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방법 논문

질량분석법(Mass Spectrometry)을 이용한 초파리 광수용체의 지질 신호 분석

1.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/63516

⸱

2022년 3월 7일

 ,  ,  , 
1National Centre for Biological Sciences-TIFR, GKVK Campus, 2Department of Cell Biology, Yale University, 3Department of Neuroscience, Brown University

이 논문에서

요약

이 원고는 초파리 광수용체에서 여러 종류의 지질을 식별하고 정량화하기 위해 다재다능하고 강력하며 민감한 질량 분석 프로토콜을 제시합니다.

초록

포스포리파제 Cβ(PLCβ)의 활성화는 초파리 광수용체에서 감각 전달 중 필수적인 단계입니다. PLCβ 활성은 막 지질 포스파티딜이노시톨 4,5 비스포스페이트[PI(4,5)P2]의 가수분해를 일으켜 궁극적으로 일시적 수용체 전위(TRP) 및 TRP 유사(TRPL) 채널의 활성화로 이어집니다. PLCβ의 활성은 또한 많은 지질 종의 생성으로 이어지며, 그 중 일부는 TRP 및 TRPL 활성화에 중요한 역할을 하는 것으로 제안되었습니다. 또한, 최적의 감각 전달을 위한 신호 반응을 최적화하기 위해 광수용체의 세포 생물학을 구성하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 여러 종류의 지질이 제안되었습니다. 역사적으로 이러한 발견은 특정 지질의 수준을 조절하는 효소를 위해 초파리 돌연변이를 분리하고 이러한 돌연변이의 광수용체 생리학 분석을 수행하는 능력에 의해 주도되었습니다. 보다 최근에는 높은 민감도와 특이성을 가진 지질의 분리 및 정량 분석을 위한 강력한 질량 분석 방법이 개발되었습니다. 이는 특히 초파리(Drosophila )에서 사용하기에 적합하며, 이제 방사성 핵종 표지 없이 광수용체에서 지질 분석이 가능합니다. 이 기사에서는 초파리 광수용체의 다양한 신호 지질에 대한 강력하고 민감하며 정확한 정량적 평가를 위해 지질 질량 분석법을 사용할 때 고려해야 할 개념 및 실제 고려 사항을 다룹니다. 분자 유전학 및 생리학적 분석의 기존 방법과 함께 이러한 지질은 생물학 발견을 위한 모델 시스템으로서 광수용체의 힘을 향상시킬 가능성이 높습니다.

서론

초파리의 광전달은 G-단백질 결합 PLCβ 캐스케이드에 의해 매개되어 광 활성화 채널 TRP 및 TRPL1의 활성화로 이어집니다. PLCβ는 막 결합 인지질, 포스파티딜이노시톨 4,5 비스포스페이트[PI(4,5)P2]를 가수분해하고 디아실글리세롤(DAG) 및 이노시톨 1,4,5 트리인산염(IP3)을 생성합니다. 그런 다음 DAG는 DAG-키나아제에 의해 인산화되어 포스파티드산(PA)을 생성합니다. 그 후, 지질 중간체의 생성을 포함하는 일련의 반응을 통해 PI (4,5) P2 가 재생됩니다2 . 이 PI (4,5) P2 사이클의 여러 구성 요소는 초파리 광 수용체에서 기능을 수행합니다. PLC 활성화가 TRP 및 TRPL 채널 게이팅으로 이어지는 메커니즘은 아직 해결되지 않았습니다. 그러나 PI(4,5)P2 가수분해에 의해 생성된 지질 중간체가 이 과정을 매개할 수 있음을 시사하는 여러 가지 증거가 있습니다3. 따라서 초파리 광형질전환에서 TRP 및 TRPL의 활성화 메커니즘을 밝히기 위해 이러한 지질 중간체를 식별하고 정량화하는 것이 매우 중요합니다. 광전달(phototransduction) 그 자체에서의 역할 외에도, 지질은 광수용체(photoreceptor)의 세포 조직(cellular organization)에서 몇 가지 중요한 역할을 합니다(3에서 검토). 지질의 이러한 기능적 역할을 이해하는 것은 in vivo에서 지질 수준을 검출하고 정량화하는 능력에 의해 도움이 됩니다. 이 기사는 Drosophila 광수용체에서 지질을 정량화하는 방법의 선택 및 구현에 대한 개요와 프로토콜을 제공합니다.

역사적으로 지질 분석은 화학 등급에 의한 분별 후 개별 등급에 대한 분석으로 구성되었습니다. 지질을 성공적으로 식별하고 정량화하기 위해 표적 또는 비표적 지질 분석인 많은 분석 방법이 개발되었습니다 4,5,6,7,8,9,10. 표적 분석은 알려진 지질에 초점을 맞추고 이러한 특정 지질의 정량적 분석을 위해 민감도가 높은 특정 방법을 활용합니다. 비표적 지질 분석은 샘플에서 많은 지질 종을 동시에 검출하는 것을 목표로 합니다. 이러한 분석 방법에는 박층 크로마토그래피(TLC)4, 기체 크로마토그래피(GC)5, 액체 크로마토그래피(LC)6, 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)7, 핵자기공명(NMR)8, 방사성 핵종 라벨링 및 질량 분석법(MS)9,10이 포함됩니다. 방사성 표지는 지질 검출을 위한 민감한 방법이며 배양된 세포와 관련하여 사용할 수 있지만, 초파리와 같은 온전한 유기체의 지질 분석에 사용하는 것은 살아있는 비행 동물의 방사성 표지에 대한 안전성 고려 사항으로 인해 까다롭습니다. 방사성 표지의 또 다른 과제는 모든 전구체 풀을 거의 평형에 가깝게 표지하는 데 의존한다는 것이며, 이는 생체 내 모델의 맥락에서 어려울 수 있습니다.

MS를 사용한 포괄적인 지질 분석은 현대 MS 기술의 개발로 인해 가능해진 최근의 발전입니다11. MS 기반 지질 분석은 작은 시료 크기, 동물 모델 시료에 대한 적용 가능성, 높은 감도, 특이성 및 높은 처리량 등 여러 가지 이점을 제공합니다. 특히, 전기 분무 이온화의 광범위한 사용은 지질 분석을 위한 MS의 성능 향상으로 이어졌습니다. 다양한 질량 분석기의 조합을 포함하여 질량 분석기의 개선은 추가적인 이점을 추가했으며 고분해능 질량 분석기의 개발로 지질 연구가 부활했습니다11. MS 기반 분석은 두 가지 주요 방법으로 지질 분자를 특성화합니다: (1) MS 실험이 지질체 내 전반적 변화의 신속한 정량적 특성화를 목표로 하고 온전한 지질 전구체의 정확한 질량에만 전적으로 의존하는 하향식 지질체학12; (2) 상향식 지질체학(Bottom-up lipidomics)은 탠덤 MS13,14를 사용하여 특징적인 구조적 단편 이온을 검출하여 개별 분자 종을 정량화합니다.

