Method Article

CD226의 발현을 검출하기 위해 마우스 비강 점막에서 그룹 2 선천성 림프 세포 분리

DOI:

10.3791/63525

⸱

May 10th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Otolaryngological Department of Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, 2Institute of Medical Research, Northwestern Polytechnical University, 3Orthopedic Department of Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, 4Department of Immunology, Fourth Military Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

제2형 염증과 관련된 그룹 2 선천성 림프 세포(ILC2s)는 주로 기생충 감염, 알레르기 질환, 대사 항상성 및 조직 복구에 대한 반응에 참여합니다. 이 연구에서는 쥐의 코 점막에서 ILC2를 분리하고 CD226의 발현을 감지하는 절차를 입증합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

수년에 걸쳐 발표된 그룹 2 선천성 림프 세포(ILC2)에 대한 풍부한 연구를 통해 ILC2는 항기생충 면역, 조직 복구, 열 발생 및 천식 및 알레르기 비염(AR)과 같은 자가면역 질환을 포함한 다양한 병리학적 과정을 조절하는 데 연루된 것으로 널리 알려져 있습니다. ILC2는 피부, 장, 폐 및 비강과 같은 말초 조직에 영구적으로 존재합니다. 그러나 비강 점막 면역의 정확한 기능에 대한 정보는 제한적입니다. CD226은 주로 자연 살해(NK) 세포, T 세포 및 염증성 단핵구에서 발현되는 활성화 공동자극 분자입니다. 그러나 ILC2가 CD226을 발현하는지 또는 ILC2s 관련 질병의 발병기전에서 역할을 하는지 여부는 아직 알려지지 않았습니다. 여기에서 우리는 비강 점막에서 ILC2를 분리 및 식별하는 방법을 확립하고 건강한 AR 마우스에서 얻은 ILC2에서 CD226 발현을 검출했습니다. 여기에서 우리는 비강 점막 질환에서 면역 장애의 내부 병리학적 메커니즘을 탐색하는 데 도움이 될 마우스 비강 점막에서 ILC2s의 분리 및 식별을 위한 이 프로토콜을 설명합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

그룹 2 선천성 림프 세포(ILC2s)는 생쥐의 복강 조직에서 처음 발견되었고, 이후 혈액 및 폐, 피부 및 비강과 같은 다른 말초 조직에 존재하는 것으로 입증되었다 1,2,3. 조직 상주 세포로서 ILC2는 주로 국소적으로 유지 및 증식되며 수많은 제2형 사이토카인을 생성하고 제2형 면역을 유도하여 외인성 유해 자극에 반응하는 첫 번째 가드 역할을 합니다 4,5,6. ILC2는 또한 감염된 조직으로 인신매매를 함으로써 그 효과를 발휘할 수 있다 7,8.

T-헬퍼 2(Th2) 세포와 유사하게, ILC2의 복잡한 조절 네트워크는 기도 알레르기 질환을 포함한 다양한 제2형 염증성 질환의 진행에 중요한 관여를 보장합니다 8,9

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 실험은 실험동물의 관리 및 사용 가이드라인에 따라 수행하였다. 모든 절차와 프로토콜은 제 4 군 의과 대학 과학 연구 윤리위원회 (No. 20211008)의 승인을 받았습니다.

1. Murine AR 모델 구축

  1. 특정 병원체가 없는 조건에서 8-12주령의 수컷 및 암컷 야생형(WT) C57BL/6 마우스를 기숙하고 표준 실험실 차우와 물을 제공합니다.
  2. 무균 상태를 유지하기 위해 깨끗한 벤치에서 2mg의 수산화알루미늄을 함유한 0.2mL의 멸균 PBS에 50μg의 오브알부민(OVA)을 유화합니다. 0일, 7일 및 14일에 암컷 또는 수컷 마우스에 각각 50μg의 유화된 OVA를 복강 주사합니다.
  3. 21일, 22일, 23일, 24일 및 25일에 흡입 마취(산소 유량 또는 0.5L/min).
  4. 마지막 챌린지 후 24시간(26일째)에 마우스를 안락사시킵니다.

