무지개 유사 라만 염료의 전자 사전 공명 자극 라만 산란 (epr-SRS) 이미징은 고도로 다중화 된 에피토프 기반 단백질 이미징을위한 새로운 플랫폼입니다. 여기에서는 항체 준비, 조직 샘플 염색, SRS 현미경 어셈블리 및 epr-SRS 조직 이미징을 포함한 실용적인 가이드를 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
조직에서 특정 바이오마커의 광대 한 범위를 시각화하는 것은 복잡한 생물학적 시스템의 복잡한 조직을 탐구하는 데 중요한 역할을합니다. 따라서 고도로 다중화된 이미징 기술이 점점 더 높이 평가되고 있습니다. 여기에서, 우리는 무지개와 같은 라만 염료의 전자 사전 공명 자극 라만 산란 (epr-SRS) 이미징을 통해 표준 면역 형광에 필적하는 감도를 가진 특정 단백질의 고도로 다중화 된 진동 이미징의 새로운 플랫폼을 설명합니다. 이 방법은 종래의 면역형광에서 분광적으로 분해가능한 채널의 한계를 우회하고, 아세포 분해능을 갖는 조직에서 다중 마커를 심문하기 위한 원샷 광학 접근법을 제공한다. 일반적으로 파라포름알데히드-고정 조직, 동결 조직, 및 포르말린-고정 파라핀 포매(FFPE) 인간 조직을 포함하는 표준 조직 제제와 양립가능하다. 우리는이 플랫폼이 생물학적 표본의 단백질 상호 작용, 특히 두꺼운 손상되지 않은 조직에 대한보다 포괄적 인 그림을 제공 할 것으로 기대합니다. 이 프로토콜은 항체 준비에서 조직 샘플 염색, SRS 현미경 어셈블리, epr-SRS 조직 이미징에 이르는 워크플로우를 제공합니다.
서론
복잡한 조직 시스템은 공간적 위치와 상호 작용 네트워크가 기능 및 기능 장애 1,2와 깊이 얽혀있는 별개의 세포 하위 집단으로 구성됩니다. 조직 구조를 밝히고 복잡성을 조사하기 위해서는 단일 세포 분해능에서 단백질의 공간적 위치에 대한 지식이 필수적입니다. 따라서 고도로 다중화 된 단백질 이미징 기술은 점점 더 높이 평가되어 조직 생물학 3,4,5을 연구하기위한 초석이 될 수 있습니다. 현재의 일반적인 다중화 단백질 이미징 방법은 크게 두 가지 범주로 분류할 수 있다. 하나는 여러 차례의 조직 염색 및 이미징에 의존하는 직렬 면역 형광 이미징이고, 다른 하나는 중금속 태깅 항체 6,7,8,9,10,11,12와 결합 된 질량 세포 측정법을 이미징하는 것입니다.
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프로토콜
이 프로토콜은 컬럼비아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에서 승인 한 동물 실험 프로토콜 (AC-AABD1552)에 따라 수행되었습니다.
1. 라만-염료-컨쥬게이션된 항체의 제조
- 콘쥬게이션 버퍼를 PBS 완충액 중의 ∼0.1 MNaHCO3 로 제조하고, pH = 8.3, 4°C에서 보관한다.
- 무수 DMSO 중에서 3 mM로서 N-하이드록시숙신이미디(NHS) 에스테르 기능화 MARS 프로브(보충 물질) 용액을 제조하였다. MARS 프로브의 합성은 선행 보고13,17,18을 참조할 수 있다.
참고: 저장 목적을 위해, 염료 NHS 에스테르 용액은 빛으로부터 보호되어야 하고 -20°C에서 유지되어야 한다. - 항체 고체를 콘쥬게이션 완충액에 2mg/mL의 농도로 용해시킨다. 다른 완충액에 용해된 항체의 경우, 원심 필터로 1-2 mg/mL의 농도로 콘쥬게이션 버퍼로 교환하십시오.
참고: 고도로 교차-흡착된 이차 항체는 종간 반응성을 최소화하....
