제2형 염증과 관련된 그룹 2 선천성 림프 세포(ILC2s)는 주로 기생충 감염, 알레르기 질환, 대사 항상성 및 조직 복구에 대한 반응에 참여합니다. 이 연구에서는 쥐의 코 점막에서 ILC2를 분리하고 CD226의 발현을 감지하는 절차를 입증합니다.
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방법 논문
CD226의 발현을 검출하기 위해 마우스 비강 점막에서 그룹 2 선천성 림프 세포 분리
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
수년에 걸쳐 발표된 그룹 2 선천성 림프 세포(ILC2)에 대한 풍부한 연구를 통해 ILC2는 항기생충 면역, 조직 복구, 열 발생 및 천식 및 알레르기 비염(AR)과 같은 자가면역 질환을 포함한 다양한 병리학적 과정을 조절하는 데 연루된 것으로 널리 알려져 있습니다. ILC2는 피부, 장, 폐 및 비강과 같은 말초 조직에 영구적으로 존재합니다. 그러나 비강 점막 면역의 정확한 기능에 대한 정보는 제한적입니다. CD226은 주로 자연 살해(NK) 세포, T 세포 및 염증성 단핵구에서 발현되는 활성화 공동자극 분자입니다. 그러나 ILC2가 CD226을 발현하는지 또는 ILC2s 관련 질병의 발병기전에서 역할을 하는지 여부는 아직 알려지지 않았습니다. 여기에서 우리는 비강 점막에서 ILC2를 분리 및 식별하는 방법을 확립하고 건강한 AR 마우스에서 얻은 ILC2에서 CD226 발현을 검출했습니다. 여기에서 우리는 비강 점막 질환에서 면역 장애의 내부 병리학적 메커니즘을 탐색하는 데 도움이 될 마우스 비강 점막에서 ILC2s의 분리 및 식별을 위한 이 프로토콜을 설명합니다.
서론
그룹 2 선천성 림프 세포(ILC2s)는 생쥐의 복강 조직에서 처음 발견되었고, 이후 혈액 및 폐, 피부 및 비강과 같은 다른 말초 조직에 존재하는 것으로 입증되었다 1,2,3. 조직 상주 세포로서 ILC2는 주로 국소적으로 유지 및 증식되며 수많은 제2형 사이토카인을 생성하고 제2형 면역을 유도하여 외인성 유해 자극에 반응하는 첫 번째 가드 역할을 합니다 4,5,6. ILC2는 또한 감염된 조직으로 인신매매를 함으로써 그 효과를 발휘할 수 있다 7,8.
T-헬퍼 2(Th2) 세포와 유사하게, ILC2의 복잡한 조절 네트워크는 기도 알레르기 질환을 포함한 다양한 제2형 염증성 질환의 진행에 중요한 관여를 보장합니다 8,9
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프로토콜
모든 실험은 실험동물의 관리 및 사용 가이드라인에 따라 수행하였다. 모든 절차와 프로토콜은 제 4 군 의과 대학 과학 연구 윤리위원회 (No. 20211008)의 승인을 받았습니다.
1. Murine AR 모델 구축
- 특정 병원체가 없는 조건에서 8-12주령의 수컷 및 암컷 야생형(WT) C57BL/6 마우스를 기숙하고 표준 실험실 차우와 물을 제공합니다.
- 무균 상태를 유지하기 위해 깨끗한 벤치에서 2mg의 수산화알루미늄을 함유한 0.2mL의 멸균 PBS에 50μg의 오브알부민(OVA)을 유화합니다. 0일, 7일 및 14일에 암컷 또는 수컷 마우스에 각각 50μg의 유화된 OVA를 복강 주사합니다.
- 21일, 22일, 23일, 24일 및 25일에 흡입 마취(산소 유량 또는 0.5L/min).
- 마지막 챌린지 후 24시간(26일째)에 마우스를 안락사시킵니다.
2. 코 점막에서 단핵 세포 (MNC)의 분리
- 깊은 마취 하에서 자궁 경부 탈구에 의해 마우스를 안락사시킨다. 생쥐 머리를 75 % 에탄올에 5 분 동안 담그고 에탄올이 외부 콧 구멍으로....
