade MountantThermoFisherP36934
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32BD Biosciences553141FcR block
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875-093
Sodium pyruvateThermo Fisher Scientific11360-070
SpectraMax M5Molecular DevicesN/ASoftMax Pro 6.1 소프트웨어
멸균 세포 여과기 100 &마이크로; MFisher Scientific22363549
Tween 20Fisher ScientificBP337-500
Vancomycin HydrochlorideGoldbioV-200-1
Zombie AquaBiolegend423102유세포 분석용 형광 염료
밀도 , , ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsokos, G. C. Systemic Lupus Erythematosus. New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).
  2. Davidson, A., Aranow, C. Lupus nephritis: lessons from murine models. Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).
  3. Maldonado, M. A., et al.

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