전반적으로 초파리 광수용체의 지질 분석은 두 단계로 구성됩니다: 첫 번째는 눈/머리 조직에서 지질을 추출하는 것이고 두 번째는 다발성 경화증에 의해 추출된 지질을 분석하는 것입니다. 이는 MS에 결합된 액체 크로마토그래피(LC)에 의한 지질 분리 또는 샷건 지질체학/직접 주입 MS(DIMS)를 사용한 크로마토그래피 분리 없이 수행할 수 있습니다. 두 지질 프로파일링 접근법 모두 전기 분무 이온화 MS(ESI-MS)의 사용을 기반으로 하며 민감하고 정량적이며 효율적인 것으로 입증되었습니다10,15. DIMS 분석에서 지질의 식별은 전구체 이온 질량, 중성 손실 스캔 및 지질 등급 특이적 시그니처 14,16,17,18을 기반으로 합니다. 이 접근법은 분석 속도와 견고성을 결합하지만, 샘플에 고농도 및 고분극성 지질의 존재로 인한 저농도 지질의 이온 억제는 피할 수 없습니다. 따라서 포스포이노시티드 및 PA와 같은 저농도 지질은 다른 이유 중에서도 이온 억제로 인해 표준 DIMS 플랫폼에서 검출되지 않거나 제대로 검출되지 않는 경우가 많습니다19,20. MS (LC-MS) 전에 액체 크로마토그래피를 분리하면 이온 억제를 극복하고 특정 관심 지질 종 또는 종에 대한 분석에 집중할 수 있습니다21.

이 기사에서는 Drosophila 광수용체에서 관심 있는 주요 지질을 정량화하는 데 관련된 단계에 대해 설명합니다. 이와 관련하여 (1) 고분해능 질량 분석기를 사용한 DIM, (2) 삼중 4중 질량 분석기를 사용한 유도체화 후 역상 액체 크로마토그래피-MS(RPLC-MS), (3) 순상 액체 크로마토그래피-다중 반응 모니터링-향상된 생성물 이온 스캔 기능을 갖춘 삼중 4중 질량 분석기를 사용한 향상된 제품 이온 스캔-MS(NPLC-MRM-EPI-MS)의 세 가지 MS 접근 방식이 최적화되었습니다. 이러한 방법 간의 선택은 조사 중인 특정 연구 질문에 따라 결정됩니다. 광전달에 관여하는 모든 종류의 글리세로인지질에 대한 전반적인 설명 및 분석을 위해 DIMS를 사용해야 합니다. 그러나, 이 접근법에서는 포스포이노시티드(phosphoinositides)와 같은 저분극 및 저농도의 글리세로인지질이 검출될 가능성이 없다는 점에 유의해야 한다22. 이러한 저농도 지질을 검출하려면 유도체화 후 RPLC-MS를 수행해야 합니다. 이 접근법을 사용하여 포스파티딕산(PA)23,24,25, 포스파티딜이노시톨(PI), 포스파티딜이노시톨 5인산염(PI5P)26, 포스파티딜이노시톨 4인산염(PI4P) 및 PI(4,5)P227을 성공적으로 검출하고 정량화했습니다. DIMS 및 유도체화 후 RPLC-MS 방법은 지질 등급 수준 정보를 생성합니다. 예를 들어, 이 두 가지 방법을 사용하면 m/z가 (i) PA (16:0/18:2), (ii) PA (18:2/16:0), (iii) PA (16:2/18:0), (iv) PA (18:0/16:2), (v) PA (16:1/18:1), (vi) PA (18:1/16:1), (vii) PA (14:2/20:0) 및 (viii) PA (20:0/14:2)를 포함한 여러 분자 종과 일치합니다. 이러한 방법을 사용하면 샘플에 존재하는 PA(34:2)의 지방 아실 사슬 조성에 대한 정보를 얻을 수 없습니다. 이 문제는 LC 분리, 다중 반응 모니터링(MRM) 및 향상된 제품 이온 스캔(EPI)을 결합하는 하이브리드 MS 분석법으로 극복할 수 있습니다. 이 방법은 민감하고 정량적이며 직접 측정, 즉 샘플의 사전 라벨링 또는 사후 처리 없이 정확한 지방 아실 사슬 정보로 분자 종을 설정합니다25. 이 방법을 사용하여 많은 수의 PA 분자 종을 확인하고 글리세롤 골격의 SN1 및 SN2에서 지방 아실 사슬의 정확한 구성을 결정했습니다. 이 접근법은 광수용체에서 모든 종류의 지질에 대한 특정 분자 종의 기능을 분석할 때 유용합니다. 이러한 각 유형의 분석에 대해 여기에 제시된 자세한 프로토콜은 초파리 광수용체 기능과 관련된 다른 신호 지질에 맞게 조정할 수 있습니다(도식은 그림 1 참조). 다른 여러 종류의 지질에 대한 지질체학 분석에 대한 자세한 방법(이 기사에서 다루지 않음)은 다른 곳에서 설명되었다는 점에 유의해야 합니다. 여기에는 세라마이드28,29, 스핑고지질30,31, 디글리세리드 및 트리글리세리드와 같은 중성 지질32,33, 스테롤15,33이 포함됩니다. 일부 경우에서, 이러한 지질의 분석 방법은 초파리 유충 조직에 대해 설명되었으며 광수용체에 사용하기 위해 조정될 수 있습니다.

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프로토콜

1. 파리 사육 및 화학 물질 제조

  1. 내부 조명이 없는 25°C에서 50%의 상대 습도를 가진 인큐베이터에서 표준 파리 먹이에 대한 후방 파리(Drosophila melanogaster). 옥수수 가루 80g/L, D-글루코스 20g/L, 자당 40g/L, 한천 8g/L, 효모 추출물 15g/L, 프로피온산 4mL, TEGO(메틸 파라 하이드록시벤조에이트) 0.7g/L, 오르토인산 0.6mL를34 에 설명된 대로 첨가하여 플라이 푸드를 준비하며 https:// 에서도 사용할 수 있습니다. bangalorefly.ncbs.res.in/drosophila-media-preparation. ~2,000lux의 연속 백색광 조명으로 25°C로 유지되는 냉각 인큐베이터에서 퇴화 후 파리 한 쌍을 성장시킵니다.
  2. 클로로포름:메탄올:2.4M 염산을 250:500:200(vol/vol/vol)의 비율로 첨가하여 포스포이노시티드 용출 완충액(PEB)을 준비합니다. 메탄올:1M 염산:클로로포름을 235:245:15(vol/vol/vol)의 비율로 첨가하여 저상 세척 버퍼(LPWS)를 준비합니다. 클로로포름:메탄올:물을 8:4:3(vol/vol/vol) 비율로 첨가하여 유도체화 후 세척 용액을 준비합니다.
    참고: MS 등급 용제 및 화학 물질을 사용하십시오. PEB 및 LPWS 버퍼를 3개월 이상 보관하지 마십시오.
  3. 포스포이노시티드의 경우 C4(1.7μm x 1mm x 100mm) 컬럼, PI4P 및 PI(4,5)P2 의 경우 C4(1.0mm x 100mm x 1.7mm) 컬럼을 사용하고 PA, 포스파티딜콜린(PC) 및 포스파티딜이노시톨(PI)의 경우 C18 컬럼(1.0mm x 100mm x 1.7mm)을 사용합니다. NPLC-MRM-EPI 방법의 경우 실리카 컬럼(1mm x 150mm x 3μm)을 사용합니다.
  4. 헥산:이소프로필 알코올:100mM 수성 암모늄 아세테이트를 68:30:2(vol/vol/vol) 비율로 첨가하여 용리액 A를 준비하고 PA, PC 및 PI에 대해 헥산:이소프로필 알코올:100mM 수성 암모늄 아세테이트를 첨가하여 용리액 B를 준비합니다. 물에 0.1% 포름산을 첨가하여 포스포이노시티드에 대한 용매 A를 준비하고 아세토니트릴에 0.1% 포름산을 첨가하여 용매 B를 준비합니다.

