Method Article

표적 하에서 초저 입력 절단을 이용한 크로마틴에 대한 단일 세포 인자 국소화 및 뉴클레아제를 이용한 방출

DOI:

10.3791/63536

⸱

February 1st, 2022

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CUT&RUN 및 그 변이체는 크로마틴에 대한 단백질 점유율을 결정하는 데 사용될 수 있다. 이 프로토콜은 단일 세포 uliCUT&RUN을 사용하여 크로마틴에 대한 단백질 국소화를 결정하는 방법을 설명합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

크로마틴에서 단백질의 결합 위치를 결정하는 것은 그 기능과 잠재적 인 조절 표적을 이해하는 데 필수적입니다. 크로마틴 면역침전(ChIP)은 30년 이상 단백질 국재화를 결정하기 위한 황금 표준이었으며, 초음파 처리 또는 효소적으로 소화된 크로마틴으로부터 관심있는 단백질을 꺼내기 위한 항체의 사용에 의해 정의된다. 보다 최근에, 항체 테더링 기술은 그들의 증가된 민감성으로 인해 크로마틴에 대한 단백질 국소화를 평가하는 데 대중화되었다. Cleavage Under Targets & Release Under Nuclease (CUT&RUN)는 크로마틴 면역절단(ChIC)의 게놈 전체 유도체이며, 마이크로코카 뉴클레아제(pA-MNase)에 테더링된 재조합 단백질 A를 사용하여 관심있는 단백질을 표적으로 하는 항체의 IgG 불변 영역을 확인함으로써 관심있는 단백질을 플랭킹하는 DNA의 부위-특이적 절단을 가능하게 한다. CUT&RUN은 히스톤 변형, 전사 인자 및 뉴클레오솜 리모델링 인자와 같은 다른 크로마틴 결합 단백질을 프로파일링하는 데 사용할 수 있습니다. 중요하게도, CUT&RUN은 유색성 또는 이색성 관련 단백질 및 히스톤 변형의 국소화를 평가하는데 사용될 수 있다. 이러한 이유로 CUT&RUN은 광범위한 단백질의 결합 프로파일을 결정하는 강력한 방법입니다. 최근 CUT&RUN은 낮은 세포 집단과 단일 세포에서 전사 인자 프로파일링에 최적화되었으며, 최적화된 프로토콜은 초저 입력 CUT&RUN(uliCUT&RUN)이라고 불립니다. 여기에서는 uliCUT&RUN을 사용하는 단일 세포 인자 프로파일링을 위한 상세한 프로토콜이 수동 96-웰 형식으로 제시된다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

많은 핵 단백질은 크로마틴과 상호작용하여 DNA 주형 활동을 촉진하거나 예방함으로써 기능한다. 이러한 크로마틴 상호작용 단백질의 기능을 결정하기 위해서는 이들 단백질이 결합하는 게놈 위치를 확인하는 것이 중요하다. 1985년 개발 이래, 크로마틴 면역침전(ChIP)은 단백질이 크로마틴 1,2에 결합하는 위치를 확인하기 위한 황금 표준이 되었습니다. 전통적인 ChIP 기술은 다음과 같은 기본 워크 플로우를 가지고 있습니다 : 세포를 수확하고 가교 (일반적으로 포름 알데히드와 함께), 크로마틴은 전단 (일반적으로 가혹한 초음파 처리 방법, 가교 결합이 필요함), 관심있는 단백질은 단백질 (또는 태그가 지정된 단백질)을 표적으로 한 항체를 사용하여 면역 침전되고 보조 항체 (아가로스 또는 자기 비드에 결합), 가교는 역전되고, 단백질과 RNA는 DNA를 정제하기 위해 소화되며, 이 ChIP 농축-DNA는 분석용 주형으로 사용된다(방사성 표지된 프로브1,2, qPCR3, 마이크로어레이 5,6 또는 시퀀싱4 사용). 마이크로어레이의 출현과 대규모 병렬 딥 시퀀싱과 함께, ChIP-chip 5,6 및 ChIP-seq4는 최근에 개발되어 크로마틴에 대한 단백질 국소화의 게놈 전체 동정을 가능하게 한다. 가교 결합 ChIP는 ChIP-exo7 및 ChIP-nexus8의 해상도가 크게 발전한 이래로 강력하고 신뢰할 수있는 기술이었습니다. ChIP-seq의 개발과 병행하여, 전통적인 가교 ChIP 기술에서 수행되는 초음파 처리와는 대조적으로 크로마틴을 단편화하기 위해 뉴클레아제 소화 (종종 미세 구균 뉴클레아제 또는 MNase를 사용함)를 활용하는 ChIP (N-ChIP)에 대한 천연 (비 가교) 프로토콜이 확립되었습니다9. 그러나, 가교결합 ChIP 및 N-ChIP 기술 둘 다에 대한 하나의 주요한 단점은 실험 조작에 따른 낮은 DNA 수율로 인해 높은 세포 수에 대한 요구였다. 따라서 최근 몇 년 동안 낮은 셀 입력을 위해 ChIP 기술을 최적화하려는 많은 노력이 이루어졌습니다. 이러한 노력으로 인해 적용 가능성과 입력 요구 사항10,11,12,13,14,15,16,17,18에 따라 다양한 강력한 ChIP 기반 기술이 개발되었습니다. 그러나, 단일 세포 ChIP-seq 기반 기술은 특히 비히스톤 단백질에 대해 결여되어 있다.

