이 원고는 쥐의 눈에서 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 단계적으로 분리하기위한 단순화 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에는 마우스 눈의 핵 제거 및 해부, RPE 세포의 분리, 파종 및 배양이 포함됩니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
정오 공지
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
요약
초록
망막 색소 상피 (RPE) 층은 광 수용체 바로 뒤에 있으며 광 수용체의 기능을 유지하는 데 몇 가지 중요한 역할을하는 복잡한 대사 시스템을 보유하고 있습니다. 따라서 RPE 구조와 기능은 정상적인 시력을 유지하는 데 필수적입니다. 이 원고는 1차 마우스 RPE 세포 분리를 위한 확립된 프로토콜을 제시합니다. RPE 분리는 안구 질환의 다양한 마우스 모델에서 RPE 병리의 기초가 되는 분자 메커니즘을 조사하는 훌륭한 도구입니다. 또한 RPE 분리는 야생형 및 유전자 변형 마우스에서 분리된 1차 마우스 RPE 세포를 비교하고 시각 장애 치료제 개발을 가속화할 수 있는 약물을 테스트하는 데 도움이 될 수 있습니다. 원고는 단계별 RPE 격리 프로토콜을 제시합니다. 핵 제거에서 파종까지 전체 절차는 약 4 시간이 걸립니다. 분리 된 세포의 성장을 방해받지 않고 허용 할 수 있도록 파종 후 5-7 일 동안 배지를 변경해서는 안됩니다. 이 과정은 면역형광을 통해 세포의 형태학, 색소 침착 및 특정 마커의 특성화로 이어집니다. 세포는 최대 3 또는 4회 계대배양될 수 있다.
서론
망막 색소 상피 (RPE) 세포는 맥락막과 신경 망막 사이에 위치하여 광 수용체 (PR) 세포1 뒤에있는 직육면체 세포의 단순한 단층을 형성합니다. RPE는 주로 활성 산소 종(ROS)의 과도한 축적과 그에 따른 산화적 손상을 줄임으로써 PR 세포의 건강한 환경을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다1. RPE 세포는 레티노이드의 전환 및 저장, 산란광의 흡수, 유체 및 이온 수송, 흘린 PR 외부 분절 막 2,3의 식균 작용과 같은 많은 기능을 감독합니다. RPE (형태 / 기능)의 변화는 망막 병증으로 이어지는 기능을 손상시킬 수 있으며 이는 많은 안구 질환에서 공유하는 공통적 인 특징입니다4. 많은 안구 질환은 색소성 망막염, Leber 선천성 무균증 및 백색증 4,5,6과 같은 일부 유전 질환뿐만 아니라 당뇨병성 망막병증(DR) 및 연령 관련 황반변성(AMD)과 같은 연령 관련 안구 질환을 포함하여 RPE 세포의 형태 및 기능의 변화와 관련이 있습니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
동물은 오클랜드 대학 IACUC 동물 프로토콜 번호 21063의 지침 및 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 ARVO 성명서의 지침에 따라 사용되었습니다.
1. 용액 준비
- Dulbecco의 변형 된 독수리 배지 / 영양소 혼합물 F-12 (DMEM / F12)에 25 % 태아 소 혈청 (FBS), 1.5 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 0.02 % 겐타 마이신을 보충하여 완전한 RPE 세포 배양 배지를 준비하십시오.
- 741μL의 행크 밸런스드 소금 용액(HBSS)에 127μL의 콜라게나제 원액과 132μL의 히알루로니다제 원액을 보충하여 효소 A를 준비합니다. 이것은 4 개의 눈을 치료할 수있는 1mL의 최종 부피를 만듭니다.
- 클로스트리디움 히스토리티쿰으로부터 1mg의 콜라게나제를 41mL의 HBSS(19.5단위/mL)에 용해시켜 콜라게나제 원액을 제조한다.
- 소 고환으로부터 1mg의 히알루로니다아제를 18.4mL의 HBSS(38단위/mL)에 용해시켜 히알루로니다아제 원액을 제조한다.
- HBSS의 세 부분에 0.25% 트립신-EDTA의 두 부분을 추가하여 효소 B를 준비합니다. 총 부피....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
분리된 RPE 세포의 특이성, 순도 및 장벽 기능/형성에 대한 검증
분리된 세포를 광학 현미경으로 검사하여 생존력, 형태 및 색소 침착을 확인했습니다. P0 및 P1의 이미지 (그림 1A, B)와 P0 및 P4의 이미지 (그림 1C, D)를 캡처하여 셀의 변화를 보여줍니다. 계대가 제4 계대까지 진행됨에 따라 형태, 크기, 및 색소침착(검은색 화살표는 P4에서 단리된 RPE 세포를 가리킴). RPE65 단백질에 대한 항체를 사용하여 분리된 세포의 신원을 확인하였다. 분리된 세포의 면역형광 염색은 RPE65에 대한 항체로 수행하고, 형광 현미경으로 검사하였다(그림 1E, F: 저배율 및 그림 1G,H: 고배율, 녹색으로 양성으로 염색된 RPE 세포 및 파란색의 핵 마커 DAPI). RPE65는 RPE에.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
현재 프로토콜은 마우스 눈에서 RPE 분리를 위해 보고, 수정 및 단순화된 세부 절차입니다. 이 프로토콜에는 마우스 눈에서 분리된 RPE 세포의 핵 제거, 해부, 수집, 파종, 배양 및 특성 분석이 포함됩니다.
