제브라피쉬 각막 상처 치유: 마모에서 상처 폐쇄 영상 분석까지

요약

이 프로토콜은 세포 수준에서 후속 상처 폐쇄를 평가하기 위해 마모를 통해 제브라 피쉬의 안구 표면을 손상시키는 데 중점을 둡니다. 이 접근법은 안구 버를 이용하여 각막 상피를 부분적으로 제거하고 주사 전자 현미경을 사용하여 상처 폐쇄 중 세포 형태의 변화를 추적합니다.

초록

눈의 투명한 표면으로서 각막은 맑은 시력을 위해 도움이됩니다. 그것의 위치 때문에,이 조직은 환경 모욕을 받기 쉽습니다. 사실, 임상적으로 가장 자주 발생하는 눈 부상은 각막에 대한 부상입니다. 각막 상처 치유는 작은 포유류 (즉, 생쥐, 쥐 및 토끼)에서 광범위하게 연구되었지만 각막 생리학 연구는 제브라 피쉬가 고전적인 연구 모델임에도 불구하고 제브라 피쉬를 포함한 다른 종을 무시했습니다.

이 보고서는 제브라 피쉬에서 각막 찰과상을 수행하는 방법을 설명합니다. 상처는 안구 버를 사용하여 마취 된 물고기에서 생체 내에서 수행됩니다. 이 방법은 재현 가능한 상피 상처를 허용하여 나머지 눈을 그대로 유지합니다. 찰과상 후, 상처 폐쇄는 3 시간 동안 모니터링되고, 그 후에 상처는 재상피화됩니다. 주사 전자 현미경을 사용하여, 화상 처리, 상피 세포 형상, 및 정점 돌출부를 조사하여 각막 상피 상처 폐쇄 동안 다양한 단계를 연구할 수 있다.

제브라 피쉬 모델의 특성은 조직이 도전받을 때 상피 조직 생리학 및 상피 세포의 집단 행동에 대한 연구를 허용합니다. 또한, 눈물막의 영향을 박탈당한 모델을 사용하면 스트레스에 대한 각막 반응에 관한 새로운 해답을 얻을 수 있습니다. 마지막으로, 이 모델은 또한 물리적 상처를 입은 임의의 상피 조직에 관여하는 세포 및 분자 사건의 묘사를 허용한다. 이 방법은 전임상 시험에서 약물 효과의 평가에 적용될 수 있다.

서론

대부분의 상피는 외부 환경과 접촉하기 때문에 신체적 상해가 발생하기 쉽기 때문에 상처 치유 과정 연구에 매우 적합합니다. 잘 연구 된 조직 중에서 각막은 상처 치유의 세포 및 분자 측면을 조사하는 데 매우 유용한 모델입니다. 투명한 외부 표면으로서, 그것은 눈에 물리적 보호를 제공하고 망막에 빛을 집중시키는 첫 번째 요소입니다. 망막의 구조와 세포 구성은 종¹에 따라 다르지만, 각막의 이러한 요소는 종에 관계없이 모든 카메라 형 눈에서 일반적으로 유사합니다.

각막은 세 개의 주요 층²로 구성되어 있습니다. 첫 번째와 가장 바깥 쪽 층은 상피이며, 상피는 투명성을 보장하기 위해 끊임없이 갱신됩니다. 두 번째 층은 엄격하게 조직 된 콜라겐 섬유의 두꺼운 층 내에 각질 세포라고 불리는 흩어져있는 세포를 포함하는 스트로마입니다. 세 번째이자 가장 안쪽에있는 층은 내피이며, 이는 영양소와 액체가 전방 챔버에서 바깥 층으로 확산 될 수있게합니다. 상피 및 기질 세포는 성장 인자 및 사이토카인을 통해 상호작용한다³. 이러한 상호작용은 상피 손상 후 각질세포의 신속한 아폽토시스 및 후속 증식에 의해 강조된다

프로토콜

모든 실험은 국가 동물 실험위원회에 의해 승인되었다.

1. 준비

1. 마취²⁶ 에 사용되는 트리카인 원액을 미리 준비하십시오 (이 프로토콜에 사용 된 0.4 % 원액). 가능한 한 장갑을 착용하고 재료를 흄 후드에 보관하십시오.
   1. 0.4% 용액 50 mL의 경우, 트리카인 분말 200 mg을 50 mL 튜브에 넣었다. 분말을 약 45 mL의 이중 증류수에 녹인다.
   2. 트리카인 원액의 pH를 1 M 트리스(pH 8.8, ∼1.25 mL)로 7로 조정하였다. 분취량의 트리카인 스톡에 트리스 용액을 첨가하고, 각 분취량 후에 스톡을 완전히 혼합하고, 트리스를 첨가 할 때마다 pH를 확인하십시오.
2. 실험 전에 트리카인의 0.02 % 작업 용액을 준비하십시오.
   1. 0.4% 원액 2 mL를 해동하고 시스템 물 40 mL(최종 농도 0.02%)를 첨가한다. 용액을 작은 용기에 넣으십시오.
3. 실험 전에, 진통제를 함유하는 회수수를 준비한다. 가능한 경우 장갑을 착용하고 재료를 흄 후드에 보관하십시오.
   1. 회수 물 한 리터의 경우, 리도카인 염산염....