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결과
AR에서 ILC2의 역할을 탐색하기 위해 OVA 유도 쥐 모델이 개발되었습니다. AR 쥐 모델의 구성은 약간의 수정 28,29,30,31을 가진 이전 연구를 기반으로 했습니다. 마지막 콧물 챌린지 후 재채기와 코 긁힘의 빈도를 측정하기 위해 10분 분량의 비디오를 캡처했습니다. OVA가 유도된 AR 마우스의 알러지 증상을 도 1에 나타내었다. AR 마우스에서 비강 마찰 및 재채기의 빈도는 대조군보다 유의하게 높았다.
다음으로, 쥐의 코 점막에서 MNC를 분리하고 FCM 분석을 사용하여 특성화를 수행하는 절차를 설명했습니다. 약 2-3 x 106개의 림프구가 각각의 쥐 코로부터 얻어.......
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토론
ILC2는 제2형 염증 및 염증성 질환과 밀접한 관련이 있으며, 이는 점점 더 많은 연구에서 입증되고 있습니다. 마우스 모델과 인간 관찰 모두 상기도에서의 기능을 더 잘 이해하는 데 기여합니다. 천식 병태생리학에서 ILC2는 주로 상피 세포에서 생성되는 흉선 기질 림프포이에틴, IL-25 및 IL-33을 통해 활성화됩니다. 그런 다음 Th2 세포를 미러링하여 ILC2는 IL-4, IL-5 및 IL-13을 생성하여 유형 2 염증을 악화시킵니다32. 또한, ILC2의 상이한 하위세트는 또한 IL-10 및 IL-1733,34,35를 생성한다. AR은 또한 제2형 세포에 의해 유발되는 기도 알레르기 염증의 한 유형입니다. AR 병태생리학에서 ILC2의 참여는 최근14에서 입증되었습니다........
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
R.Z.는 중국 국립 자연 과학 재단 (No. 81871258)과 제 4 군 의과 대학 (No.2020rcfczr)이 제공 한 기금의 지원을 받았습니다. Y.Z.는 산시성 자연과학 기초 연구 프로그램(No. 2021JM-081)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 수산화 알루미늄 | Meilun 생물학적 기술 | 21645-51-2 | |
| CD11b | eBioscience | 11-0112-82 | 항체 coctail |
| CD11c | BioLegend | 117306 | 항체 coctail |
| CD16 / 32 | BioLegend | 101302 | 클론 : 93; 희석 1:100 |
| CD226 | BioLegend | 128812 | 항체 coctail에 사용 |
| CD3e | BioLegend | 100306 | 항체에 사용 |
| CD45 | BioLegend | 103128 | 항체 coctail에 사용 |
| CD45R | eBioscience | 11-0452-82 | 항체에 사용 |
| CD90.2 | BD Pharmingen | 553014 | 항체에 사용 coctail |
| Collagenase IV | DIYIBio | DY40128 | |
| CountBright 절대 계수 구슬 | Invitrogen | C36950 | 절대 계수 구슬 |
Dnase  | Beyotime | D7076 | |
| Fetal Bovine Serum | gibco | 10270-106 | |
| Fixable Viability Dye eFluor 520 (FITC) | eBioscience | 65-0867-14 | FVD |
| HBSS, 칼슘, 마그네슘 | Servicebio | G4204-500 | |
| KLRG1 | eBioscience | 17-5893-81 | 항체 coctail |
| NaN3 | SIGMA | S2002 | |
| NovoExpress 소프트웨어 | AgilentTechnologies | 버전 1.5.0 | 유세포 분석(FCM) 분석 소프트웨어 |
| OVA | SIGMA | 9006-59-1 | |
| PBS, 1x | Servicebio | G4202-500 | |
| PBS, 10x | Servicebio | G4207-500 | |
| Percoll | Yeasen | 40501ES60 | 밀도 구배 매체 |
| RPMI 1640 배양 매체 | Corning | 10-040-CVRV | |
| 스펙트럼 세포 분석기 | SONY | SA3800 |
참고문헌
- Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
- Price, A. E., et al. System....
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재인쇄 및 허가
