우리는 침습적 세포 하위집단을 실시간으로 검출하고 포획하는 접근법을 기술한다. 실험 설계는 세포의 전기 임피던스의 변화를 모니터링하여 실시간 세포 분석을 사용합니다. 복잡한 조직에서 침습성 암, 면역, 내피 또는 기질 세포를 포획 할 수 있으며 공동 배양의 영향을 평가할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
암세포의 침윤 및 전이성 확산은 암으로 인한 사망의 주요 원인입니다. 암 세포 집단의 침습적 잠재력을 측정하기 위해 초기에 개발된 어세이는 전형적으로 상이한 침습적 잠재력을 갖는 암 세포 하위집단을 구별하지 않는 단일 종점 측정을 생성한다. 또한, 종양 미세환경은 암세포의 침습적 거동을 변화시키고 참여하는 상이한 상주 기질 및 면역 세포로 구성된다. 조직으로의 침윤은 또한 조직 리모델링 및 혈관형성 동안 미생물을 방어하거나 실질 및 내피 세포로부터 병든 세포를 제거하는 면역 세포 하위 집단에서 중요한 역할을 한다. 임피던스 바이오센서를 활용하여 세포 침윤을 모니터링하는 실시간 세포 분석(RTCA)은 침윤의 종점 측정을 넘어 중요한 진전이었습니다: 이는 시간이 지남에 따라 지속적인 측정을 제공하므로 종점 분석에서 손실되는 침윤율의 차이를 나타낼 수 있습니다. 현재의 RTCA 기술을 사용하여, 우리는 기질 및 / 또는 면역 세포를 포함 할 수있는 챔버를 추가로 추가하여 이중 챔버 어레이를 확장했으며 시간이 지남에 따라 공동 배양 된 기질 또는 면역 세포에서 분비 된 인자의 영향으로 침윤 속도를 측정 할 수 있습니다. 이 외에도, 독특한 디자인은 언제든지 챔버를 분리하고 가장 침습적 인 암 세포 또는 테스트 된 종양 분리 물의 이종 혼합물에 존재하는 다른 세포 하위 집단을 분리 할 수있게합니다. 이러한 가장 침습적 인 암세포 및 기타 세포 하위 집단은 전이성 질환으로의 악성 진행을 유도하며, 분자 특성은 심층적 인 기계론 연구, 탐지를위한 진단 프로브 개발 및 취약성 평가에 중요합니다. 따라서, 소분자 또는 거대 분자 약물의 포함은 침습적 행동을 억제(예를 들어, 암 세포) 또는 증강(예를 들어, 면역 세포)하는 것을 목표로 암 및/또는 기질 세포 하위집단을 표적으로 하는 치료법의 잠재력을 시험하는데 사용될 수 있다.
서론
세포 침윤은 세포가 기질 세포에 의해 제공되는 환경 단서에 반응하여 기저막 장벽을 통과 할 수있게 해주는 중요한 과정입니다. 면역 반응, 상처 치유, 조직 복구 및 국소 병변에서 침습성 및 전이성 암으로 진행될 수있는 악성 종양을위한 개발의 여러 단계에서 중요한 단계입니다1. 세포 집단의 침습적 잠재력을 측정하기 위해 초기에 개발된 어세이는 전형적으로 단일 종점 측정을 생성하거나 침습성 세포의 사전 표지를 필요로한다2. 마이크로 일렉트로닉스 및 미세 유체 공학 기술의 통합은 이제 마이크로 전극 3,4에서 살아있는 세포의 전기 임피던스를 사용하여 생존력, 이동 및 부착과 같은 세포 생물학의 다양한 측면을 감지하기 위해 개발되었습니다. 임피던스 측정은 세포 상태에 대한 라벨 프리, 비침습적 및 정량적 평가를 가능하게한다3. 여기에서는 Abassi et al.5에 의해 개발 된 RTCA(Real-Time Cellular Analysis) 시스템의 설계를 기반으로 한 3개의 챔버 어레이에 대해 설명합니다. 세 개의 챔버형 어레....
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프로토콜
이 연구는 조지 타운 대학의 기관 검토위원회 (IRB # 2002-022)에 의해 검토되고 "면제"로 간주되었습니다. 갓 수확한 골수 조직은 폐기된 건강한 인간 골수 수집 필터로부터 수집되었으며, 이는 비확인되었다.
1. 새로운 약실 디자인 (그림 2)
- 새로운 이중 챔버 셀 분석기 플레이트를 엽니다. 전극이있는 상단 챔버를 따로 두십시오.
- 밀링 머신을 사용하여 셀 분석기 플레이트의 U 자형 바닥 웰 2mm를 면도합니다.
- 0.2μm 기공 크기를 갖는 2cm x 7cm 폴리에테르술폰(PES) 멤브레인을 UV 경화 접착제를 사용하여 면도된 웰의 바닥에 부착한다. 접착제가 완전히 경화되고 불활성인지 확인하기 위해 30 분의 큐레이션 시간을 허용하십시오.
- 밀링 머신을 사용하여 측면을 따라 두 개의 세로 슬릿 (1.5mm x 5.6mm)을 잘라 새로 제작 된 세 번째 챔버의 능선에 스냅합니다.