2. 조직의 격리

  1. 이산화탄소(CO2) 마취를 사용하여 샘플당 파리 10마리를 수집하고(파리는 몇 초 안에 움직이지 않음) CO2 마취판의 날카로운 칼날을 사용하여 파리의 목을 베십시오.
  2. 정의된 연령(12-24시간)의 어둡거나 밝은 파리를 1.5mL 튜브에 수집하고 액체 질소에서 스냅 동결합니다. 유리 바이알35에서 -80 °C에서 48 시간 동안 아세톤으로 파리를 탈수합니다. 망막 조직의 경우 동결 건조 파리에서 망막 100개를 수집합니다. 메스를 사용하여 머리의 나머지 부분에서 눈을 제거하고 망막을 퍼냅니다.
  3. 포스포이노시티드 PI4P 및 PI(4,5)P2 분석의 경우, 신선한 망막으로 작업할 때 조명 중 지질 수치를 측정하기 위해 적절한 조명 조건에서 자란 파리와 어둠 속에서 지질 수치를 측정하기 위해 빛 없이 자란 파리에서 샘플당 25개의 망막을 사용합니다. 추출 준비가 될 때까지 드라이 아이스에서 균질화 튜브에 50μL의 1x PBS를 보관하십시오.

3. 지질 추출

주의: 클로로포름은 독성 용매이며 본질적으로 발암성입니다. 생식 기관에 영향을 미치고 피부와 눈을 자극합니다. 이 화학 물질을 취급할 때 주의를 기울여야 합니다. 클로로포름과 관련된 모든 단계는 환기가 잘 되는 화학 물질 후드에서 수행해야 합니다.

  1. PI4P 및 PI(4,5)P2를 제외한 모든 글리세로인지질의 경우
    1. 각 샘플에 대해 0.1mL의 0.1N 빙냉 메탄올 HCl 및 30μL의 내부 표준 혼합물(PA(17:0/14:1), PC(17:0/14:1), 리소포스파티딕산(LPA; 13:0), 리소포스파파티딜콜린(LPC; 13:0), LPC(17:1), PA(17:0/17:0), PA(16:0-D31/18:1), LPA(17:1), LPC(19:0), PI(12:0/13:0), PA(12:0/13:0) 및 PC(12:0/13:0)). 지질 표준물질의 최종량이 질량분석기의 선형 반응 곡선 내에 포함되도록 표준물질을 준비합니다.
    2. 모든 시료를 빠르고 동시에 처리할 수 있는 자동 균질기를 사용하여 조직을 균질화합니다. 탁상용 원심분리기에서 튜브를 간단히 회전시키고 펠릿이 형성되지 않았는지 확인하십시오-이는 완전한 균질화를 나타냅니다. 메탄올 균질산염을 2mL 캡이 있는 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
    3. 튜브의 잔류 물질을 회수하기 위해 0.2mL의 얼음처럼 차가운 0.1N 메탄올 HCl을 추가하고 2mL 튜브에 결합합니다. 0.1N의 얼음처럼 차가운 메탄올 HCl 0.1mL를 넣고 클로로포름 0.8mL를 넣고 철저히 섞습니다. 조직 균질액을 포함하는 혼합물을 얼음 위에 10분 동안 그대로 두었다가 0.4mL의 0.88% KCl과 와류를 30초 동안 첨가합니다.
    4. 혼합물을 1,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 수성 상과 유기상을 분리합니다. 지질이 포함된 하부 유기상을 수성상과 혼합하지 않고 매우 조심스럽게 꺼내 새로운 2mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
      참고: 지질을 추출하는 동안 다운스트림 지질 분석을 방해할 수 있는 수성상과 혼합되지 않도록 최대한 주의하여 하부 유기상을 전달하십시오.
    5. 이 지질 용액을 4°C의 진공 증발기에서 건조하고 샘플을 육안으로 검사하여 완전히 건조되었는지 확인합니다. 분석을 위해 420μL의 2:1 메탄올:클로로포름 혼합물에 재현탁합니다. 보관 없이 즉시 샘플을 분석합니다.
  2. 포스포이노시티드 PI4P 및 PI(4,5)P2의 경우
    1. 950μL의 포스포이노시티드 용출 완충액(PEB; 250mL의 CHCl3, 500mL의 메탄올 및 200mL의 2.4M HCl)에서 25개의 망막을 균질화하고 내부 표준물질(포스파티딜에탄올아민(PE) 17:0/14:1; 파이 (17:0/14:1); PI4P (17:0/20:4); 및 샘플당 PI 50ng, PI4P 25ng, PI(4,5)P2 50ng 및 PE 0.2ng를 포함하는 PI(4,5)P2 (16:0/16:0)) 혼합물.
    2. 클로로포름 250 μL와 2.4 M HCl을 각각 첨가 한 후 2 분 동안 초음파 처리 및 1,000 x g 에서 5 분 동안 원심분리 상 분리를 위해 4 °C에서 5 분 동안 원심분리를 수행합니다. 하부 유기상을 새 튜브에 넣고 900μL의 LPWS로 세척한 후 1,000 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
    3. 3.2.2단계와 같이 다시 한 번 상 분리를 수행하여 나머지 수성상에서 지질을 추출합니다. 수집된 유기물을 4°C로 설정된 진공 원심분리기에서 건조하고 샘플을 육안으로 검사하여 완전히 건조되었는지 확인합니다.

