단백뇨, 백혈구의 신장 침윤 및 루푸스가 발생하기 쉬운 MRL / lpr 마우스에서 단백질의 신장 침착 분석

신장의 주요 기능은 물과 소금의 항상성을 유지하면서 소변을 통해 독성 물질을 제거하는 것입니다¹. 이 기능은 전신성 홍반성 루푸스 (SLE) 환자에서 위협받으며, 소위 루푸스 신염 (LN)으로 이어집니다. LN은 면역 체계가 신장을 공격하여 지속적인 신장 염증을 유발하므로 혈액에서 노폐물을 청소하고 소금과 체액 농도를 조절하는 능력을 상실합니다. 이것은 결국 치명적일 수있는 신부전으로 이어질 것입니다. 신장 과정 동안, 순환 B 세포, T 세포 및 단핵구가 신장에 모집되어 케모카인, 사이토카인 및 면역 복합체 형성 자가항체를 분비한다. 이것은 궁극적으로 내피 세포 손상, 막상 손상, 신장 세뇨관 위축 및 섬유증을 초래합니다².

MRL / Mp-Fas^{lpr (MRL} / lpr) 루푸스가 발생하기 쉬운 마우스는 인간 SLE³과 유사한 루푸스 유사 임상 징후를 나타내는 고전적인 마우스 모델입니다. 이 모델은 SLE 환자의 주요 사망 원인 중 하나 인 루푸스 신염 (LN)⁴을 이해하는 데 도움이되었습니다. 인간 및 마우스 SLE 둘 다에서, LN은 면역 복합체의 신장 침착에 의해 촉발된 점진적인 염증을 특징으로 하며, 이어서 보체 활성화, 염증 세포의 모집, 및 신장 기능의 상실⁵. 면역 복합체 침착은 내재적 신장 세포에 의한 케모카인 및 사이토카인 생산을 유도하는 첫 번째 단계이며, 이는 면역 세포를 모집함으로써 염증 반응을 확장시킨다⁶. 현재의 프로토콜은 세포 침윤 및 면역 복합체 침착을 분석하는 신장 질환 진행을 따르기 위한 몇 가지 기술을 제시한다.

매주 수집되는 소변은 루푸스 발병 전, 도중, 후의 단백뇨의 시간 경과를 탐지하고 시각화 할 수 있습니다. 바이오마커로서의 단백뇨는 LN의 생물학적 진행을 결정할 수 있다. 이 기술의 다른 장점은 비 침습적이고 비용 효율적이며 구현하기 쉽다는 것입니다⁷. 신장이 완벽하게 작동하면 단백뇨 수치가 지속적으로 낮습니다. 그러나 MRL / lpr 마우스에서는 8-9 주 후에 단백뇨 수치의 점진적 증가, 즉 결국 신부전을 일으킬 정도로 충분히 높음⁸이 관찰됩니다. 여러 시약 스트립과 비색 시약이 상업적으로 이용되어 문제를 모니터링할 수 있습니다. 그러나 Bradford 분석은 단백뇨의 발병과 루푸스 신장염의 경과를 결정하는 데 저렴하고 매우 정확합니다. 이 분석은 빠르며, 시약은 샘플^9,10,11에 있을 수 있는 용매, 완충제^, 환원제 및 금속 킬레이트제의 존재에 의해 영향을 받지 ^않는다.

