이 프로토콜은 이축 기계적 특성화, 편광 공간 주파수 영역 이미징 기반 콜라겐 정량화 및 트리쿠스피드 밸브 전단지의 미세 해부를 설명합니다. 제공된 방법은 전단지 레이어가 전체 론적 전단지 동작에 어떻게 기여하는지 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
트리쿠스피드 밸브 (TV)는 우심방에서 우심실로 산소가 공급되지 않은 혈액의 단방향 흐름을 조절합니다. TV는 세 개의 전단지로 구성되어 있으며 각 전단지는 독특한 기계적 동작을 가지고 있습니다. 세 개의 TV 전단지 사이의 이러한 변형은 심방 (A), 해면첩 (S), 섬유사 (F) 및 심실 (V) 인 네 개의 해부학 적 층을 조사함으로써 더 잘 이해할 수 있습니다. 이 층들은 세 개의 TV 전단지에 모두 존재하지만, 각각의 기계적 거동에 더 많은 영향을 미치는 두께와 미세 구조 구성 요소에는 차이가 있습니다.
이 프로토콜에는 층별 차이점을 설명하는 네 가지 단계가 포함되어 있습니다 : (i) 손상되지 않은 TV 전단지의 기계적 및 콜라겐 섬유 건축 거동을 특성화하고, (ii) TV 전단지의 복합 층 (A / S 및 F / V)을 분리하고, (iii) 복합 레이어에 대해 동일한 특성화를 수행하고, (iv) 사후 촬영을 수행합니다. 조직학 평가. 이 실험 프레임 워크는 고유하게 손상되지 않은 TV 조직을 각각의 복합 층과 직접 비교할 수있게합니다. 결과적으로, TV 전단지의 미세 구조 및 생체 역학 기능에 관한 자세한 정보는이 프로토콜을 통해 수집 될 수 있습니다. 이러한 정보는 잠재적으로 TV 질환의 임상 치료를 위한 지침을 제공하고자 하는 TV 계산 모델을 개발하는 데 사용될 수 있다.
서론
TV는 심장의 우심방과 우심실 사이에 있습니다. 심장 주기 전반에 걸쳐 TV는 TV 전단지 (TVAL), TV 후부 전단지 (TVPL) 및 TV 중격 전단지 (TVSL)의 순환 개폐를 통해 단방향 혈류를 조절합니다. 이 전단지는 복잡하며 심방 (A), 해면질 (S), 섬유사 (F) 및 심실 (V)의 네 가지 해부학 적 층을 가지고 있으며 독특한 미세 구조 구성 요소가 있습니다. 심방과 심실의 엘라스틴 섬유는 기계적 하중 후 변형되지 않은 기하학으로 조직을 복원하는 데 도움이됩니다1. 대조적으로, 섬유사는 전단지2의 하중 지지 능력에 기여하는 물결 모양의 콜라겐 섬유의 조밀 한 네트워크를 함유한다. 주로 글리코사미노글리칸으로 구성된 스폰지오사는 심장 판막 기능3 동안 전단지층 사이의 전단을 가능하게 하는 가설을 세웠다. 세 가지 전단지 유형 모두 해부학 적 층이 동일하지만 층의 두께와 구성 비율에 차이가 있으며 전단지 별 기계적 행동에 영향을 미칩니다.
연구자들은 평면 기계적 특성화, 조직 형태 학적 평가 및 콜라겐 섬유 아키텍처의 광학 특성화를 사용하여 TV 전단지의 특성을 탐구했습니다. 예를 들어, 평면 이축 기계....
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프로토콜
여기에 설명 된 모든 방법은 오클라호마 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 동물 조직은 USDA가 승인 한 도살장에서 획득했습니다.
1. 이축 기계적 특성화
- 조직 준비
- 냉동실, 면도날, 수술 펜, 포셉, 탈 이온화 (DI) 물이 든 피펫 및 절단 매트에서 TV 전단지를 검색하십시오. 실온 DI 물 2-3 방울을 사용하여 TV 전단지를 해동하십시오.
참고: DI 물은 층 미세 해부를위한 PBS 유도 어려움을 피하기 위해 인산염 완충 식염수 (PBS) 대신 사용됩니다. - 시편을 심실 층 (즉, 화음 삽입이있는 표면)이 위쪽을 향하게하여 절단 매트 위에 평평하게 놓습니다. 반경 방향이 Y 방향과 정렬되고 원주 방향이 X 방향과 정렬되도록 시편을 배치합니다.
참고: 원주 방향은 밸브의 둘레를 따라 배향됩니다. - 조직의 화음 삽입 위치를 검사하십시오. 매우 얇은(즉, 투명한) 영역을 피하면서 큰 코드 삽입을 최소화하면서 이상적으로는 ~12mm 크기의 영역을 결정합니다(그림 1).
- 심방 표면(즉, 화음 삽입이 없는 표....
- 냉동실, 면도날, 수술 펜, 포셉, 탈 이온화 (DI) 물이 든 피펫 및 절단 매트에서 TV 전단지를 검색하십시오. 실온 DI 물 2-3 방울을 사용하여 TV 전단지를 해동하십시오.