4. 유기 인산염 분석

  1. 7.34 mM KH2PO4의 원액을 만듭니다. 증류수를 사용하여 표 1과 같이 마이크로 원심분리기 튜브에서 표준 희석액을 만듭니다. 튜브를 가볍게 와류로 회전시키고 표준 희석액을 인산염이 없는 유리관으로 옮깁니다.
  2. 지질 샘플이 들어 있는 별도의 유리관 세트를 준비합니다. 630 nm에서의 흡광도(이 프로토콜 완료 후)가 표준 KH2PO4 (0 - 20x) 범위 내에 있도록 지질 샘플의 부피를 최적화합니다.
  3. 표준 희석액이 들어있는 유리관을 120 ° C에서 가열하여 완전히 건조시킵니다. 지질 샘플이 들어있는 유리관을 90 ° C에서 90 ° C에서 가열 (표준 KH2PO4 범위 내에서 흡광도를 갖는 데 필요한 총 샘플 부피의 1/8 차지).
  4. 모든 튜브에 70% 과염소산 50μL를 추가하고 180°C에서 30분 동안 가열합니다. 튜브를 실온으로 식히십시오. 각 튜브에 물 250μL, 2.5% 몰리브덴산암모늄 50μL 및 10% 아스코르브산 50μL를 추가합니다.
    참고: 2.5% 몰리브덴산암모늄과 10% 아스코르브산은 중량/부피 농도입니다. 갓 만들어야 하며 최대 1주일 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.
  5. 튜브를 37°C의 진탕 인큐베이터에 1시간 동안 보관합니다. 130μL의 샘플을 96웰 플레이트에 부분 표본으로 삽입하고 분광 광도계를 사용하여 630nm에서 흡광도를 측정합니다.

5. 유도체화

주의: TMSD(Trimethylsilylyldiazomethane)는 인간에게 많은 독성학적 영향을 미치는 것으로 보고되었습니다. 용액의 TMSD는 신장, 간, 위장관, 골격근, 중추신경계, 호흡기 및 생식계를 표적으로 합니다. 이 화학 물질을 취급하는 동안 각별한 주의를 기울여야 합니다. 전체 공정은 환기가 잘 되는 화학 물질 후드에서 수행해야 합니다.

  1. 3.2.3 단계의 끝에서 얻은 샘플의 하부 유기 상에 2M TMSD 50 μL를 첨가합니다. 250rpm에서 일정한 진탕으로 10분 동안 실온에서 반응을 진행하도록 합니다. 10 분 후, 10 μL의 빙초산을 첨가하여 용액에서 노란색이 사라지는 것으로 표시되는 반응을 담금질합니다.
  2. 튜브를 두드리고 조심스럽게 열어 담금질 반응에서 형성된 N2 를 제거합니다. N2 가스가 빠져 나간 후 튜브를 닫고 스핀 다운하십시오. 그런 다음 600μL의 유도체화 후 세척 용액을 추가하고 250rpm의 믹서에서 2분 동안 와류를 넣습니다.
  3. 형성될 상부상에서 ~400μL를 버립니다. 5.2단계를 반복합니다. 상부 상 전체를 버리고 하부 상에 90% 메탄올 50μL를 첨가하고 혼합합니다.
  4. 진공 상태에서 작동하는 800 x g 의 원심 농축기에서 2시간 동안 샘플을 건조합니다. 건조 후 튜브에는 나머지 샘플의 ~20μL가 포함되어야 합니다. 180μL의 100% 메탄올을 넣고 잘 혼합한 후 LC-MS/MS 전에 최대 2-3일 동안 4°C에서 보관하십시오.

6. 데이터 수집 및 분석

  1. 직접 주입 MS(DIMS)에서 데이터 수집
    참고: MS는 직접 주입 또는 액체 크로마토그래피 MS(LC-MS) 방법으로 수행할 수 있습니다. 이 섹션에서는 직접 주입 기반 MS에 대해 설명합니다.
    1. 실험을 시작하기 전에 제조업체의 지침에 따라 질량 분석기를 보정하십시오.
    2. 합성 표준물질의 희석 시리즈에 대한 선형 반응 곡선을 생성하고 기기의 선형 반응을 기반으로 지질 분석물의 강도가 기기의 선형성 내로 떨어지도록 샘플을 희석합니다. 총 지질 추출물 또는 지질 표준물질을 2:1 메탄올:클로로포름(vol/vol)의 혼합물로 희석합니다. 각 실험에 대해 총 지질 추출물과 합성 표준물질의 희석을 개별적으로 선택합니다.
    3. 추출물과 표준물질을 개별 바이알로 옮깁니다. MS의 샘플 바이알로 샘플을 옮기는 동안 기포를 피하십시오. 기포는 컬럼에 높은 압력을 생성하여 지질 분석을 방해합니다.
    4. 분석 전에 6,440 x g 에서 9분 동안 샘플을 원심분리하고 96웰 플레이트에 로드하고 알루미늄 호일로 밀봉합니다.
    5. 직접 주입 방법을 사용하여 고분해능 질량 분석기에서 MS 분석을 수행합니다. 직경 4.1μm의 스프레이 노즐이 있는 칩을 사용하는 로봇 나노 흐름 이온 소스를 사용하여 글리세로인지질의 안정적인 ESI 기반 이온화를 달성합니다.
    6. 맞춤형 질량 분석기 소프트웨어를 사용하여 이온 소스를 제어하고 양극 및 음극 모드에서 각각 +1.2kV 및 -1kV에서 이온화 전압을 설정합니다. 두 모드 모두에서 1psi의 배압; 그리고 180 °C에 이온 이동 모세관의 온도. 질량 분해능, Rm/z400 = 100,000으로 수집을 수행합니다. 질량 분석기 매개변수를 설정하기 위한 소프트웨어 인터페이스는 그림 2A 를 참조하십시오.
    7. 건조된 총 지질 추출물을 400μL의 클로로포름:메탄올(1:2)에 재용해합니다. 분석을 위해 60μL의 샘플을 96웰 플레이트 이온 소스에 로드하고 알루미늄 호일로 밀봉합니다. 양이온 모드에서 각 샘플을 20분 동안 분석하여 PC, 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜에탄올아민(PE), PE-O(에테르 결합 포스파티딜에탄올아민), 세라마이드(Cer) 및 세라미드 포스페이트(Cer-P)를 검출합니다.
    8. PA 및 PI가 검출된 20분 동안 음이온 모드에서 독립적인 수집을 수행합니다. 고분해능 MS를 위한 데이터 수집을 위한 기기 설정에 대한 자세한 내용과 데이터 의존적 수집(DDA) 설정에 포함된 PA 종의 대상 목록은 그림 2B 를 참조하십시오.
      알림: DDA 방법 설정을 위한 소프트웨어 인터페이스는 그림 2C에 나와 있습니다. 이 접근법에서 표적으로 하는 PA 분자 목록은 표 2에 나열되어 있습니다. DDA 접근 방식의 실험 결과 스크린샷은 그림 2D에 나와 있습니다.
  2. 직접 주입 MS(DIMS)의 데이터 분석
    참고: 모든 유형의 질량 분석기에서 생성된 질량 데이터를 분석하려면 자동화된 지질 분석 플랫폼이 필요합니다. LipidXplorer36 은 모든 유형의 DIMS 지질 실험을 지원하는 비상용 소프트웨어입니다. 이 소프트웨어는 여기에서 찾을 수 있습니다 : https://www.mpi-cbg.de/research-groups/current-groups/andrej-shevchenko/projects/lipidxplorer/
    1. 6.1단계에서 설명한 방법을 사용하여 데이터를 획득한 후 지질 분석 플랫폼을 사용하여 단일 동위원소 피크의 m/z 를 해당 원소 조성 제약 조건과 일치시켜 지질 종을 식별합니다. 데이터 가져오기 예는 그림 3A에 나와 있습니다. 질량 허용 오차를 10ppm으로 설정하고 질량 분석기 소프트웨어에서 보고한 노이즈 수준에 따라 intensity threshold를 설정합니다.
    2. 가져온 후 그림 3B에 표시된 PA의 화학 구조를 기반으로 PA에 대한 MFQL(Molecular Fragmentation Query Language) 쿼리를 컴파일합니다. 지질 분석 플랫폼에 설정된 MFQL은 그림 3C 를 참조하십시오.
    3. 유사한 접근 방식을 사용하여 지질 분석 플랫폼 소프트웨어에서 다른 글리세로인지질에 대한 MFQL을 컴파일합니다. 각 쿼리는 하나의 지질 클래스를 대상으로 하며 단일 실행에서 많은 쿼리를 사용할 수 있습니다.
    4. 실행 버튼을 클릭하여 모든 MFQL을 실행합니다. 식별된 모든 지질 종은 후속 지질 정량화를 위해 해당 전구체 및/또는 단편 이온의 풍부.csv 함께 파일 형식의 단일 결과 파일에 보고됩니다. 출력의 예는 표 3에 나와 있습니다.