고려해야 할 한 가지 중요한 측면은 신장에서의 세포 침윤입니다. 이러한 침윤물은 사이토카인과 같은 가용성 인자의 분비를 촉발시켜 염증을 악화시킴으로써 병인을 촉진한다⁽¹²). 침윤물에 어떤 세포 집단이 존재하는지 더 잘 이해하기 위해, 유용한 방법은 백혈구¹³을 분리하는 것이다. 여기서, B 세포의 신장 침윤의 검출이 일례로 사용된다. 이 절차는 데옥시리보뉴클레아제(DNase)와 콜라게나제를 사용한 소화 과정으로 시작하여, 파편, 적혈구 및 조밀한 과립구를 제거하는 밀도 구배 분리로 이어집니다. B 세포 (CD19⁺) 및 혈장 세포 (CD138⁺)를 분리하는 이유는 루푸스 신장이 이들 세포를 농축시킬 수 있기 때문이다¹⁴. 신장의 작은 응집체에서 B 세포의 존재가 클론 확장과 결과적으로 면역 글로불린 (Ig) 생산을 나타낼 수 있음을 시사합니다. 혈장 세포는 이들 응집체 뿐만 아니라^{도 15}에 존재하는 것으로 잘 알려져 있다. 일단 백혈구가 단리되면, 형광-활성화 세포 분류(FACS)는 상이한 형광 접합된 항체로 염색할 때 관심있는 세포를 분석하는데 사용될 수 있다.

면역형광은 4 μm 두께의 신장 조직 샘플에서 단백질의 형광 시각화를 허용하는 면역조직화학(IHC) 검출 방법 중 하나이다. 다른 IHC 검출 방법은 분석물, 결합 화학, 및 다른 인자¹⁶의 성질에 의존한다. 면역형광은 특정 형광(또는 형광 염료)로 표지된 그의 대응물 항체에 항원을 노출시키는 신속한 동정 방법이다. 흥분하면 형광 현미경이 감지 할 수있는 빛을 생성합니다. 이 기술은 보체 C3 및^IgG2a17의 침착을 관찰하는데 사용될 수 있다. 과도한 보체 캐스케이드 활성화는 조절되지 않은 면역 반응 및 기능 상실⁽¹⁸)과 연관될 수 있다. 신장에서 항-이중 가닥 DNA (anti-dsDNA) 자가항체의 면역 침착은 주요 관심사¹⁹이며, 여기서 IgG2a 이소형을 갖는 것들은 LN²⁰과 연관되어 있다. 구체적으로, 항-dsDNA 항체는 핵 물질에 대해 더 많은 병원성 및 친화도를 나타내어, 면역 복합체(²¹)를 형성한다. IgG2a가 존재할 때, C3을 포함하는 보체 캐스케이드는 면역 복합체²²를 제거하기 위해 활성화된다. C3 및 IgG2a 마커는 개별적으로 정량화되거나 이들의 상관관계를 확립하기 위해 오버레이될 수 있다.

특히, 혈청 크레아티닌 측정은 LN²³을 진단하기 위해 현미경 혈뇨 및 신장 생검과 함께 사용할 수있는 또 다른 신뢰할 수있는 기술입니다. 그러나 단백뇨의 존재는 사구체 손상의 강력한 지표입니다. 그런 의미에서 루푸스 중 단백뇨 수준을 모니터링하면 질병 발병을 감지하고 루푸스를 진단하는 다른 방법을 보완 할 수 있습니다. 또한, 사구체에 침착된 면역 복합체는 염증 반응을 유도하고, 보체 시스템을 활성화시키고, 더 많은 염증 세포를 모집할 수 있다. 이 프로토콜의 또 다른 주목할만한 점은 신장에서의 B 세포 침윤입니다. 이것은 침윤 된 T 세포와 함께 장기 손상을 유발하는 국소 면역 반응을 증폭시킵니다. 중요하게도, LN의 분류는 현미경에서 볼 수 있는 사구체 형태학적 변화뿐만 아니라 면역형광으로 관찰된 면역 침착물에도 기초한다. 따라서이 프로토콜에서는 신장 기능 분석을위한 정확하고 비용 효율적인 방법이 실험실 환경에서 제공됩니다.