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결과
미세 해부는 (상용) 이축 테스트 장치에 장착 할 수있는 비교적 균일 한 두께의 A / S 및 F / V 표본을 생산합니다. 무손상 전단지와 두 해부된 층의 조직학 분석은 조직이 해면질과 섬유사 사이의 경계를 따라 정확하게 분리되었는지를 검증할 것이다(도 7). 추가적으로, 조직학 현미경 사진은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 조직층 두께 및 구성 질량 분율을 결정하는데 사용될 수 있다. 실패한 해부는 이축 테스터에 장착하기에는 너무 작은 A/S 샘플을 생성할 때 발생합니다. 이것은 필링 중에 A / S가 찢어지거나 두꺼운 화음으로 인해 F / V 층에 구멍이 생길 때 가장 자주 발생합니다.
변위 제어 기계 테스트 및 후처리는 조직의 비선형 기계적 거동을 설명하는 응력 변형 데이터를 생성합니다(그림 8). 샘플은 일반적으로 이방성이며, 여기서 원주 조직 방향은 반경 조직 .......
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토론
프로토콜에 대한 중요한 단계는 (i) 층 미세 해부, (ii) 조직 장착, (iii) 신탁 마커 배치, 및 (iv) pSFDI 셋업을 포함한다. 적절한 층 미세해부는 본원에 기재된 방법의 가장 중요하고 어려운 측면이다. 이 기술을 활용한 조사를 시작하기 전에, 해체(들)는 미세 해부 기술과 세 개의 TV 전단지를 모두 사용하여 장기적인 연습을 해야 한다. 디스섹터는 복합 층 시편이 충분히 크고 (>3.3mm) 균일 한 두께를 갖도록 보장해야합니다. 조직학은 해부가 일관되게 정확한 층 분리를 가지고 있는지 확인하기 위해 사용되어야합니다.
조직 장착을 위해, 조직은 이축 테스터에 부착되어야만 조직이 인공 스트레칭이나 주름 없이 평평하게 됩니다. 이러한 오류로 인해 기계 데이터가 부정확 해집니다. 복합 층은 더 얇은 특성으로 인해 이러한 오류가 발생하기 쉽습니다. 신탁 마커를 부착 할 때, 마커가 조직의 중앙 삼분의 일 영역 내에 배치되고 서로 부착되지 않는 것이 가장 중요합니다. 부.......
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 미국 심장 협회 과학자 개발 보조금 (16SDG27760143)과 장로교 건강 재단의 지원을 받았다. KMC는 오클라호마 대학 (OU) 학부 연구 기회 프로그램 및 명예 연구 견습 프로그램에 의해 부분적으로 지원되었습니다. DWL은 National Science Foundation Graduate Research Fellowship (GRF 2019254233)과 American Heart Association/Children's Heart Foundation Predoctoral Fellowship (Award #821298)의 지원을 받았습니다. 이 모든 지원은 감사하게 인정됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 10% 포르말린 용액, 중성 완충 | 시그마-알드리치 | HT501128-4L | |
| 알코녹스 세제 | 알코녹 | 세정 화합물 | |
| BioTester - 이축 테스터 | CellScale 생체 재료 테스트 | 1.5 N 로드셀 용량 | |
| 절단 매트 | Dahle | B0027RS8DU | |
| 탈이온수 | N/A | ||
| 세밀한 팁 도구 | HTI INSTRUMENTS | NSPLS-12 | |
| 집게 - 곡선형 | 과학 실험실 | 16122 | |
| 집게 - 두꺼운 | 과학 실험실 | 161001078 | |
| 집게 - 얇은 | 과학 실험실 | 16127 | |
| LabJoy | CellScale 생체 재료 테스트 | 버전 10.66 | |
| 레이저 변위 Sensor | Keyence | IL-030 | |
| Liquid Cyanoacrylate Glue | Loctite | 2436365 | |
| MATLAB | MathWorks | 버전 2020a | |
| 마이크로 가위 | HTI Instruments | CAS55C | |
| Pipette | Belmaks | 360758081051Y4 | |
| Polarized Spatial Frequency Domain Imaging Device | N/A | 디지털 광 프로젝터, 선형 편광판, 회전식 편광 마운트 및 전하 결합 장치 카메라를 사용하여 사내에서 제작됩니다. 자세한 내용은 doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028(PMCID: PMC8101699)를 참조하십시오. | |
| 메스 | THINKPRICE | TP-SCALPEL-3010 | |
| 싱글 엣지 산업용 면도날(수술용 탄소강) | VWR International | H3515541105024 | |
| 수술용 펜 | LabAider | LAB-Skin-6 | |
| T-Pins | 비즈니스 소스 | BSN32351 | |
| 왁스 보드 | N/A | 모델링 왁스 및 베이킹 트레이를 사용하여 자체 제작 | |
| 무게 보트 | 퓨어 폰타 | mdo-azoc-1030 |
참고문헌
- Vesely, I. The role of elastin in aortic valve mechanics. Journal of Biomechanics. 31 (2), 115-123 (1998).
- Zhang, W., Ayoub, S., Liao, J., Sacks, M. S. A meso-scale layer-specific structural constitutive model of the mitral heart valve leaflets. Acta Biom....
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재인쇄 및 허가