성공적인 RPE 분리를 위해 충족해야 하는 몇 가지 제한 사항과 중요한 단계(예: 마우스 나이, 해부된 눈의 수, 조직 배양 접시 또는 접시의 크기, 파종, 보관 및 계대 배양 후 주의 사항)가 있습니다. 분리된 세포를 최대 3-4회 통과할 수 있으려면, 가장 좋은 마우스 연령은 18-21일 사이이다. 성장하고 증식할 수 있는 합리적인 수의 분리된 세포를 가지려면 단일 분리를 위해 최소 두 개의 눈이 필요합니다. 분리를 초래하는 세포의 수는 해부된 눈의 수에 비례합니다(~220,000개의 세포/눈). 멸균 100mm 페트리 접시/플라스크는 초기 계대(P0)에서 더 많은 수의 세포를 얻기 위해 권장됩니다. 파종 후, 인큐베이터에서 조직 배양 플레이트를 이동하거나 적어도 5 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 이 기사의 내용과 관련이 있다고 선언할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 국립 안과 연구소 (NEI), 국립 안과 연구소 (NEI) 기금 R01 EY029751-04의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 비커 : 100mL | KIMAX | 14000 | |
| 콜라겐분해효소, Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C7657-25MG | 작동 효소, 일회용 |
| 졸업 전사 피펫 :3.2mL 멸균 | 13-711-20 | ||
| DMEM/F12 | 지브코 | 11330 | RPE 세포를 성장시키는 배지 |
| 소 태아 혈청(FBS) | gibco | 26140079 | 완전한 RPE 세포 배양 배지용 |
| 겐타마이신 시약 용액 | gibco | 15750-060 | 완전한 RPE 세포 배양 배지용 |
| Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS) | Thermo Scientific | 88284 | 작동 효소용(A& 나) |
| Heracell VISO 160i CO2 인큐베이터 | Thermo Scientific | 50144906 | |
| 소 고환의 히알루로니다아제 | Sigma-Aldrich | H3506-500MG | 작동 효소 A용 |
| Kimberly-Clark | 34155 | ||
| Luer-Lok 주사기(바늘 부착 포함) 21 G x 1 1/2 in., sterile, single-use, 3 mL | B-D | 309577 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브: 2 mL | Grainger | 11L819 | |
| 마우스 단클론 항-RPE65 항체 | Abcam, Cambridge, MA, USA, | ab78036 | IF 염색용 |
| Pen Strep | gibco | 15140-122 | 완전한 RPE 세포 배양 배지 |
| 포지티브 액션 핀셋, 스타일 5/45 | Dumont | 72703-DZ | |
| 가위 Iris 표준 스트레이트 11.5cm | GARANA INDUSTRIES | 2595 | |
| Sorvall St8 원심분리기 | ThermoScientific | 75007200 | |
| Stemi 305 현미경 | Zeiss | n/a | |
| 수술용 블레이드, #11, 스테인리스 스틸 | Bard-Parker | 371211 | |
| 서스펜션 배양 접시 60mm x 15mm 스타일 | 코닝 | 430589 | |
| 조직 배양 접시: 100x20mm 스타일 | 코닝 | 353003 | |
| 토네이도 튜브: 15mL | Midsci | C15B | |
| 토네이도 튜브: 50mL | Midsci | C50R | |
| 트립신 EDTA(1x) 0.25% | gibco | 2186962 | 작동 효소 B |
| 핀셋 5MS, 8.2cm, 스트레이트, 0.09x0.05mm 팁 | Dumont | 501764 | |
| 핀셋 포지티브 액션 스타일 5, 생물학적, Dumostar, 광택 마감, 110 mm OAL | 전자 현미경 과학 Dumont | 50-241-57 | |
| 언더패드, 보통 : 23" x 36" | McKesson | 4033 | |
| Vannas 스프링 가위 - 2.5mm Cutting Edge | FST | 15000-08 | |
| 자이스 AxioImager Z2 | 자이스 | 해당 없음 | |
| 자이스 젠 블루 2.6 | 자이스 | 해당 없음 |
참고문헌
- Young, R. W., Droz, B. The renewal of protein in retinal rods and cones. The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 80....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells
Posted by JoVE Editors on 12/07/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. The Discussion and References sections were updated.
The third paragraph of the Discussion section was updated from:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
to:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
In the References section, a 24th reference was added:
- Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).