2. 코 점막에서 단핵 세포 (MNC)의 분리

  1. 깊은 마취 하에서 자궁 경부 탈구에 의해 마우스를 안락사시킨다. 생쥐 머리를 75 % 에탄올에 5 분 동안 담그고 에탄올이 외부 콧 구멍으로....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AR에서 ILC2의 역할을 탐색하기 위해 OVA 유도 쥐 모델이 개발되었습니다. AR 쥐 모델의 구성은 약간의 수정 28,29,30,31을 가진 이전 연구를 기반으로 했습니다. 마지막 콧물 챌린지 후 재채기와 코 긁힘의 빈도를 측정하기 위해 10분 분량의 비디오를 캡처했습니다. OVA가 유도된 AR 마우스의 알러지 증상을 도 1에 나타내었다. AR 마우스에서 비강 마찰 및 재채기의 빈도는 대조군보다 유의하게 높았다.

다음으로, 쥐의 코 점막에서 MNC를 분리하고 FCM 분석을 사용하여 특성화를 수행하는 절차를 설명했습니다. 약 2-3 x 106개의 림프구가 각각의 쥐 코로부터 얻어.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ILC2는 제2형 염증 및 염증성 질환과 밀접한 관련이 있으며, 이는 점점 더 많은 연구에서 입증되고 있습니다. 마우스 모델과 인간 관찰 모두 상기도에서의 기능을 더 잘 이해하는 데 기여합니다. 천식 병태생리학에서 ILC2는 주로 상피 세포에서 생성되는 흉선 기질 림프포이에틴, IL-25 및 IL-33을 통해 활성화됩니다. 그런 다음 Th2 세포를 미러링하여 ILC2는 IL-4, IL-5 및 IL-13을 생성하여 유형 2 염증을 악화시킵니다32. 또한, ILC2의 상이한 하위세트는 또한 IL-10 및 IL-1733,34,35를 생성한다. AR은 또한 제2형 세포에 의해 유발되는 기도 알레르기 염증의 한 유형입니다. AR 병태생리학에서 ILC2의 참여는 최근14에서 입증되었습니다........

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

R.Z.는 중국 국립 자연 과학 재단 (No. 81871258)과 제 4 군 의과 대학 (No.2020rcfczr)이 제공 한 기금의 지원을 받았습니다. Y.Z.는 산시성 자연과학 기초 연구 프로그램(No. 2021JM-081)의 지원을 받았습니다.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
수산화 알루미늄Meilun 생물학적 기술21645-51-2
CD11beBioscience11-0112-82항체 coctail
CD11cBioLegend117306항체 coctail
CD16 / 32BioLegend101302클론 : 93; 희석 1:100
CD226BioLegend128812항체 coctail에 사용
CD3eBioLegend100306항체에 사용
CD45BioLegend103128항체 coctail에 사용
CD45ReBioscience11-0452-82항체에 사용
CD90.2BD Pharmingen553014항체에 사용 coctail
Collagenase IVDIYIBioDY40128
CountBright 절대 계수 구슬InvitrogenC36950절대 계수 구슬
Dnase figure-materials-1BeyotimeD7076
Fetal Bovine Serumgibco10270-106
Fixable Viability Dye eFluor 520 (FITC)eBioscience65-0867-14FVD
HBSS, 칼슘, 마그네슘ServicebioG4204-500
KLRG1eBioscience17-5893-81항체 coctail
NaN3SIGMAS2002
NovoExpress 소프트웨어AgilentTechnologies버전 1.5.0유세포 분석(FCM) 분석 소프트웨어
OVASIGMA9006-59-1
PBS, 1xServicebioG4202-500
PBS, 10xServicebioG4207-500
PercollYeasen40501ES60밀도 구배 매체
RPMI 1640 배양 매체Corning10-040-CVRV
스펙트럼 세포 분석기SONYSA3800
에 사용 에 사용

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
  2. Price, A. E., et al. System....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Group 2 Innate LymphoidNasal MucosaCD226 ExpressionAllergic RhinitisFlow CytometryCell IsolationDensity GradientSurface Antigen StainingMononuclear CellsMouse Model

Related Articles