우리는 포유동물 세포에서 특정 기질 및 E3 유비퀴틴 리가아제의 유비퀴틸화 검정을 위한 상세한 프로토콜을 제공한다. HEK293T 세포주는 단백질 과발현을 위해 사용되었고, 폴리유비퀴틸화된 기질은 면역침전에 의해 세포 용해물로부터 정제되고, SDS-PAGE에서 분해되었다. 면역블롯팅은 이러한 번역 후 변형을 시각화하기 위해 사용되었다.
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방법 논문
포유동물 세포 용해물에서 E3 유비퀴틴-리가아제에 의한 기질 유비퀴틸화의 평가
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
유비퀴틸화는 진핵 세포에서 발생하는 번역 후 변형으로, 세포 생존, 증식 및 분화를 포함한 여러 생물학적 경로의 조절에 중요합니다. E1 (유비퀴틴 활성화 효소), E2 (유비퀴틴 접합 효소) 및 E3 (유비퀴틴 리가아제 효소)로 구성된 적어도 3 가지 효소의 캐스케이드 반응을 통해 기질에 유비퀴틴을 공유적으로 부착하는 가역적 인 과정입니다. E3 복합체는 기질 인식 및 유비퀴틸화에 중요한 역할을 한다. 여기서, 선택된 기질을 코딩하는 플라스미드, E3 유비퀴틴 리가아제, 및 태그된 유비퀴틴의 일시적 공동형질감염을 사용하여 포유동물 세포에서 기질 유비퀴틸화를 평가하기 위한 프로토콜이 기재되어 있다. 용해 전에, 형질감염된 세포는 기질 프로테아좀 분해를 피하기 위해 프로테아좀 억제제 MG132 (카르보벤즈옥시-류-류-류알)로 처리된다. 또한, 세포 추출물은 유비퀴틴 태그에 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅(WB)에 의한 후속 검출을 위해 폴리유비퀴틸화된 기질을 정제하기 위해 소규모 면역침전(IP)에 제출된다. 따라서, 포유동물 세포에서 유비퀴틸화 분석을 위한 일관되고 복잡하지 않은 프로토콜이 과학자들이 특정 기질 및 E3 유비퀴틴 리가아제의 유비퀴틸화를 다루는 것을 돕기 위해 기술된다.
서론
번역 후 변형 (PTMs)은 세포 항상성에 필수적인 단백질 조절과 관련된 중요한 메커니즘입니다. 단백질 유비퀴틸화는 진핵 생물에서 여러 가지 세포 결과를 초래하는 다양한 신호의 구색을 생성하는 역동적이고 복잡한 변형입니다. 유비퀴틸화는 76개의 아미노산을 함유하는 유비퀴틴 단백질을 기질에 부착시키는 것으로 이루어진 가역적 과정으로, 세 가지 별개의 반응으로 구성된 효소적 캐스케이드에서 발생한다1. 첫 번째 단계는 유비퀴틴 활성화를 특징으로 하는데, 이는 E1 효소의 활성 부위에 존재하는 유비퀴틴 C 말단과 시스테인 잔기 사이에 고에너지 티오에스테르 결합 유비퀴틴을 형성하기 위해 ATP 가수분해에 의존한다. 이어서, 유비퀴틴은 E2 효소로 전달되어 유비퀴틴과 티오에스테르-유사 복합체를 형성한다. 그 후, 유비퀴틴은 E2에 의해 기질에 공유적으로 부착되거나, 또는 더 자주, 기질 2,3을 인식하고 상호작용하는 E3 효소에 의해 공유된다. 때때로, E4 효소 (유비퀴틴 사슬 신장 인자)는 다중 유비퀴틴 사슬 조립을 촉진하기 위해필요하다 3.
유비퀴틴은 7개의 ....
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프로토콜
참고: 포유동물 세포에서 유비퀴틸화 분석 프로토콜의 개요는 도 1에 표시되어 있다.
그림 1. 유비퀴틸화 분석 절차의 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
1. 세포 배양
- HEK293T 세포주를 100mm TC 처리 배양 접시에서 성장 배지에서 80%-90% 합류로 성장시킨다(둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 고포도당 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 페니실린(100 단위), 스트렙토마이신(100 μg) 및 L-글루타민(0.292 mg/....
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결과
UXT (유비쿼터스하게 발현된 전사체)는 마우스와 심장, 뇌, 골격근, 태반, 췌장, 신장 및 간과 같은 인간 조직에서 유비쿼터스하게 발현된 단백질-폴딩 복합체를 형성하는 프리폴딘 유사 단백질이다18. UXT-V1 및 UXT-V2로 명명된 UXT의 두 스플라이싱 이소형이 별개의 기능과 세포하 위치를 수행하는 것으로 설명되었다. UXT-V1은 주로 세포질 및 미토콘드리아 내부에 국소화되며, TNF-α-유도된 아폽토시스 및 항바이러스 신호전달 형성19,20에 연루된다. 대부분의 연구는 주로 핵에 국소화되어 있으며 세포 증식 조절, 분화 및 염증 경로에 관여하는 다중 전사 인자의 보조 인자로 작용하는 UXT-V2에 중점을 두었습니다. UXT-V2는 NF-κB 강화(21)에서 필수적인 코액티베이터로서 작용하는 NF-κB 신호전달 경로에 관여한다. .......