2004년, 크로마틴 내인성 절단(ChEC) 및 크로마틴 면역절단(ChIC)19로 불리는 크로마틴의 단백질 점유율을 결정하기 위한 대체 기술이 개발되었다. 이러한 단일 유전자좌 기술은 관심있는 단백질에 인접한 DNA를 직접 절단하기 위해 관심있는 단백질 (ChEC) 또는 단백질 A (ChIC)에 MNase의 융합을 활용합니다. 보다 최근 몇 년 동안, ChEC와 ChIC 모두 크로마틴(각각 ChEC-seq 및 CUT&RUN)20,21 상의 게놈 전체 단백질 프로파일링에 최적화되었다. ChEC-seq는 인자 국소화를 결정하는 강력한 기술이지만, 각 표적에 대한 MNase-융합 단백질을 개발해야 하는 반면, ChIC와 그 게놈 전반의 변이인 CUT&RUN은 관심있는 단백질(ChIP와 마찬가지로)과 재조합 단백질 A-MNase로 향하는 항체에 의존하며, 여기서 단백질 A는 항체의 IgG 불변 영역을 인식할 수 있다. 대안으로서, 더 넓은 범위의 항체 불변 영역(22)을 인식할 수 있는 융합 단백질 A/단백질 G-MNase(pA/G-MNase)가 개발되었다. CUT&RUN은 크로마틴 게놈 전반에 대한 단백질 국소화를 결정하기 위한 ChIP-seq 에 대한 대중적인 대안이 되었다.

초저 입력 CUT&RUN(uliCUT&RUN)은 로우 및 단일 셀 입력을 사용할 수 있는 CUT&RUN의 변형으로, 201923년에 기술되었습니다. 여기에서, 수동 96-웰 포맷 단일 세포 적용을 위한 방법론이 설명된다. uliCUT&RUN의 개발 이후, 히스톤 프로파일링을 위한 두 가지 대안인 CUT&Tag 및 iACT-seq 가 개발되어 히스톤 단백질24,25의 강력하고 고도로 병렬 프로파일링을 제공한다는 점에 유의해야 합니다. 또한, scCUT&Tag는 단일 세포(multiCUT&Tag)에서 다수의 인자를 프로파일링하고 비히스톤 단백질(26)에 적용하기 위해 최적화되었다. 함께, CUT&RUN은 세포 분류기 및 표준 장비에 액세스할 수 있는 모든 분자 생물학 실험실에서 uliCUT&RUN을 수행할 수 있는 낮은 입력 ChIP-seq 에 대한 매력적인 대안을 제공합니다.

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Protocol

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윤리 성명서 : 모든 연구는 피츠버그 대학의 기관 생물 안전 연구 보호 사무소의 승인을 받았습니다.

1. 마그네틱 비드 준비

참고: 셀 정렬 전에 수행하고 사용할 때까지 얼음을 유지하십시오.

  1. 피펫 30 μL의 ConA-공액 상자성 마이크로스피어 비드 슬러리 믹스를 신선한 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브에 반응시키고 850 μL의 결합 버퍼를 첨가하고, 부드럽게 혼합하기 위해 피펫팅한다.
    참고: ConA 컨쥬게이션된 상자성 마이크로스피어는 지질막 결합을 허용하는 렉틴 코팅 마그네틱 비드입니다.
  2. 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 비드가 1-2 분 동안 자화되도록하십시오. 상청액이 제거되면 구슬을 방해하지 않고 상청액을 제거하고 폐기하십시오.
  3. 마그네틱 랙에서 튜브를 제거하고 1mL의 바인딩 버퍼에 재현탁하여 비드를 세척합니다.
  4. 1.2단계와 1.3단계를 반복합니다.
  5. 비드를 2분 동안 자화시키고 상층액을 제거하여 버린다.
  6. 마그네틱 랙에서 튜브를 제거하고 비드를 반응 당 30μL의 결합 버퍼에 재현탁하십시오.
  7. 세척된 비드 믹스를 세포가 분류될 때까지 얼음 위에 올려 놓는다.

2. 수확 세포

참고: 이 단계는 부착된 세포에 대해 작성되었으며 뮤린 E14 배아 줄기 세포에 최적화되어 있습니다. 세포를 배양하고 수확하는 것은 세포 유형에 따라 다릅니다.