본 프로토콜은 Virginia Tech의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 루푸스 병은 암컷에서 더 높은 발병률을 보이기 때문에 암컷 MRL / lpr 마우스 만 사용되었습니다. 샘플 수집은 4 주령에서 시작하여 15 주에 완료되었습니다. 마우스를 상업적 공급원으로부터 수득하였고( 물질의 표 참조), 기관 지침에 따라 특정 병원체가 없는 환경에서 사육되고 유지되었다.

1. 단백뇨 검사

1. 아래 단계에 따라 소변을 수집하십시오.
   1. 70 % 에탄올을 분무하여 후드를 살균하십시오. 멸균 플라스틱 시트를 표면에 놓습니다. 팁, 1.5 mL 튜브, 및 피펫을 준비하여 약 20 μL의 액체를 수집한다.
      참고: 팁과 튜브는 멸균 상태여야 하며 사전 처리 없이 사용해야 합니다.
   2. 케이지를 가져 와서 후드 안에 넣기 전에 70 % 에탄올을 뿌리십시오.
   3. 한 손으로 마우스를 잡고 다른 손을 사용하여 복부 부위를 위에서 아래로 부드럽게 마사지하십시오.
   4. 1.5 mL 튜브 또는 피펫을 사용하여 소변을 직접 수집하거나 샘플이 떨어지면 플라스틱 시트에서 수집하십시오. 각 샘플에 대해 신선한 장갑, 시트 및 팁을 사용하십시오.
      참고: 그래도 문제가 해결되지 않으면 멸균 비커를 사용하여 마우스를 분리한 다음 마우스가 소변을 본 후 비이커에서 소변을 수집하십시오.
   5. 마우스를 케이지에 다시 넣으십시오. 다른 마우스를 꺼내 1.1.3-1.1.4단계를 반복합니다.
      참고 : 각 마우스에 대한 샘플을 수집 한 후 항상 플라스틱 시트와 비커를 70 % 에탄올로 청소하십시오. 통계적 유의성을 위해 그룹당 적어도 다섯 마리의 마우스가 필요하다. 소변 샘플은 최대 12개월 동안 사용할 때까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
2. 브래드포드 방법²⁴에 의해 단백질을 정량화한다.
   1. 소변 샘플, 알부민 표준 및 브래드 포드 시약을 10-20 분 동안 냉동실 외부에 보관하여 실온 (RT)에 도달하도록하십시오.
      참고: 브래드포드 시약 및 알부민 표준은 시판 키트에 포함되어 있습니다(재료 표 참조). 알부민 표준의 시작 농도는 2 mg / mL입니다. 연속 희석 (1 : 2 여섯 번)은 물로 수행해야합니다.
   2. 브래드포드 시약을 희석하지 않은 96웰 플레이트(200μL/웰)에 첨가한다.
   3. 웰 당 희석되지 않은 소변 샘플 5 μL를 피펫하고 팁을 사용하여 여러 번 위아래로 피펫하여 적절하게 혼합합니다.
   4. 표준 (400, 200, 100, 50, 25, 12.5 mg / dL)을 중복으로 추가하십시오. 두 개의 우물을 공백으로 남겨 두십시오.
      참고: 샘플 및 표준 추가는 신속하게 수행해야 합니다.
   5. RT에서 5-10 분 동안 그대로 두십시오.
   6. 제조업체의 프로토콜에 따라 플레이트 리더에서 595nm의 플레이트를 판독 하십시오 (재료 표 참조).