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결과
도 3은 고정된 세포(도 3A), 파라포름알데히드(PFA)-고정된 마우스 조직(도 3B), 및 포르말린-고정 파라핀 포매(FFPE) 인간 표본(도 3C)을 포함하는 상이한 샘플에서의 epr-SRS의 예시적인 이미지를 도시한다. SRS 현미경의 공간 분해능은 회절 제한이며, 일반적인 측방향 분해능은 ~ 300nm이며, 축 분해능은 여기를 위해 근적외선을 사용하는 1-2 μm입니다. 그 결과, HeLa 세포에서 미세소관과 같은 미세한 세포내 구조는 α-튜불린의 면역-eprSRS 영상화로 충실하게 밝혀졌다(도 3A). 더욱이, epr-SRS는 일반적으로 FFPE 조직과 양립할 수 있으며(도 3C), 이는 임상 진단 및.......
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토론
여기에서, 우리는 갓 보존된 마우스 조직, FFPE 인간 조직 및 동결된 마우스 조직을 포함하는 일반적인 조직 유형에 광범위하게 적용 가능한 면역-eprSRS 프로토콜을 제시한다. 면역-eprSRS는 표 1에 열거된 바와 같이 세포 및 조직에서 에피토프의 패널에 대해 검증되었다. 이 원샷 플랫폼은 순환 전략이 잘 작동하지 않는 응용 분야에 특히 적합합니다. 예를 들어, 순환 형광은 3D 면역 표지의 다중 라운드가 비실용적 인 긴17이기 때문에 두꺼운 조직에 대해 요구된다. 또한 비선형 3D 조직학적 변화(11,17)로 인해 등록 오류가 발생할 가능성이 매우 높습니다. Immuno-eprSRS는 이러한 시나리오에서 순환 형광의 실질적인 장벽을 극복하고 대량에 걸쳐 단백질 상호 작용 네트워크를 밝힐 수있는 기회를 제공합니다1.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
마우스 췌장 조직을 제공해주신 Ruth A. Singer와 Richard K.P. Benninger에게 감사드립니다. W.M.은 NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) 및 미국 육군 (W911NF-19-1-0214)의 지원을 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
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| 16% 파라포름알데히드, EM 등급 | 전자 현미경 과학 | 15710 | |
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| &베타;-III-튜불린 | BioLegend | 657402 | 1차 항체 |
| &베타;-III-튜불린 | Abcam | ab41489 | Primary antibodies |
| β-tubulin | Abcam | ab131205 | Primary antibodies |
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| 반전 레이저 스캐닝 현미경 | Olympus | FV1200MPE | |
| Kinematic 미러 마운트 | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 저프로필 육각 조정기 |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat)Sigma | Aldrich | L0636-5 mg | |
| 롱패스 이색성 빔 스플리터 | Semrock | Di02-R980-25x36 | 980 nm 레이저 BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
| MAP2 | BioLegend | 801810 | 1차 항체 |
| 현미경 이미징 소프트웨어 | Olympus | FluoView | |
| NanoQuant Plate | Tecan | 플레이트 리더에서 흡광도 기반의 소량 분석용. | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Thermo Scientific | R37606 | |
| Nunc 4-Well Dishes | Fisher Scientific | 12-566-300 | |
| 대물 렌즈 | Olympus | XLPlan N | x25, 1.05-NA, MP, working distance 2 mm |
| 페인트 브러시 | |||
| 잠망경 어셈블리 | Thorlabs | RS99 | 는 상단 및 하단 유닛을 포함하며, Ø 1" 포스트 및 클램핑 포크. |
| pH 측정기 | |||
| 플레이트 리더 | Tecan | Infinite 200 PRO | 사용하기 쉬운 멀티모드 플레이트 리더. 230&ndash의 스펙트럼 범위에 걸친 흡광도 측정 기능; 1000 nm의 |
| ProLong Gold antifade reagent | Thermo Scientific | P36930 | |
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| Synapsin 2 | ThermoFisher | OSS00073G | 일차 항체 |
| Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides | Fisher Scientific | 22-035813 | 신선하거나 포르말린으로 고정된 조직 절편을 슬라이드 표면에 단단히 끌어당기고 화학적으로 결합하는 접착 슬라이드(tiisue 바인딩 유리 슬라이드) |
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| Vibratome | Leica | VT1000 | |
| Vimentin | Abcam | ab8069 | 1차 항체 |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
참고문헌
- Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
- Taube, J. M., et al.
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