  1. 세포를 37°C 인큐베이터에서 분리하고 현미경으로 검사하여 품질을 보장합니다.
  2. 세포 플레이트로부터 배지를 흡인하고, 5 mL의 1x PBS로 헹구었다.
  3. 플레이트로부터 PBS를 흡인하고 세포를 수확한다 (세포 유형에 따라 다를 수 있는 전통적인 세포 수확 방법을 사용함). 필요한 경우 배양 접시에 대해 혈청 학적 피펫으로 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.
  4. 세포 현탁액을 15 mL 원뿔형 튜브로 옮기고 5분 동안 200 x g 에서 스핀다운한다.
  5. 배지를 흡인하여 버리고 세포 펠릿을 5 mL의 PBS + 1% FBS로 세척한다.
  6. 세포를 200 x g 에서 5분 동안 스핀다운하고, 상청액을 버리고, 세포 펠릿을 5 mL의 PBS + 1% FBS에 재현탁시켰다.
  7. 세포를 계수하고 1 mL의 1 x 106 세포를 신선한 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브로 옮긴다.
  8. 5 μL의 7-아미노악티노마이신 D(7-AAD)를 첨가하고, 튜브 웰을 반전시켜 혼합한 다음, 샘플을 세포 분류기에 적용하여 살아있는 단일 세포를 96-웰 플레이트의 개별 웰로 분류한다.
    참고 : 7-AAD 염료는 살아있는 세포에서 제외되므로 라이브 셀 분류에 사용할 수 있습니다.

3. 세포 분류 및 용해

  1. 세포 분류 전에 각 웰에 100μL의 핵 추출(NE) 버퍼가 있는 세포 분류기 호환 96웰 플레이트를 준비합니다.
  2. 제조업체의 지침에 따라 세포를 96웰 플레이트로 분류합니다.
  3. 플레이트 (30 초 동안 600 x g )를 신속하게 회전시켜 세포가 웰 내의 버퍼 내에 있는지 확인하십시오.
    참고 : 사용중인 세포가 웰의 바닥으로 안정적으로 가져 왔는지 여부를 예비 실험에서 테스트 할 가치가 있습니다.
  4. 샘플을 얼음 위에 15 분 동안 보관하십시오.
  5. 샘플을 4°C에서 5분 동안 600 x g 에서 스핀다운하고 조심스럽게 피펫하여 상청액을 제거하였다(5 μL를 남김).
  6. 각 샘플을 55 μL의 NE 완충액에 재현탁시키고, 30 μL의 미리 세척된 ConA-컨쥬게이션된 상자성 미소 구체들(단계 1.7로부터; 결합 완충액 중)을 각각의 반응에 첨가한다.
  7. 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다.

4. MNase에 의한 조기 소화를 방지하기 위해 샘플을 사전 차단하십시오.

  1. 플레이트를 96웰 마그네틱 랙에 놓고 비드가 최소 5분 동안 결합되도록 한 다음 상층액을 제거하고 버립니다.
  2. 핵 결합 비드에 100μL의 블로킹 버퍼를 추가하고 부드러운 피펫팅으로 혼합합니다.
  3. 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다.

5. 일차 항체의 첨가

  1. 플레이트를 96웰 마그네틱 랙에 놓고 상층액을 최소 5분 동안 맑게 한 다음 비드를 방해하지 않고 상층액을 제거하고 버립니다.
  2. 마그네틱 랙에서 플레이트를 제거하고 부드러운 피펫팅으로 반응 당 100 μL의 워시 버퍼에 비드를 재현탁하십시오.
  3. 플레이트를 96웰 마그네틱 랙에 다시 놓고 상층액을 맑게 한 다음 상층액을 제거하고 버립니다.
  4. 비드를 부드러운 피펫팅으로 반응 당 25 μL의 세척 완충액에 재현탁시킨다.
  5. 일차 항체 마스터 믹스를 만드십시오: 반응 당 25 μL의 세척 완충액 + 0.5 μL의 항체.
  6. 핵-결합된 비드를 부드럽게 볼텍싱하면서, 관심있는 단백질을 표적화하는 항체로 처리되는 각 샘플에 25 μL의 일차 항체 마스터 믹스를 첨가한다 (전형적으로 1:100 최종 희석). 대조군을 수행하는 경우 항체가 없는 세척 완충액 25μL를 첨가한다.
  7. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
  8. 샘플을 96웰 마그네틱 랙에 놓고 상청액을 최소 5분 동안 맑게 한 다음 비드를 방해하지 않고 상층액을 제거하고 버립니다.
  9. 마그네틱 랙에서 플레이트를 제거하고 100μL의 세척 버퍼로 비드를 세척하고 피펫팅으로 재현탁합니다.

6. pA-MNase 또는 pA/G-MNase의 첨가

참고: 단백질 A는 토끼와 같은 특정 종의 IgG 분자에 대해 높은 친화도를 갖지만 생쥐 또는 쥐와 같은 다른 종의 IgG에는 적합하지 않습니다. 대안적으로, 단백질 A/G-MNase가 사용될 수 있다. 이 하이브리드는 토끼, 마우스 및 래트 IgGs에 결합하여, 마우스 또는 래트 일차 항체가 사용될 때 이차 항체의 필요성을 피한다.