2. 신장 세포의 분리

1. 마우스를_CO2 (유속: 30%-70% 부피/분, 무의식 또는 사망을 달성하기 위해)로 안락사시킨 다음, 자궁경부 탈구가 뒤따르는 챔버에서 안락사시킨다. 두 신장을 모두 수집하기 위해 해부를 진행하십시오. 1 개 반 신장을 얼음처럼 차가운 C10 배지에 넣으십시오. 나머지 절반 신장을 OCT에 넣으십시오 (단계 3.1.1).
   참고: C10은 10% 소 태아 혈청, 1mM의 피루베이트 나트륨, 100x MEM 비필수 아미노산의 1%, 10mM의 HEPES, 55μM의 2-메르캅토에탄올 및 100U/mL의 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640으로 제조됩니다( 표 참조).
2. 신장을 입자 크기 (1-2 mm³ 조각)로 자르고 10 mmol / L의 HEPES가 들어있는 RPMI 1640 배지에서 콜라게나제 1 mg / mL와 DNase I ( 자료 표 참조)가 들어있는 소화 완충액 5 mL에서 37 °C에서 연속 부드럽게 흔들면서 1 시간 동안 소화하십시오.
   참고: 멸균 2mL 튜브에 소화 완충액 1mL를 넣고 멸균 가위를 사용하여 신장을 자릅니다.
3. 10 mM의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 함유하는 1x 빙냉 PBS 10 mL를 첨가하고, 얼음 상에서 10분 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 서스펜션을 두 번 와류하십시오.
4. 세포 현탁액을 100 μM 스트레이너를 통해 여과하고, 10 mL의 HBSS-full로 세척한다.
   참고: HBSS-full에는 5mM의 EDTA, 0.1% BSA 및 10mM의 HEPES가 포함되어 있습니다.
5. RT에서 10분 동안 350 x g 에서 원심분리.
6. 30%, 37% 및 70% 스톡 등장성 퍼콜(SIP) 용액을 준비한다.
   참고: 10x PBS 1 부 부피와 Percoll 9 부 부피를 혼합하여 SIP를 제조하였다 ( 자료표 참조); HBSS 전체를 사용하여 SIP를 30%, 37% 및 70% SIP로 희석합니다.
7. 세포를 30% SIP의 5 mL에 재현탁하고 5 mL의 37%(상단)와 5 mL의 70%(하단)를 로딩하여 페이스터 피펫으로 천천히 SIP 구배를 만듭니다.
8. RT에서 30분 동안 1000 x g 에서 Up9 down0(또는 브레이크 0)으로 원심분리합니다.
9. 37 % -70 % 계면에서 백혈구를 수집하고 C10 5 mL에 재현탁하십시오.
10. 4°C에서 10분 동안 350 x g 에서 원심분리한다.
11. 세포 펠릿을 3 mL의 FACS 완충액에 재현탁시킨다. 세포는 FACS 염색을 위해 준비된다.
    참고: FACS 버퍼에는 1x PBS 및 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)이 들어 있습니다.
12. 4°C에서 5분 동안 350 x g 에서 원심분리하고, 상층액(SN)을 버리고, 약 50 μL를 남긴다.
    참고: 상청액을 제거하려면 용액을 조심스럽게 붓거나 피펫을 고체에서 떼어내거나 반자동 진공을 사용하여 상층액을 흡인하십시오.
13. 튜브 당 50 μL의 FcR 블록 ( 물질 표 참조)을 추가로 (1x PBS 중 1/50으로 미리 희석); 어둠 속에서 얼음 위에서 10 분 동안 혼합하고 배양하십시오.
14. FACS 버퍼 2 mL를 넣어 세척하십시오.
15. 4°C에서 5분 동안 350 x g 에서 원심분리하고 SN을 버리고, 약 50 μL를 남긴다.
16. 20 μL의 적절한 형광 염료 (1x PBS로 1/100 희석, 표 자료 참조)를 첨가하고, 얼음 위에 15-30분 동안 방치한다.
17. 튜브 당 50 μL의 항체¹⁵ 믹스를 첨가한다: CD138-BV711 (1x PBS 중 1/200) 및 CD45-AF700 (1x PBS 중 1/200) ( 물질 표 참조).
18. 어둠 속에서 15-30 분 동안 얼음 위에서 배양하고 FACS 버퍼 3 mL를 첨가하십시오.
19. 4°C에서 5분 동안 350 x g 에서 원심분리하고, 진공 SN을 약 50 μL를 남긴다. 이것은 이제 유세포 분석기에 의해 분석 될 준비가되었습니다.