결과

본 연구는 제브라피쉬 각막 상처 치유 실험에서 안과 버를 사용하는 방법을 설명한다. 이 방법은 마우스에 대한 이전의 연구로부터 변형되었으며, 여기서 버는 상피 세포층을 효율적으로 제거하는 것으로 나타났다¹³. 제브라피쉬 각막 상처의 문제점은 눈의 비교적 작은 크기를 포함하며, 시간이 많이 걸리는 실험의 경우, 아가미를 통한 일정한 물 흐름을 유지할 필요가 있습니다 (Xu 및 동료²⁸에 의해 설명 된대로). 이 방법의 주요 이점은 단순성과 속도입니다. 표준 해부 현미경은 버의 제어된 사용을 위해 사용됩니다(그림 1). 절차가 짧은 기간 (마취 시작일로부터 약 3 분)이기 때문에 물고기는 취급에서 잘 회복되며 마취 및 산소 전달의 유지 보수를 위해 추가 장비가 필요하지 않습니다.

각막 상처를 시각화하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 이 프로토콜.......

토론

각막 신체 상해는 안과 환자가 병원을 방문하는 가장 흔한 원인입니다. 따라서 각막 병리 생리학의 다양한 측면에 대한 연구를위한 관련 모델을 수립하는 것이 중요합니다. 지금까지, 마우스는 각막 상처 치유의 연구에 가장 일반적으로 사용되는 모델이다. 그러나 각막 상처 치유에 대한 특정 약물의 영향을 검증하기 위해 뮤린 상처 입은 눈에 점안액을 추가하는 것은 어려울 수 있습니다. 이러한 점에서, 제브라피쉬 모델은 각막 상처 치유에 영향을 미치는 분자의 약리학적 스크리닝에 특히 유용하다. 여기에 설명된 방법은 마우스(¹³)에 대해 설명된 것과 매우 유사하다.

그러나 두 가지 구체적인 차이점을 염두에 두어야합니다. 첫째, 안과 용 버를 사용하려면 상처 재현성을 보장하기위한 연습이 필요하며, 특히 눈에 가해지는 압력과 관련하여 적절한 마모에 중요합니다. 또한, 연마 팁은 상피가 더 이상 효율적으로 제거되지 않을 때 변경되어야합니다. 둘째, 제브라피.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.1M Na-PO4 (인산나트륨 완충액), pH 7.4	사내		용액은 1M NaH2 HPO4 에서 제조되며, 1M NaH2 PO4 )로 pH 7.4로 조정됩니다.
0.2M Na-PO 4 < / sub> (인산 나트륨 완충액), pH 7.4	사내		용액은 1M 인산 나트륨 완충액 (1M Na2 < / sub>HPO4 < / sub>에서 제조되며, 1M NaH 2 < / sub>PO 4 < / sub>)로 pH 7.4로 조정됩니다.
0.5mm 버 팁	Alger Equipment Company	BU-5S
1M Tris, pH 8.8	사내
접착 탭	Agar Scientific	G3347N
Algerbrush 버, 전체 기기	Alger Equipment Company	BR2-5
코튼 스왑	Heinz Herenz 함부르크	1030128
해부 플레이트	사내
해부 도구	Fine Science Tools
사내			증류수
Eppedorf 튜브, 2ml	모든 공급자
에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트 염	시그마	A5040	주의: 자극을 일으킵니다.
글루타르알데히드, 50% 수용액, 등급 I	시그마	G7651	주의: 독성.
리도카인 염산염	시그마	L5647	주의: 독성이 있습니다.
마운트	Agar Scientific	G301P
페트리 접시	Thermo Scientific	101VR20
pH 지시기 스트립	Macherey-Nagel	92110
플라스틱 스푼	모든 공급업체
플라스틱 튜브, 15ml	Greiner Bio-One	188271
플라스틱 튜브, 50ml	Greiner Bio-One	227261
주사 전자 현미경	FEI	Quanta 250 FEG
소프트 스폰지	모든 공급 업체
Sputter coater	Quorum Technologies	GQ150TS
Stereomicroscope	Leica

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