  1. 플레이트를 96웰 마그네틱 랙에 다시 놓고 상층액을 최소 5분 동안 맑게 한 다음 비드를 방해하지 않고 상층액을 제거하고 버립니다.
  2. 마그네틱 랙에서 플레이트를 제거하고 각 샘플을 25μL의 세척 버퍼에 재현탁하십시오.
  3. pA-MNase 마스터 믹스를 만든다 (세척 완충액 25 μL + 반응 당 최적화된 양의 pA-MNase).
  4. 부드럽게 볼텍싱하면서, 25 μL의 pA-MNase 마스터 믹스를 대조군 샘플을 포함하는 각 샘플에 첨가한다.
    참고 : pA-MNase의 농도는 수제 인 경우 준비에 따라 다르며 각 독립적 인 정제시 사용하기 전에 테스트해야합니다. pA/G-MNase의 경우 20x 스톡 중 2.5μL를 사용해야 합니다.
  5. 샘플을 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다.
  6. 플레이트를 96웰 마그네틱 랙에 놓고 상층액을 최소 5분 동안 맑게 한 다음 비드를 방해하지 않고 상층액을 제거하고 버립니다.
  7. 마그네틱 랙에서 플레이트를 제거하고 100μL의 세척 버퍼로 비드를 세척하고 부드러운 피펫팅으로 재현탁합니다.

7. 지시된 DNA 소화

  1. 플레이트를 96 웰 마그네틱 랙에 놓고 상청액을 최소 5 분 동안 맑게 한 다음 상층액을 제거하고 버립니다.
  2. 마그네틱 랙에서 샘플을 제거하고 부드러운 피펫팅으로 50μL의 세척 버퍼에 비드를 재현탁시킵니다.
  3. 샘플을 5분 동안 얼음/물 혼합물에서 0°C로 평형화시킨다.
  4. 0°C 얼음/수조에서 샘플을 제거하고 다채널 피펫을 사용하여 100mMCaCl2 1μL를 첨가한다. 더 큰 부피의 다중 채널 피펫을 사용하여 부드러운 피펫팅으로 잘 (3-5 회) 섞은 다음 샘플을 0 °C로 되돌립니다.
    참고 : 여기서 잘 혼합하는 것이 필수적입니다. CaCl2는 관심있는 단백질을 플랭킹하는 DNA의 MNase 소화를 활성화시키기 위해 첨가된다.
  5. 접시가 얼음 / 수조에 돌아 오자마자 10 분 타이머를 시작하십시오.
  6. 50 μL의 2XRSTOP+ 버퍼를 각 웰에 피펫팅하여 반응을 중지시키고,CaCl2 와 동일한 순서로 첨가하였다.
    참고 : 소화가 끝나기 10 분 전에 2XRSTOP+ 버퍼를 만들어 소화를 방지하십시오.

8. 시료 분별

  1. 샘플을 37°C에서 20분 동안 인큐베이션한다.
  2. 플레이트를 4°C에서 5분 동안 16,000 x g 에서 회전시킨다.
  3. 플레이트를 96웰 마그네틱 랙에 놓고 상청액을 최소 5분 동안 맑게 한 다음 상층액을 신선한 96웰 플레이트로 옮깁니다. 구슬을 버리십시오.

9. DNA 추출

  1. 10% 소듐 도데실 설페이트(SDS) 1μL와 20mg/mL 프로테이나제 K 0.83μL를 각 샘플에 첨가한다.
    주의: SDS 분말은 흡입하면 해롭다. 사용자는 고글, 장갑 및 N95 등급 인공 호흡기를 착용하고 환기가 잘되는 공간에서 조심스럽게 다루어야합니다.
  2. 부드러운 피펫팅으로 샘플을 혼합하십시오.
  3. 샘플을 70°C에서 10분 동안 인큐베이션한다.
  4. 플레이트를 실온으로 되돌리고 46.6 μL의 5 M NaCl 및 90 μL의 50% PEG 4000을 첨가한다. 부드러운 피펫팅으로 혼합하십시오.
  5. 33μL의 폴리스티렌-마그네타이트 비드를 각 샘플에 첨가하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다.
    참고 : 폴리스티렌 - 마그네타이트 비드를 실온 (~ 30 분)으로 가져 와서 사용하기 전에 잘 섞으십시오.
  6. 플레이트를 마그네틱 랙에 놓고 상층액을 ~ 5 분 동안 맑게 한 다음 비드를 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 버리십시오.
  7. 비드를 방해하지 않고 150 μL의 80% 에탄올로 2x를 헹구십시오.
    주의: 에탄올은 가연성이 높으며 피부, 눈 및 폐 자극을 유발합니다. 적절한 실험실 의복과 통풍 후드로이 단계를 수행하십시오.
  8. 플레이트를 1000 x g 에서 30초 동안 간단히 회전시킵니다. 플레이트를 96웰 마그네틱 랙에 다시 놓고 비드를 방해하지 않고 잔류 EtOH를 모두 제거합니다.
  9. 샘플을 ~ 2-5 분 동안 공기 건조시킵니다.
    참고: 구슬을 5분 이상 말리지 마십시오. EtOH를 제거하는 것에 대해 부지런하다면, 2-3 분의 건조로 충분합니다.
  10. 비드를 37.5 μL의 10 mM Tris-HCl (pH 8)로 재현탁시키고 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다.
  11. 플레이트를 마그네틱 랙에 놓고 비드가 5 분 동안 결합되도록하십시오.
  12. 36.5 μL의 상청액을 신선한 열순환기 호환 96-웰 플레이트로 옮긴다. 구슬을 버리십시오.
    참고: 실험은 -20°C에서 샘플을 저장하여 여기에서 중지하거나 라이브러리 빌드를 계속할 수 있습니다(단계 10-15).