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토론
유비퀴틸화는 여러 단백질의 수준을 조절하고 많은 신호 전달 경로와 생물학적 과정에서 중요한 역할을하여 건강한 세포 내 환경을 보장하는 번역 후 필수적인 변형입니다. 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(UPS)은 최근 제약 연구의 주요 초점 중 하나로서, 종양 억제제를 안정화시키거나 종양원성 생성물(22)의 분해를 유도할 수 있는 가능성을 제공한다. 예를 들어, 다발성 골수종 (MM)에서 모노클로날 면역글로불린 분비를 담당하는 혈장 세포 신생물의 비정상적인 증식은 소포체 (ER)23에서 잘못 접히거나 펼쳐진 단백질 축적으로 인한 병리생리학적 경로를 촉진한다. 이 ER 스트레스가 발생하면 유비퀴틴 - 프로테아 좀 시스템의 활성화를 포함한 여러 프로세스를 활성화합니다. 다발성 골수종 치료를 위해 단백질 축적 및 그에 따른 세포 사멸을 유도하기 위해 프로테아좀 억제제 (보르테조맙, 카르필조미브 및 ixazomib)의 사용은 고위험 환자
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
감사의 글
F.R.T는 FAPESP 보조금 번호 2020/15771-6 및 CNPq 유니버설 405836/2018-0에서 지원됩니다. P.M.S.P 및 V.S는 CAPES에서 지원됩니다. C.R.S.T.B.C는 FAPESP 장학금 번호 2019/23466-1의 지원을 받았습니다. 재료 지원에 대한 Sandra R. C. Maruyama (FAPESP 2016/20258-0)에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 마이크로튜브 | Axygen | PMI110-06A | |
| 100 mm TC 처리 배양 접시 | Corning | 430167 | |
| 15 mL 튜브 | Corning | 430766 | |
| 96웰 플레이트 | Cralplast | 655111 | |
| Agarose-anti-HA 비드 | Sigma-Aldrich | E6779 | |
| 안티 마우스 항체 | Seracare | 5220-0341 | 염소 항-마우스 IgG |
| 안티 토끼 항체 | Seracare | 5220-0337 | 염소 항-토끼 IgG |
| 안티-액틴 항체 | Sigma-Aldrich | A3853 | 희석 사용: 1:2000 |
| Anti-Fbxo7 항체 | Sigma-Aldrich | SAB1407251 | 희석 사용: 1:1000 |
| Anti-HA 항체 | Sigma-Aldrich | H3663 | 희석 사용: 1:1000 |
| Anti-Myc 항체 | Cell Signalling | 2272 | 희석 사용: 1:1000 |
| Bradford 시약 | Sigma-Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-100G | 소 혈청 알부민 |
| 세포 인큐베이터 | Nuaire | NU-4850 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | 500 x g 5분 동안 |
| ChemiDoc | BioRad | ||
| 디지털 pH 측정기 | Kasvi | K39-2014B | |
| Dulbecco' 의 변형된 독수리' s 매체 | Corning | 10-017-CRV | 고포도 |
| 태아 소 혈청 | Gibco | F4135 | 여과액 사전 사용 |
| HA 펩타이드 | Sigma-Aldrich | I2149 | |
| HEK293T 세포 | ATCC | CRL-3216 | |
| Hepes | Gibco | 15630080 | |
| KCl VWR | 생명 과학 | 0365-500G | |
| Kline rotator | Global Trade Technology | GT-2OIBD | |
| MG-132 | Boston Biochem | I-130 | |
| 마이크로 원심분리기 | Eppendorf | 5418R | |
| Na3VO4 (Ortovanadato) | |||
| NaF | |||
| 니트로셀룰로오스 블로팅 멤브레인 | GE Healthcare | ||
| 10600016 NP40 (IGEPAL CA-630) | Sigma-Aldrich | I8896-100ML | |
| 광학 현미경 | OPTIKA 현미경 | SN510768 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | V79020 | 포유류 표현용 |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7 | Marcelo Damá 박사가 친절하게 기부했습니다. rio | 태그 2xFlag(N-터미널). 제한 효소: EcoRI 및 XhoI | |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-Δ F-박스 | Marcelo Damá 박사가 친절하게 기부했습니다. rio | 태그 2xFlag(N-터미널). 제한 효소: EcoRI 및 XhoI. &델타; 335-367 | |
| pcDNA3-UXTV2-HA& | nbsp; Marcelo Damá 박사가 친절하게 기부했습니다. rio | Tag HA(C 터미널). 제한 효소: EcoRI 및 XhoI | |
| pCMV-6xHis-Myc-유비퀴틴 | Marcelo Damá 박사가 친절하게 기부했습니다. rio | 태그 6x-His-Myc(N-터미널). 제한 효소: EcoRI 및 KpnI | |
| 펜 연쇄상구균 글루타민 100x | Gibco | 10378-016 | |
| 인산염 완충 식염수 10x | AccuGENE | 51226 | 1x PBS를 얻으려면 10x PBS를 초순수 |
| 폴리에틸렌이민(PEI) | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | |
| Ponceau S | VWR Life Science | 0860-50G | |
| 프로테아제 억제제 칵테일 SIGMAFAST | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| 흔들 셰이커 | Kasvi | 19010005 | |
| SDS-PAGE 시스템 | BioRad | 165-8004 | |
| 솔루션 균질화 Phoenix | Luferco | AP-22 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| 트립신(TrypLe Express) | Gibco | 12605-028 | |
| 웨스턴 블로팅 루미놀 시약 | 산타크루즈 생명공학 | SC-2048 |
참고문헌
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
- Callis, J. The ubiquitination machinery of the ubiquitin system. The Arabidopsis Book. 12, 0174(2014).
- Koegl, M., et al. <....
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