- 밀링 머신을 사용하여 셀 분석기 플레이트의 전체 치수를 복제하는 세 번째 폴리 카보네이트 챔버를 만듭니다. 72 mm x 18 mm (재료 테이블<....
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결과
새로 설계된 삼챔버형 어레이를 사용하여, 섬유아세포와 같은 기질 세포의 존재 또는 부재 하에 세포의 침윤을 시험하였다. MDA-MB-231 세포 침윤은 조사된 스위스 3T3 섬유아세포(J2 균주)를 하부 챔버에 시딩할 때 강화되었고, 두 세포주 사이의 인자 교환을 허용하였다. 흥미롭게도, MDA-MB-231 침윤은 3T3-J2 세포 수가 두 배로 증가했을 때 증가하였다(도 3A). 한편, MCFDCIS 세포(DCIS-Δ4)9 의 침습성 클론의 침윤 속도는 3T3-J2 세포와의 상호작용에 의해 억제되는 것으로 보인다(도 3B). 이 데이터는 세포 침윤에 대한 스트로마, 이 경우, 섬유아세포의 다양한 효과를 측정하기 위해 삼챔버 어레이의 유용한 적용을 보여준다.
다음으로, 침습성 (MDA-MB-231)10,11
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토론
우리는 기질 세포의 존재하에 실시간으로 세포 침윤을 모니터링하기위한 세 번째 챔버를 포함하도록 이중 챔버 어레이의 설계를 수정했습니다. 우리는 침습성 및 비침습적 암 세포에 대한 공동 배양된 섬유아세포의 뚜렷한 효과를 관찰하였는데, 이는 어레이가 공동 배양된 기질 세포에 의해 생성된 인자에 다르게 반응하는 암 세포 하위집단을 구별하는데 사용될 수 있음을 나타낸다. 이 어레이는 또한 내피 세포가 기질 조직으로 침윤하는 것을 모니터링하는 데 사용되었는데, 이는 혈관이 다양한 침습 잠재력의 암세포가있는 상태에서 혈관 신생 자극을 향해 싹을 틔우는 중요한 단계입니다. 이들 실험은 암 세포 또는 다른 세포 단리를 위한 어레이의 다목적 사용을 보여준다.
각 챔버에 추가할 셀 수를 최적화하는 것이 좋습니다. 우리의 경험과 제조업체의 권장 사항에서 30,000-50,000 개의 세포가 최적입니다. 두 가지 세포 유형이 이 어레이에서 공동 배양될 수 있기 때문에, 그 중 하나는 스트로마 세포의 .......
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공개 사항
조지 타운 대학은이 원고에 설명 된 접근법 중 일부와 관련된 특허를 출원했습니다. G.M.S, A.W, L.D 및 M.P는 이 출원에서 발명가로 명명되고 잠재적인 이해 상충으로 선언된다.
감사의 글
유타 대학교 헌츠만 암 연구소의 알라나 웰름스 박사에게 환자 유래 이종이식편(HCI-010)을 제공해주신 것에 대해 감사드립니다. 이 작업은 NIH 보조금 R01CA205632, R21CA226542 및 부분적으로 애질런트 테크놀로지스의 보조금으로 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25300-054 | |
| 접착제 | Norland 광학 접착제 | NOA63 | |
| 소 혈청 알부민(BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell lifter | Sarstedt | 83.1832 | |
| Vibrio cholerae의 콜레라 독소 | Thermofisher | 12585-014 | |
| CIM-plate | 애질런트 | 5665817001 | 세포 분석기 플레이트 |
| 클로스트리듐 히스톨리티쿰의 콜라겐분해 | 시그마 | C0130 | |
| 디스페이즈 | 스템셀 | 7913 | |
| DMEM | 써모피셔 | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | 써모피셔 | 11875-093 | |
| 소 태아 혈청(FBS), 열 비활성화 | 오메가 사이언티픽 | FB-12 | |
| HEPES | Thermofisher | 15630106 | |
| 호스 세럼 (HS) | Gibco | 16050-122 | |
| 인간 EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| 인간 배꼽 정맥 내피 세포 (HUVEC) | LONZA (RRID : CVCL_2959) | C-2517A | |
| HUVEC 매체 | LONZA | CC-3162 | |
| 하이드로 코르티손 | 시그마 | H4001 | |
| 인슐린 트랜스페린 셀레늄 에탄올아민(ITSX) (100x) | Thermofisher | 51500056 | |
| 인슐린, 인간 재조합, 아연 용액 | Sigma | C8052 | |
| J2 섬유아세포 | 줄기세포(RRID:CVCL_W667) | 100-0353 | |
| LymphoPrep | 줄기세포 | 7851 | 단핵 세포 분리를 위한 밀도 구배 배지 |
| Matrigel | Corning | 354230 | 기저막 매트릭스 |
| MCFDCIS.com 셀 (DCIS) | RRID:CVCL_5552 | ||
| MDA-MB-231 셀 | RRID:CVCL_0062 | ||
| 밀링 머신 | Bridgeport Series 1 수직 | ||
| 인산염 완충 식염수 (1x) | Thermofisher | 10010049 | |
| 폴리에테르설폰( PES) 멤브레인 | Sterlitech | PCTF029030 | |
| RBC 용해 용액 | Stemcell | 7800 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| RTCA DP 분석기 | Agilent | 3X16 | 이중 목적 세포 분석기 |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
참고문헌
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of anti....
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