10. 최종 수리, 인산화, 아데닐화

참고: 시약은 재료 표에 참조된 대로 공급됩니다. 아래의 프로토콜은 NEBNext Ultra DNA II 키트와 같은 상용 키트와 유사한 방법을 따릅니다.

  1. 5 U/μL의 T4 DNA 중합효소 1:20을 1x T4 DNA 리가아제 완충액에 희석한다.
  2. 최종 수리/3'A 마스터 믹스 준비: 2 μL의 10x T4 DNA 리가아제 완충액, 2.5 μL의 10 mM dNTPs, 10 mM ATP의 1.25 μL, 3.13 μL의 40% PEG 4000, 0.63 μL의 10 U/μL T4 PNK, 0.5 μL의 희석된 T4 DNA 중합효소, 0.5 μL의 5U/μL Taq DNA 중합효소, 반응 당 13.5 μL의 총 부피.
    참고: 피펫팅하기 전에 40% PEG 4000을 실온으로 가져와야 합니다.
  3. 13.5μL의 최종 수리/3'A 마스터 믹스를 36.5μL의 DNA에 첨가한다.
  4. 빠른 와류에 의해 반응을 혼합 한 다음 빠른 스핀 (10 초 동안 500 x g ).
  5. >20°C의 온도 동안 가열된 뚜껑과 함께 예냉된 열사이클러에서 다음의 반응 조건을 사용하여 인큐베이션한다. 반응 조건을 사용하십시오 : 15 분 동안 12 °C, 15 분 동안 37 °C, 20 분 동안 72 °C, 4 °C에서 유지.

11. 어댑터 결찰

참고: 다음 반응을 설정하는 동안 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. 피펫팅하기 전에 리가아제 완충액이 실온으로 오도록 하십시오. 어댑터( 표 표 참조)를 10 mM NaCl(pH 7.5)을 함유하는 10 mM Tris-HCl의 용액에 희석한다. 수율이 낮기 때문에 CUT&RUN-농축 DNA를 미리 정량화하지 마십시오. 오히려, 0.6 μM의 최종 작동 어댑터 농도를 사용하여 어댑터의 25배 희석물을 생성한다.

  1. 라이게이션 마스터 믹스를 만드십시오 : 55 μL의 리가아제 완충액 (2x), 5 μL의 T4 DNA 리가아제 및 5 μL의 희석 어댑터, 반응 당 65 μL의 총 부피.
  2. 마스터 라이게이션 믹스 65 μL를 단계 10.5로부터의 DNA 50 μL에 첨가한다.
  3. 빠른 볼텍싱으로 혼합한 다음 빠른 회전(10초 동안 500 x g )합니다.
  4. 20°C에서 15분 동안 (가열된 뚜껑 없이) 열순환기에서 인큐베이션한다.
    참고: 즉시 다음 단계로 진행하십시오.

12. 사용자 소화

  1. 3 μL의 USER 효소를 각 샘플, 와류 및 스핀에 첨가한다(10초 동안 500 x g ).
  2. 37°C에서 15분 동안 열 사이클러에서 인큐베이션한다(50°C로 설정된 가열된 뚜껑).

13. 폴리스티렌-마그네타이트 비드 라이게이션 반응 후 정리

참고: 폴리스티렌-마그네타이트 비드가 실온(~30분)에서 평형을 이루도록 하십시오. 소용돌이를 사용하여 비드 용액을 균질화한다. 실온에서 다음 단계를 수행하십시오.