7. 유도체화된 샘플의 액체 크로마토그래피 및 탠덤 MS

  1. 5.4단계에서 얻은 샘플을 초고성능 액체 크로마토그래피 시스템을 사용하여 액체 크로마토그래피로 분리합니다. 이 시스템을 선택하는 동안 해당 소프트웨어가 분석에 사용되는 질량 분석기의 소프트웨어와 통합될 수 있는지 확인하십시오.
  2. 시스템을 삼중 사중극자 질량 분석기에 연결합니다. 분리 열을 선택합니다. PI4P 및 PI(4,5)P2 이외의 지질을 분리하려면 C18 컬럼(1.0mm x 100mm x 1.7mm)을 선택합니다. PI4P 및 PI(4,5)P2의 경우 치수가 300Å(1.0mm x100mm x 1.7μm)인 C4 열을 선택합니다.
  3. 먼저 질량 분석기 등급의 물에 포름산암모늄을 용해시킨 다음 유기 용매에 용해시켜 포름산암모늄을 포함하는 이동상을 준비합니다. 질량 분석법에 사용되는 모든 용매를 20분 동안 초음파 처리하여 기포를 제거합니다.
  4. 물 + 0.1% 포름산을 포함하는 용액 A와 아세토니트릴 + 0.1% 포름산을 포함하는 용액 B를 주입하여 컬럼을 평형화합니다.
  5. 분석을 위해 액체 크로마토그래피 시스템의 용리액(주입 부피 1-20μL 범위)을 질량분석기에 주입합니다. 유속을 0.1mL/분으로 설정하고 컬럼의 온도를 실온으로 설정합니다. 컬럼에서 나오는 전체 용리 부피를 질량분석기에 주입합니다.
  6. 시료 주입 순서에서는 항상 빈 용매 주입(메탄올)으로 시작하고 질량 분석 실행 품질 관리 검사(6번째 실행마다)를 위해 생물학적 시료 사이에 간헐적으로 깔끔한 표준 시료를 유지하십시오.
  7. 하이브리드 삼중 사중극자 이온 트랩 질량 분석기 실험 설정의 경우 실험을 시작하기 전에 제조업체의 지침에 따라 질량 분석기를 보정합니다. PA, PC 및 PI의 경우 ESI(Electrospray Ionization)를 사용하여 이온을 생성하고 포지티브 모드에서 작동하여 양전하를 띤 지질 종을 검출합니다. 시스템과 함께 설치된 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 수집하고 분석합니다.
  8. 사용된 해당 내부 표준에 따라 분석을 위해 매개변수를 최적화합니다. 질량 분석기 매개 변수는 다음과 같습니다 : 체류 시간 = 30ms; CAD (충돌 활성화 해리) = 3psi; GS1 (소스 가스 1) = 24psi 및 GS2 (소스 가스 2) = 21psi; CUR (커튼 가스) = 30psi; IS(ESI 전압) = 4.5kV; 및 TEM(소스 온도) = 450°C.
  9. PI4P 및 PI(4,5)P2의 경우 포지티브 모드에서 질량 분석기를 사용합니다. 질량 분석기 매개 변수는 다음과 같습니다 : 체류 시간 = 65ms; CAD (충돌 활성화 해리) = 2psi; GS1 (소스 가스 1) 및 GS2 (소스 가스 2) = 20psi; CUR(커튼 가스) = 37psi; IS(ESI 전압) = 5.2kV; 및 TEM(소스 온도) = 350°C.

8. 순상 액체 크로마토 그래피 - 다중 반응 모니터링 - 향상된 제품 이온 스캔 MS (NPLC-MRM-EPI MS)