3. 면역형광염색

1. 샘플 수집을 수행합니다.
   1. 최소 절삭 온도 (OCT) 화합물로 작은 플라스틱 냉동 식품에 반 신장 을 삽입하십시오 (재료 표 참조).
   2. 폴리스티렌 폼 상자 ( 재료 표 참조)에 드라이 아이스를 넣고 드라이 아이스 위에 조심스럽게 cryomold를 놓습니다. 냉동 금형이 평평하게 놓여 있는지 확인하십시오.
      참고 : OCT 화합물이 고형화되고 흰색으로 변하는 데 3-4 분이 걸립니다.
   3. cryomold를 꺼내 알루미늄 호일로 감싸십시오. 추가로 사용할 때까지 -80°C에 보관하십시오.
      참고: 이 제품은 -80°C에서 최소 1년 동안 보관할 수 있습니다.
2. 샘플의 단면화 및 고정을 수행합니다.
   1. 샘플을 4 μm 섹션으로 자르고, 건조하기 위해 적어도 2-3 시간 동안 기다린 다음, 차가운 아세톤 (4°C에서)으로 10분 동안 고정시킨다.
      참고 : 특수 화학 후드가 필요한 아세톤을 사용할 때는주의하십시오.
   2. 슬라이드를 고정한 후, 0.5-1 h 동안 공기 건조시키고, -20°C에서 짧은 시간 동안, 또는 -80°C에서 장시간 동안 보관한다.
3. 샘플을 얼룩지게하십시오.
   1. 슬라이드를 차가운 아세톤에 5-10 분 동안 다시 고정하십시오.
   2. 섹션이 RT까지 예열되도록 합니다. 섹션 주위에 PAP 펜( 재료 표 참조)을 사용하여 말리십시오.
      참고 : 네일 에나멜도 사용할 수 있습니다. 이 단계는 항체 희석이 슬라이드 전체에 부유하는 것을 방지한다.
   3. 슬라이드를 코플린 항아리 ( 재료 표 참조)의 1x 트리스 완충 식염수 (TBS)에 20 분 동안 놓고 항아리를 쉐이커에 놓고 부드럽게 흔든다.
   4. 1x TBS를 붓고 항아리를 1x TBS, 5 % BSA 및 0.1 % 트윈 20으로 채 웁니다. 쉐이커에서 20 분 동안 배양하고 부드럽게 흔든다.
   5. 슬라이드를 꺼내 슬라이드 바닥을 닦아냅니다. 필요한 경우 슬라이드를 흔들어 건조시킵니다. 100 μL의 접합된 항체 25C3-FITC (1/100) 및 IgG2a-PE (1/100)를 상기 섹션에 첨가한다 (물질의 표 참조). RT에서 가습된 챔버에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
   6. 절편을 1x TBS, 5% BSA 및 0.1% 트윈 20에서 3회 진탕기 상에서 10분 동안 세척한다.
   7. 슬라이드를 흔들어 말리고 페이드 방지 시약( 재료 표 참조)으로 섹션을 장착한 다음 커버슬립을 장착합니다.
   8. 슬라이드를 현미경(예를 들어, 공초점 현미경 또는 이미징 시스템 현미경) 하에서 볼 때까지 4°C에서 보관한다. 소프트웨어를 사용하여 이미지를 정량화하고 영역 간의 형광 강도를 비교할 때 배경 신호를 뺍니다.
   9. ImageJ 소프트웨어를 사용한 이미지 분석 (자료 표 참조)의 경우 원하는 영역에 윤곽을 그립니다.
   10. 분석을 클릭하여 표준 매개 변수를 설정한 다음 측정 및 측정 영역 설정을 클릭하여 결과를 얻습니다.
   11. 측정 창에서 가져온 데이터를 스프레드시트로 전송합니다.
       참고: 작은 영역은 이미지에서 배경으로 선택할 수 있습니다. 형광이 없어야합니다.
   12. 완료되면 분석을 클릭하여 지역을 측정하고 이전 스프레드 시트로 데이터를 다시 전송하십시오.
   13. 여러 지역에 대해 3.3.11-3.3.12단계를 반복합니다.
   14. 보정된 세포 형광 (CCF) = 통합 밀도 (선택된 세포 영역 x 평균 배경 형광)로서 평균 형광을 계산한다.
   15. 각 지역에 대해 계산하고 그래프 및 통계 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석 합니다 (자료 표 참조).