  1. 39 μL(0.33x)의 폴리스티렌-마그네타이트 비드 용액을 어댑터 라이게이션된 DNA를 포함하는 각 웰에 첨가한다.
  2. 피펫팅에 의해 완전히 혼합하고, 이어서 DNA가 비드에 결합할 수 있도록 샘플을 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다.
  3. 샘플을 96-웰 마그네틱 랙 상에 놓고 상청액이 맑아질 때까지 5분 동안 인큐베이션한다.
  4. 플레이트를 마그네틱 랙에 보관하고 구슬을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하고 버리십시오.
  5. 비드를 방해하지 않고 80% EtOH 중 200 μL로 헹구십시오.
  6. 96웰 마그네틱 랙에서 30초 동안 인큐베이션하여 용액을 맑게 합니다.
  7. 구슬을 방해하지 않고 상층액을 제거하고 버리십시오.
  8. 총 두 번의 세척에 대해 13.5-13.7단계를 반복합니다.
  9. 플레이트를 500 x g 에서 10초 동안 잠깐 회전시키고, 플레이트를 96-웰 마그네틱 랙 상에 다시 놓고, 비드를 방해하지 않고 잔류 EtOH를 제거한다.
  10. 플레이트를 마그네틱 랙에 보관하고 샘플을 2 분 동안 공기 건조시킵니다.
    참고: 구슬을 과도하게 말리지 마십시오.
  11. 플레이트를 마그네틱 랙으로부터 분리하고, 비드를 28.5 μL의 10 mM Tris-HCl (pH 8)에 재현탁시켰다.
    주의: 염산은 매우 부식성이 있습니다. 사용자는 고글, 장갑 및 실험실 코트를 착용 한 화학 흄 후드에서주의 깊게 처리해야합니다.
  12. 피펫팅으로 구슬을 완전히 재현탁하고 거품이 생기지 않도록주의하십시오.
  13. 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다.
  14. 플레이트를 96웰 마그네틱 랙에 놓고 용액이 5분 동안 지워지도록 합니다.
  15. 27.5 μL의 상청액을 새로운 PCR 플레이트로 옮기고 비드를 버린다.

14. 도서관 농축

참고 : 프라이머는 어댑터와 동일한 용액으로 희석됩니다. 이 라이브러리 빌드를 위해, 0.6 μM의 최종 작동 프라이머 농도를 사용하십시오.

  1. 5 μL의 희석된 인덱싱된 프라이머 ( 물질 표 참조)를 각 샘플에 첨가한다.
    참고: 각 샘플은 시퀀싱 후 식별하기 위해 다른 인덱스가 필요합니다.
  2. PCR 마스터 믹스를 준비한다: 10 μL의 5x 고충실도 PCR 버퍼, 1.5 μL의 10 mM dNTPs, 5 μL의 희석된 유니버설 프라이머, 1 μL의 1 U 핫스타트 고충실도 중합효소, 샘플 당 17.5 μL의 총 마스터 믹스 부피를 갖는다.
  3. 정제된 어댑터-라이게이션된 DNA 32.5 μL에 17.5 μL pf PCR 믹스를 첨가한다(5 μL의 인덱싱된 프라이머가 이 부피에 포함된다).
  4. 피펫팅으로 용액을 혼합하십시오.
  5. 3°C/s의 최대 램프 속도를 갖는 다음의 반응 조건을 사용하여 열순환기에서 인큐베이션한다: 45초 동안 98°C, 45초 동안 98°C, 10초 동안 60°C, 21회 반복, 72°C 1분, 4°C에서 유지.
    참고: 샘플은 단기 보관을 위해 4°C, 장기 보관을 위해 -20°C에서 보관할 수 있습니다.

15. 폴리스티렌 마그네타이트 비드 정리

  1. 60 μL (1.2x)의 폴리스티렌-마그네타이트 비드를 각 샘플에 첨가한다.
  2. 피펫팅에 의해 비드를 재현탁시키고 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다.
  3. 용액이 맑아질 때까지 5 분 동안 마그네틱 랙에 플레이트를 놓습니다.
  4. 상청액을 버리고 비드를 방해하지 않고 80% EtOH의 200 μL로 비드를 헹구십시오.
  5. 총 두 개의 80% EtOH 세척에 대해 세척 단계를 반복한다.
  6. 플레이트를 500 x g 에서 10초 동안 회전시키고, 플레이트를 96웰 마그네틱 랙에 놓고, 비드가 5분 동안 결합되도록 합니다.
  7. 피펫은 비드를 방해하지 않고 과량의 EtOH를 제거하고 비드를 2분 동안 공기 건조시킬 수 있게 한다.
    참고: 구슬을 과도하게 말리지 마십시오.
  8. 비드를 21 μL의 뉴클레아제가 없는 물에 재현탁시키고 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다.
  9. 플레이트를 마그네틱 랙에 놓고 용액이 5 분 동안 지워지도록하십시오.
  10. 20 μL의 상청액을 새로운 플레이트로 옮긴다.
    참고: 실험은 샘플을 -20°C에서 저장함으로써 여기에서 중지될 수 있다.
  11. 1x HS 시약을 사용하여 형광계( 표 참조)로 라이브러리 농도를 정량화한다.
  12. 농도가 허용하는 경우, 저분자량 사다리가있는 1.5 % 아가로스 겔에서 30 ng의 샘플을 실행하여 시각화하십시오. 또는 조각 분석기 또는 관련 계측기에서 시각화합니다.
  13. Illumina 플랫폼의 시퀀스 라이브러리를 사용하여 ~ 50,000-100,000개의 고유하게 매핑된 읽기를 얻을 수 있습니다.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서, 96-웰 수동 포맷 uliCUT&RUN을 사용하여 크로마틴에 대한 단일 세포 단백질 프로파일링을 위한 상세한 프로토콜이 제시된다. 결과는 프로파일링되는 단백질 (단백질 풍부도 및 항체 품질로 인해), 세포 유형 및 기타 기여 요인에 따라 달라질 수 있지만,이 기술에 대한 예상 결과는 여기에서 논의됩니다. 세포 품질(세포 외관 및 생존 가능한 세포의 퍼센트) 및 단일 세포 분류는 NE 버퍼로 라이브 셀 정렬 전 또는 시에 평가되어야 한다. ES 세포 콜로니 및 세포 분류의 예가 도 2A, B에 도시되어 있다. 특히, 품질이 낮은 세포는 사용해서는 안되며, 품질이 문제가되는 경우 특정 세포 유형에 대한 지침을 따르도록주의해야합니다. 또한, 세포 분류 장비에 의한 정확한 세포 분류는 실험 전에 평가되어야 한다. 예를 들어, 시험 세포는 Hoechst 33342 염색을 사용하여 분류 및 염색될 수 있고, 각 웰에서 0 또는 1개의 세포...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CUT&RUN은 크로마틴에 대한 단백질 국소화를 결정하는 효과적인 프로토콜입니다. 1) 높은 신호 대 잡음비, 2) 빠른 프로토콜 및 3) 낮은 시퀀싱 읽기 커버리지가 필요하므로 비용 절감으로 이어지는 등 다른 프로토콜에 비해 많은 이점이 있습니다. 단백질 A- 또는 단백질 A/G-MNase의 사용은 CUT&RUN이 사용 가능한 모든 항체와 함께 적용될 수 있게 합니다. 따라서 많은 단백질을 빠르고 쉽게 프로파일 링 할 수있는 잠재력이 있습니다. 그러나, 크로마틴 상의 임의의 단백질 프로파일링에 대한 단일 세포에 대한 적응은 특히 단일 세포 전사체(즉, scRNA-seq)와 비교했을 때, RNA에 비해 DNA의 낮은 카피 수(DNA의 두 개 내지 네 개의 카피 대 가능한 수천 개의 RNA 카피)로 인해 어려웠다.