  1. 크로마토그래피 조건
    1. PA를 다른 인지질에서 분리할 수 있는 실리카 컬럼을 사용하는 순상 LC 방법을 사용합니다. 68:30:2 비율의 헥산:이소프로필 알코올:100mM 수성 NH4COOH를 이동상 A로 사용하고 이소프로필 알코올:헥산:100mM 수성 NH4COOH를 70:20:10 비율로 이동상 B로 사용합니다.
      참고 :이 조합은 PA의 다른 분자 종에 대해 최상의 분리와 피크 선택성을 제공했습니다.
    2. reference compounds(내부 표준물질)의 크로마토그래피 거동을 분리능 및 피크 모양 측면에서 사용하여 최적의 조건을 선택합니다.
    3. 초고성능 액체 크로마토그래피 컬럼에서 실온의 순상 실리카 컬럼(1mm x 150mm x 3μm)에 대해 크로마토그래피 분리를 수행합니다. 자동시료주입기 주입량을 6μL로 설정하고 용리액 유속을 210μL/min으로 설정합니다.
    4. 이동상 A의 100%와 5분 평형 유지 후 이동상 B를 5분 동안 30%로, 5분 동안 80%로, 5분 동안 100%로 선형으로 증가시키고 5분 동안 100%로 일정하게 유지합니다. 마지막으로 9분 동안 열을 다시 평형을 이룹니다.
  2. 질량 분석기
    1. negative ESI 모드에서 작동하는 하이브리드 삼중 사중극자 이온 트랩 질량 분석기를 사용합니다. 제공된 분석 소프트웨어를 사용하여 시스템 작동 및 데이터 수집을 제어합니다. 실험을 시작하기 전에 제조업체의 지침에 따라 질량 분석기를 보정하십시오.
    2. 내부 표준물질 혼합물의 유동 주입 해석을 사용하여 소스 매개변수를 최적화합니다. 따라서 이온 스프레이 전압 = -4.5kV, 소스 온도(TEM) = 450°C, 충돌 활성화 해리 가스(CAD) = 3psi를 설정합니다. 질소 가스를 충돌 가스로 사용하고 분무기 가스(GS1) = 24psi, 보조 가스(GS2) = 21psi, 커튼 가스(CUR) = 30psi로 설정합니다.
    3. 화합물 종속 이온 경로 파라미터를 디클러스터링 전위(DP) = -42V, 진입 전위(EP) = -6V, 충돌 셀 출구 전위(CXP) = -12V로 설정하고 내부 표준물질 혼합물 용액의 연속 주입을 사용하여 최적화합니다. 질량분석기에서 사용할 수 있는 EPI 스캐닝 기능을 사용하여 단편화 분석을 위해 12eV에서 40eV까지 다양한 충돌 에너지(CE)로 제품 MRM 전이의 전구체와 함께 전체 제품 스펙트럼을 기록합니다.
      참고: MRM 트리거 IDA 기반 EPI는 전구체 이온 생성물, 이온 스캐닝 및 즉석 MS/MS 획득을 동시에 기록합니다. MRM은 사중극자 1(Q1)의 이온 스캔 범위를 좁혔고 이온 트랩은 Q2를 통과하는 이온 단편을 향상시켜 특히 전구체 이온에서 발생하는 모든 단편을 포착하는 데 있어 사중극자 MS/MS의 정성적 능력을 크게 향상시켰습니다. EPI 모드에서는 전구체 이온에서 발생하는 여러 단편 이온이 Q3에서 더 나은 신호 대 잡음비로 검출됩니다.
    4. 고감도를 얻기 위해 39eV의 CE로 MRM 실험을 수행합니다. 최대 MRM 수를 75로 제한하고 체류 시간을 30ms로 제한하여 실행 중 언제든지 크로마토그래피 컬럼에서 용리되는 특정 분자의 MRM을 검출하고 기록합니다. 이것은 기계의 듀티 사이클을 증가시킵니다.
    5. 위에서 설명한 대로 PA에 가장 적합한 이온화 파라미터를 결정하기 위해 실험적 튜닝을 수행합니다. 이 실험에서는 이온 스프레이 전압 = -4.5kV, 소스 온도(TEM) = 450°C, 충돌 활성화 해리 가스(CAD) = 3psi를 설정합니다. 충돌 가스로 질소 가스를 사용하십시오. 분무기 가스(GS1) = 24psi, 보조 가스(GS2) = 21psi, 커튼 가스(CUR) = 30psi로 설정합니다.
    6. 모든 튜닝 데이터를 수동으로 검사하여 이온화 파라미터와 생성물 이온의 적절한 선택을 확인합니다. 제품 이온을 선택할 때 MRM 채널 간의 잠재적 간섭을 최소화하는 것을 고려하십시오. 모든 PA 분자 종의 분석에 사용되는 실험 매개변수는 표 4에 나와 있습니다.
      참고: 하이브리드 삼중 사중극자 선형 이온 트랩 질량 분석기를 사용하면 MRM 스캔 모드와 이온 트랩 스캔 기능을 결합할 수 있으므로 검출된 각 전구체의 유용한 탠덤 질량 스펙트럼을 기록하기 위해 EPI 스캔과 같은 방법을 활용하여 빠르고 높은 스캔을 가능하게 합니다. 이 연구에서는 PA의 고유한 분자 종을 식별하기 위해 분석 소프트웨어로 제어되는 이온 트랩의 EPI 스캐닝 속성을 가진 기존의 삼중 사중극자 이온 경로를 기반으로 하는 이 MRM-EPI 기반 MS/MS 접근 방식을 활용했습니다.

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결과

MS에서 측정의 선형성 결정. 선형성은 지질 분석물의 농도에 정비례하는 결과를 제공하는 MS 분석법의 능력입니다. 선형성은 (a) 지질 분석물의 이온화 효율과 (b) 사용된 이온 소스에 따라 다른 농도에서 지질 분석물의 이온화 거동에 따라 달라집니다. 이 연구에 사용된 전기 분무 이온화(ESI)에서 선형성은 (a) ESI 소스에서 질량 분석기로의 이온 수송 및 (b) 질량 분석기 설계 및 검출기 신호의 선형성에 따라 더 낮은 농도로 유지됩니다. 분석 중인 분자에 대한 내부 표준물질을 사용한 선형성 측정은 각 실험에 대해 추정해야 합니다. 예시 데이터 세트로, 그림 4 는 두 자릿수에 걸친 농도 범위에서 DIMS 실험에 대한 PA(12:0/13:0) 표준의 선형성 반응을 보여줍니다.

DIMS 접근 방식. 그림 5 는...

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토론

초파리 광수용체(Drosophila photoreceptor)의 조직과 기능을 조절하는 신호 지질의 여러 역할에 대한 많은 증거가 수렴됩니다. 광전달을 조절하는 데 있어 잘 연구된 지질의 역할외에도 3, 신호 지질은 단백질 수송 및 세포 내 조직에도 연루되어 있습니다 23,30,39,40,41. 이러한 연구는 초파리 모델 시스템에서 광수용체 기능의 생리학적42 및 유전자 분석43 을 위한 잘 개발된 방법에 의해 가능해졌습니...