이 프로토콜은 루푸스 신장염에 대한 MRL / lpr 마우스를 평가하기 위해 여러 가지 방법을 사용합니다. 첫째, 시간이 지남에 따라 신장 기능 장애로 인한 단백뇨 수치 증가를 연구하는 절차가 설명됩니다. 도 1에 나타난 바와 같이, 암컷 마우스는 대조군으로 200 μL의 인산완충식염수(1x PBS)를, 프로바이오틱 락토바실러스 루테리를 처리군으로 109 cfu/mL의 농도로 1주일에 2회 경구 위관으로 처리하였다. 치료는 3 주령에 시작되어 15 주령에 끝났습니다. L. reuteri를 처리한 마우스 그룹은 대조군보다 더 공격적인 단백뇨 진행을 가졌다.

그림 1: 시간에 따른 MRL/lpr 마우스의 소변에서 단백질 수준 검출. n=그룹당 5마리의 마우스. 통계는 간단한 선형 회귀 테스트로 수행되었다. *P < 0.05, **P < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 2 는 분리된 신장 백혈구의 FACS 분석을 나타낸다. 마우스를 본 실험에서 반코마이신 (2 g/L) 또는 반코마이신 플러스 대장균 dsDNA (80 μg)로 처리하였다. Vancomycin은 지시 된 기간 동안 식수와 함께 주어졌습니다. 박테리아 DNA의 경구 위관은 4, 5, 6, 및 7주령에서 4주 연속으로 일주일에 한 번 반코마이신 처리된 마우스에 투여되었다. 대장균 dsDNA는 신장 기능 저하를 초래하는 혈장 세포의 신장 침윤을 촉발시킬 것으로 예상되었지만, 유의한 차이는 발견되지 않았다.

그림 2: 분리된 신장 백혈구에서 혈장 세포의 분석. (A) 순차적 게이팅 전략: 총 세포, 단일 세포, 살아있는 세포, CD45+ 세포 및 최종적으로 CD138+ 세포. (B) 3주 동안 반(Vancomycin) 또는 van + DNA(Vancomycin + E. coli dsDNA)로 처리한 후 혈장 세포의 백분율(군당 n≥ 5마리의 마우스). 통계적 유의성('ns')은 관찰되지 않았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 3 은 여성 MRL/lpr 신장 절편에서 보체 C3 및 IgG2a의 면역형광 염색을 보여준다. 이 실험에서, C3 및 IgG2a의 신장 침착에 관한 환경 인자의 효과를 비교하였다. 사내 마우스는 여러 세대 동안 동물 시설에서 사육되었으며, 최근에 공급 업체에서 구입 한 마우스와 비교되었습니다. 면역조직화학 분석은 상이한 시설 간에 어떠한 차이도 나타내지 않았다.

도 3: 면역형광 염색을 통한 신장 절편에서 보체 C3 및 IgG2a의 검출. (A) 항-C3-FITC(녹색) 및 항-IgG2a-PE(적색)로 염색된 신장 절편의 대표적인 사진. (b) 두 그룹(군당 n≥ 5마리의 마우스) 사이의 보정된 세포 형광(CCF)의 비교. 스케일 바 = 100 μM. 통계적 유의성('ns')은 관찰되지 않았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.