위에서 설명한 프로토콜에서는 몇 가지 중요한 단계를 고려해야 합니다. 첫째, 세포의 적절한 분류는 세포(또는 조직) 유형에 따라 달라지며, 정확한 분류를 위해 주의를 기...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는이 프로젝트와 관련된 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 원고의 이전 버전에 대한 읽고 의견을 보내 주신 Hainer Lab 회원들에게 감사드립니다. 이 프로젝트는 피츠버그 UPMC 아동 병원의 피츠버그 건강 과학 시퀀싱 코어에서 사용할 수있는 NextSeq500을 사용하여 윌리엄 맥도날드 (William MacDonald) 이사에게 특별한 감사의 말을 전했습니다. 이 연구는 피츠버그 대학 연구 컴퓨팅 센터 (University of Pittsburgh Center for Research Computing)가 제공된 컴퓨터 리소스를 통해 부분적으로 지원했습니다. 이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health Grant Number) R35GM133732 (S.J.H.)의 지원을 받았다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL 투명 마이크로분리관ThermoFisher Scientific90410
1.5 mL 튜브 마그네틱 랙ThermoFisher Scientific12321D
1.5 mL 튜브 호환 저온 원심분리기Eppendorf5404000537
10 cm 멸균 조직 배양 플레이트ThermoFisher Scientific150464
10X T4 DNA 리가아제 버퍼New England BiolabsB0202S
15 mL 원뿔형 튜브VWR89039-656
1X TE 버퍼ThermoFisher Scientific12090015
200 µ L PCR 튜브Eppendorf951010022
2X 퀵 리가제 버퍼New England BiolabsM2200리가아제 버퍼
5X KAPA HiFi 버퍼Roche79588890015X 고충실도 PCR 버퍼
7-Amino-Actinomycin D (7-AAD)Fisher ScientificBDB559925
96-well magnetic rackThermoFisher Scientific12027 또는 12331D
96웰 플레이트VWR82006-636
AMPure XP 비드Beckman CoulterA63881폴리스티렌-마그네타이트 비드; AMPure XP 비드 로트 간의 잠재적인 변동성으로 인해 AMPure 비드 용액을 보정하는 것이 좋습니다. 제조사 보기' s 지침
관심 단백질에 대한 항체다양합니다
ATPThermoFisher ScientificR0441
BioMag Plus Concanavalin A beadsPolysciences86057-10ConA-conjugated paramagnetic microspheres
BSA
Calcium Chloride (CaCl2)Fisher ScientificAAJ62905AP
Cell sorterBD FACSAria II cell sorter교육 필요
세포 배양을 위한 세포 특이적 매체다양함
클로로포ThermoFisher ScientificC298-500클로로포름은 삼키면 피부를 자극하고 해롭습니다. 장갑, 실험복, 고글을 사용하여 화학 흄 후드를 다루십시오
64비트 프로세서가 있는 컴퓨터 및 슈퍼 컴퓨팅 클러스터에결과 염기서열분석 데이터셋의 컴퓨터 분석용
DNA 스핀 컬럼Epoch Life Sciences1920-250
dNTP 세트New England BiolabsN0446S
EGTASigma AldrichE3889
전기영동 장비다양
에탄올Fisher Scientific22032601100% vol/vol 에탄올은 가연성이 높습니다. 장갑, 실험복을 사용하여 화학 흄 후드에서 처리하고, 그리고 고글
에틸렌디아민테트라아세트산  (에디타)Fisher ScientificBP2482100
FBSSigma AldrichF2442
글리세롤Fisher ScientificBP229-1
글리코겐VWR97063-256
HEPESFisher ScientificBP310-500
이종 S. cerevisiae DNA 스파이크 인수제가교결합, MNase 분해 및 아가로스 겔에서 단백질/RNA를 정제하고 10ng/mL로 희석한 게놈 DNA를 추출하여 제조했습니다. 효모 게놈 DNA를 권장하지만 필요한 경우 다른 유기체를 사용할 수 있습니다.
염산  (HCl)Fisher ScientificA144-212염산은 부식성이 매우 강하며, 장갑, 실험복 및 고글을 사용하여 화학 흄 후드에서 취급
얼음 양동이는다양한