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공개 사항

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감사의 글

이 원고에 기술된 작업은 인도 정부 원자력부(Project Identification No. RTI 4006), 인도 정부 생명공학부(BT/PR4833/MED/30/744/2012) 및 인도 동맹 시니어 펠로우십(IA/S/14/2/501540)을 PR에 지원합니다. NCBS 질량분석기 시설, 특히 이러한 분석법 개발에 기여한 Dhananjay Shinde 박사와 PR 연구소 구성원에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.1 N 메탄올 HCL총 지질 분리용
0.88% KClSigma AldrichP9541총 지질 분리용
1.5 ml / 2ml LoBind Eppendorf 튜브Eppendorf,022431081/022431102총 지질 분리용
2.3.18 16:0/18:1 Diether PEAvanti 극성 지질999974지질 내부 표준물질
37% 순수 HClSigma Aldrich320331총 지질 분리용
96웰 플레이트총 유기 인산염 분석
AcetoneFisher Scientific32005해부용
몰리브덴산염총 유기 인산염 분석
아스코르브산총 유기 인산염 분석
Bath 초음파 발생기
BEH300 C18 기둥[1.0mm x 100mm x 1.7mm]Waters India Pvt. Ltd.186002352LC
블레이드 홀더Fine Scientific Tools10052-11해부용
BOD 인큐베이터Total Organic Phosphate assay
Breakable bladesFine Scientific Tools10050-00해부용
버터 종이GE 헬스케어10347671해부용
C4, 300 A0, [1.7 &뮤; m x1 mm x 100 mm] 칼럼Waters India Pvt. Ltd.186004623LC
크로마토그래피 호박색 유리 바이알(인서트 포함)Merck27083-U
d18:1/17:0)Avanti 극성 지질860517지질 내부 표준물
d5-Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate [PI(3,5)P2]-16:0/16:0Avanti 극성 지질850172지질 내부 표준물질
해부 현미경올림푸스SZ51해부용
건열 수조.
용리액 A헥산 : 이소 프로필 알코올 : 100 mM 암모늄 아세테이트 (68:30 : 2), LC
용리액 B헥산 : 이소 프로필 알코올 : 100 mM 암모늄 아세테이트 (70 : 20 : 10), LC
여과지Indica-HM274039해부
용 플라스크Borosil해부
용 파리NANARaghu Padinjat lab
Fly foodNANANCBS 랩 키친, 구성: 옥수수 가루 80g/L, D-포도당 20g/L, 자당 40g/L, 한천 8g/L, 효모 추출물 15g/L, 프로피온산 4mL, TEGO(메틸 파라 하이드록시벤조에이트) 0.7g/L, 오르토인산 0.6mL)
집게Fine Scientific Tools11254-20해부용
흄 후드
깔때기Borosil부용
Fisher ScientificA35-500유도체화용
유리병: 투명 및 호박색총 지질 분리용
고온 내성 인산염이 없는 유리관.총 유기 인산염 분석
지르코늄 산화물 비드총 지질 분리
용 균질화 기기Precellys
가습 CO2< / sub> 플라이 패드플라이 밀기 용
조명 제어 인큐베이터Panasonic SanyoMIR-553플라이 용 사육
초기 유기 혼합물메탄올:클로로포름(2:1), 총 지질 분리용
LC-MS 등급 클로로포름시그마 알드리치650498총 지질 분리용
LC-MS 등급 메탄올시그마 알드리치34860총 지질 분리용
LC-MS 등급 물시그마 알드리치34877총 지질 분리용
빛 meterHTC instrumentLX-103
Low retention tipsEppendorf0030072006/72014/72022/72030총 지질 분리용
LTQ Orbitrap XL 기기Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany
Lysophosphatidic acid (LPA)- 13:0Avanti polar lipidsLM-1700Lipid Internal Standard
Lysophosphatidic acid (LPA)- 17:1Avanti 극성 지질LM 1701지질 내부 표준
리소포스파티딜콜린(LPC) -13:0Avanti 극성 지질LM-1600지질 내부 표준
리소포스파티딜콜린(LPC) -17:1Avanti 극성 지질855677지질 내부 표준
리소포스파티딜콜린(LPC)- 19:0Avanti 극성 지질855776지질 내부 표준
과염소산.총 유기 인산염 분석
인산염 표준 칼륨 디하이드로겐 인산총 유기 인산염 분석
인산염 완충 식염수 (PBS)NANA 구성: 137mMNaCl, 2.7mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 및 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4
인산(PA)- 12:0/13:0Avanti 극성 지질, LM-1400  지질 내부 표준
포스파티드산(PA)- 17:0/14:1Avanti 극성 지질LM-1404지질 내부 표준
포스파티드산(PA)-(17:0/17:0)Avanti 극성 지질830856지질 내부 표준
포스파티드산(PA)-16:0-D31/18:1Avanti 극성 지질860453지질 내부 표준
포스파티딜콜린(PC) -12:0/13:0Avanti 극성 지질LM-1000지질 내부 표준
포스파티딜콜린(PC)- 17:0/14:1Avanti 극성 지질LM-1004지질 내부 표준물
포스파티딜에탄올아민(PE) - 17:0/14:1Avanti 극성 지질LM-110지질 내부 표준
포스파티딜이노시톨(PI) - 17:0/14:1Avanti 극성 지질LM-1504지질 내부 표준물
포스파티딜이노시톨 4,5-비스포스페이트 [PI(4,5)P2)]-17:0/20:4Avanti polar lipidsLM-1904Lipid Internal Standard
Phosphatidylinositol 4-phosphate (PI4P) - 17:0/20:4Avanti polar lipidsLM-1901Lipid Internal Standard
Robotic nanoflow ion sourceTriVersa NanoMate (Advion BioSciences, Ithaca, NY, USA)
Rotospin 기기Tarsons3090X
실리콘 패드해부용
용제 A0.1% 포름산(물), LC
용제 B0.1% 포름산(아세토니트릴), LC
탁상용 원심분리기
TMS
-디아조메탄AcrosAC385330050유도체화를 위해
3중 사중극자 질량 분석기AB SciexQTRAP 6500
UPLC 시스템Waters Acquity
진공 원심 농축기Scanvac, Labogene
Vortex 기계
빙초산 해가있는 균질화 튜브 에 연결 물 물 물 물염 물 물 , 용