Illumina 염기서열분석 플랫폼(예: NextSeq500)Illumina
인큐베이터ThermoFisher Scientific51030284
KAPA 핫스타트 하이파이 DNA 중합효소(5X 포함) KAPA HiFi 버퍼Roche7958889001핫스타트 고충실도 중합효소
층류 후드Bakery CompanySG404
염화망간(MnCl2)시그마 알드리치244589
마이크로피펫 세트Rainin30386597
미니퓨지벤치마크 사이언티픽C1012
NEB 어댑터New England BiolabsE6612AVIAL어댑터
NEB 범용 프라이머New England BiolabsE6611AVIAL범용 프라이머
NEBNext 멀티플렉스 올리고 Illumina 키트New England BiolabsE7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L인덱스 프라이머
음성 대조 항체항체-온라인ABIN101961
Nuclease Free waterNew England BiolabsB1500S
PCR thermocyclerEppendorf2231000666
Phase lock tubesQiagen129046
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI)ThermoFisher Scientific15593049Phenol은 삼키거나 피부 접촉 시 유해합니다. 장갑, 실험복 및 고글
을 사용하여 화학 흄 후드를 다루십시오.Phsophate buffered saline (PBS)ThermoFisher Scientific10814010
피펫 보조제Drummond Scientific# 4-000-100
폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 4000VWRA16151
염화칼륨 (KCl)Sigma AldrichP3911
수산화칼륨 (KOH)Fisher ScientificP250-1주의: KOH는 용액에서 고체이며 부식성으로 눈/피부에 자극을 줍니다. 장갑, 실험복 및 고글을 사용하여 화학 흄 후드에서 취급
프로테아제 억제제ThermoFisher Scientific78430
ProteinA/G-MNaseEpicypher15-1016pA/G-MNase
ProteinA-MNase, pK19pA-MNaseAddgene86973
Proteinase KNew England BiolabsP8107S
Qubit 1X dsDNA HS Assay KitThermoFisher ScientificQ33230
큐비트 어세이 튜브ThermoFisher ScientificQ32856
큐비트 형광계ThermoFisher ScientificQ33238
퀵 리가아제와 2X 퀵 리가제 버퍼New England BiolabsM2200S
RNase ANew England BiolabsT3010
나트륨 아세테이트  (나오오크)ThermoFisher ScientificBP333-500
염화나트륨(NaCl)Sigma AldrichS5150-1L
도데실황산나트륨(SDS)ThermoFisher ScientificBP166-500SDS는 흡입하면 유독합니다. 수산화나트륨(NaOH)을 취급할 때 장갑, 보안경 및 N95 등급 호흡기를 사용하여 환기가 잘 되는 공간에서 조심스럽게 다루십시오
.Fisher ScientificS318-1NaOH는 용액에서 고체로 눈/피부를 자극하는 물질입니다. 장갑, 실험복 및 고글을 사용하여 화학 흄 후드를 처리합니다
SpermidineSigma AldrichS2626
표준 도립 광 현미경Leica11526213
표준 실험실 아가로스 젤 재료다양함
혈청학적 피펫 및 피펫 팁과 같은 표준 실험실 재료다양함
T4 DNA 리가제New England BiolabsM0202S
T4 DNA 중합효소New England BiolabsM0203S
T4 PNKNew England BiolabsM0201S
탁상용 볼텍서Fisher Scientific2215414
Taq DNA 중합효소New England BiolabsM0273S
써모믹서Eppendorf5384000020대안, 수조를 사용할 수 있습니다
트리스 베이스피셔 사이언BP152-5
트리톤 X-100시그마 알드리치9002-93-1
튜브 로테이터VWR10136084
USER 효소New England BiolabsM5505S
는 름 . 액세스할 수 있습니다.온도 및 대기 제어 기능이 있는 . 티픽 트리톤 X-100은 위험합니다. 트립신 피셔 사이언티픽 MT25052 를 다룰 때는 실험복, 장갑 및 고글을 사용하십시오.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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