참고문헌

  1. Hardie, R. C. C., Raghu, P. Visual transduction in Drosophila. Nature. 413 (6852), 186-193 (2001).
  2. Raghu, P., Yadav, S., Mallampati, N. B. N. Lipid signaling in Drosophila photoreceptors. Biochimica et Biophysica Acta. 1821 (8), 1154-1165 (2012).
  3. Hardie, R. C. TRP channels and lipids: from Drosophila to mammalian physiology. The Journal of Physiology. 578 (1), 9-24 (2007).
  4. Fuchs, B., Süss, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. Lipid analysis by thin-layer chromatography--a review of the current state. Journal of Chromatography. A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).
  5. Tang, B., Row, K. Development of gas chromatography analysis of fatty acids in marine organisms. Journal of Chromatographic Science. 51 (7), 599-607 (2013).
  6. Kinsey, C., et al. Determination of lipid content and stability in lipid nanoparticles using ultra high-performance liquid chromatography in combination with a Corona Charged Aerosol Detector. Electrophoresis. , (2021).
  7. Gandhi, A. S., Budac, D., Khayrullina, T., Staal, R., Chandrasena, G. Quantitative analysis of lipids: a higher-throughput LC-MS/MS-based method and its comparison to ELISA. Future Science OA. 3 (1), 157(2017).
  8. Ouldamer, L., et al. NMR-based lipidomic approach to evaluate controlled dietary intake of lipids in adipose tissue of a rat mammary tumor model. Journal of Proteome Research. 15 (3), 868-878 (2016).
  9. Li, L., et al. Mass spectrometry methodology in lipid analysis. International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 10492-10507 (2014).
  10. Welti, R., Wang, X. Lipid species profiling: a high-throughput approach to identify lipid compositional changes and determine the function of genes involved in lipid metabolism and signaling. Current Opinion in Plant Biology. 7 (3), 337-344 (2004).
  11. Köfeler, H. C., Fauland, A., Rechberger, G. N., Trötzmüller, M. Mass spectrometry based lipidomics: an overview of technological platforms. Metabolites. 2 (1), 19-38 (2012).
  12. Schwudke, D., Liebisch, G., Herzog, R., Schmitz, F., Shevchenko, A. Shotgun lipidomics by tandem mass spectrometry under data-dependent acquisition control. Methods in Enzymology. 433, 175-191 (2007).
  13. Ejsing, C., et al. Automated identification and quantification of glycerophospholipid molecular species by multiple precursor ion scanning. Analytical Chemistry. 78 (17), 6202-6214 (2006).
  14. Schwudke, D., et al. Top-down lipidomic screens by multivariate analysis of high-resolution survey mass spectra. Analytical Chemistry. 79 (11), 4083-4093 (2007).
  15. Carvalho, M., et al. Effects of diet and development on the Drosophila lipidome. Molecular Systems Biology. 8, 600(2012).
  16. Han, X., Gross, R. W. Global analyses of cellular lipidomes directly from crude extracts of biological samples by ESI mass spectrometry a bridge to lipidomics. Journal of Lipid Research. 44 (6), 1071-1079 (2003).
  17. Schwudke, D., et al. Lipid profiling by multiple precursor and neutral loss scanning driven by the data-dependent acquisition. Analytical Chemistry. 78 (2), 585-595 (2006).
  18. Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
  19. Fauland, A., et al. A comprehensive method for lipid profiling by liquid chromatography-ion cyclotron resonance mass spectrometry. The Journal of Lipid Research. 52 (12), 2314-2322 (2011).
  20. Schuhmann, K., et al. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
  21. Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical Biochemist. Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
  22. Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. Advances in mass spectrometry for lipidomics. Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), Palo Alto, Calif. 433-465 (2010).
  23. Thakur, R., et al. Phospholipase D activity couples plasma membrane endocytosis with retromer dependent recycling. eLife. 5, 18515(2016).
  24. Donaldson, K. The inhalation toxicology of p-aramid fibrils. Critical Reviews in Toxicology. 39 (6), 487-500 (2009).
  25. Panda, A., et al. Functional analysis of mammalian phospholipase D enzymes. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
  26. Ghosh, A., Sharma, S., Shinde, D., Ramya, V., Raghu, P. A novel mass assay to measure phosphatidylinositol-5-phosphate from cells and tissues. Bioscience Reports. 39 (10), (2019).
  27. Balakrishnan, S. S., et al. Regulation of PI4P levels by PI4KIIIα during G-protein-coupled PLC signaling in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 131 (15), (2018).
  28. Masood, M. A., Yuan, C., Acharya, J. K., Veenstra, T. D., Blonder, J. Quantitation of ceramide phosphorylethanolamines containing saturated and unsaturated sphingoid base cores. Analytical Biochemistry. 400 (2), 259-269 (2010).
  29. Acharya, U., et al. Modulating sphingolipid biosynthetic pathway rescues photoreceptor degeneration. Science. 299 (5613), New York, N.Y. 1740-1743 (2003).
  30. Hebbar, S., Schuhmann, K., Shevchenko, A., Knust, E. Hydroxylated sphingolipid biosynthesis regulates photoreceptor apical domain morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 219 (12), (2020).
  31. Abhyankar, V., Kaduskar, B., Kamat, S. S., Deobagkar, D., Ratnaparkhi, G. S. Drosophila DNA/RNA methyltransferase contributes to robust host defense in aging animals by regulating sphingolipid metabolism. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 22 (2018).
  32. Subramanian, M., et al. Altered lipid homeostasis in Drosophila InsP3 receptor mutants leads to obesity and hyperphagia). DMM Disease Models and Mechanisms. 6 (3), 734-744 (2013).
  33. Guan, X. L., et al. Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development. Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).
  34. Caravaca, J. M., Lei, E. P. Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53756(2016).
  35. Fujita, S. C., Inoue, H., Yoshioka, T., Hotta, Y. Quantitative tissue isolation from Drosophila freeze-dried in acetone. TheBiochemical Journal. 243 (1), 97-104 (1987).
  36. Herzog, R., et al. LipidXplorer: a software for consensual cross-platform lipidomics. PloS One. 7 (1), 29851(2012).
  37. Itoh, Y. H., Itoh, T., Kaneko, H. Modified Bartlett assay for microscale lipid phosphorus analysis. Analytical Biochemistry. 154 (1), 200-204 (1986).
  38. Hsu, F. F., Turk, J. Charge-driven fragmentation processes in diacyl glycerophosphatidic acids upon low-energy collisional activation. A mechanistic proposal. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 11 (9), 797-803 (2000).
  39. Acharya, J. K., et al. Cell-nonautonomous function of ceramidase in photoreceptor homeostasis. Neuron. 57 (1), 69-79 (2008).
  40. Dasgupta, U., et al. Ceramide kinase regulates phospholipase C and phosphatidylinositol 4, 5, bisphosphate in phototransduction. Proceeding of the National Academy of Science of the United States of America. 106 (47), 20063-20068 (2009).
  41. Yonamine, I., et al. Sphingosine kinases and their metabolites modulate endolysosomal trafficking in photoreceptors. The Journal of Cell Biology. 192 (4), 557-567 (2011).
  42. Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R., Minke, B. Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55627(2017).
  43. Pak, W. L. Drosophila in vision research. The Friedenwald Lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (12), 2340-2357 (1995).
  44. Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).
  45. Garcia-Murillas, I., et al. lazaro encodes a lipid phosphate phosphohydrolase that regulates phosphatidylinositol turnover during Drosophila phototransduction. Neuron. 49 (4), 533-546 (2006).
  46. Raghu, P., et al. Rhabdomere biogenesis in Drosophila photoreceptors is acutely sensitive to phosphatidic acid levels. TheJournal of Cell Biology. 185 (1), 129-145 (2009).
  47. Ogiso, H., Suzuki, T., Taguchi, R. Development of a reverse-phase liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometry method for lipidomics, improving detection of phosphatidic acid and phosphatidylserine. Analytical Biochemistry. 375 (1), 124-131 (2008).
  48. Raghupathy, R., et al. Transbilayer lipid interactions mediate nanoclustering of lipid-anchored proteins. Cell. 161 (3), 581-594 (2015).
  49. Randall, A. S., et al. Speed and sensitivity of phototransduction in Drosophila depend on degree of saturation of membrane phospholipids. The Journal of Neuroscience. 35 (6), 2731-2746 (2015).
  50. Schuhmacher, M., et al. Live-cell lipid biochemistry reveals a role of diacylglycerol side-chain composition for cellular lipid dynamics and protein affinities. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (14), 7729-7738 (2020).
  51. Raghu, P. Functional diversity in a lipidome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11191-11193 (2020).
  52. Khandelwal, N., et al. Fatty acid chain length drives lysophosphatidylserine-dependent immunological outputs. Cell Chemical Biology. 28 (8), 1169-1179 (2021).
  53. Piper, M. D. W., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nature Methods. 11 (1), 100-105 (2014).
  54. Wang, F., et al. FlyVar: a database for genetic variation in Drosophila melanogaster. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2015, (2015).
  55. Hammond, G. R. V., Balla, T. Polyphosphoinositide binding domains: Key to inositol lipid biology. Biochimica et Biophysica Acta. 1851 (6), 746-758 (2015).
  56. Chakrabarti, P., et al. A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors. PLoS Genetics. 11 (1), 1004948(2015).
  57. Hardie, R. C., Liu, C. -H., Randall, A. S., Sengupta, S. In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).
  58. Yadav, S., Garner, K., Georgiev, P., Li, M., Gomez-espinosa, E. RDGB, a PI-PA transfer protein regulates G-protein coupled PtdIns (4, 5)P2 signalling during Drosophila phototransduction. Journal of Cell Science. 128 (17), 3330-3344 (2015).
  59. Unsihuay, D., Mesa Sanchez, D., Laskin, L. Quantitative Mass Spectrometry Imaging of Biological Systems. Annual Review of Physical Chemistry. 72, 307-329 (2021).

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