방법 논문

염소 스티플 관절의 슬개골 하 지방 패드에서 중간엽 줄기 세포의 분리, 확장 및 분화

DOI:

10.3791/63617

⸱

2022년 8월 2일

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology-Kanpur, 2The Mehta Family Centre for Engineering in Medicine, Indian Institute of Technology-Kanpur, 3Mechanobiology Institute, National University of Singapore

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

슬개골 지방 패드 중간엽 줄기세포(IFP-MSC)는 무릎 관절의 슬개골하 지방 패드에서 쉽게 분리할 수 있습니다. 그들은 시험관 내에서 잘 증식하고 CFU-F 콜로니를 형성하며 지방 형성, 연골 형성 및 골 형성 계통으로 분화합니다. 본원에서, 염소 스티플 조인트로부터 IFP-MSC의 분리, 확장 및 분화를 위한 방법론이 제공된다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

무릎 관절에 존재하는 IFP는 MSC의 유망한 공급원 역할을합니다. IFP는 관절경 시술 및 무릎 교체 수술 중에 일상적으로 절제되고 폐기되기 때문에 쉽게 접근할 수 있는 조직입니다. 또한, 그 제거는 최소 기증자 부위 이환율과 관련이 있습니다. 최근 연구에 따르면 IFP-MSC는 시험관 내 확장 중에 증식 능력을 잃지 않으며 연령 독립적 인 골 형성 분화 잠재력을 가지고 있음이 입증되었습니다. IFP-MSC는 골수 유래 중간엽줄기세포(BMSC) 및 지방유래 줄기세포(ADSC)에 비해 우수한 연골성 분화 잠재력을 가지고 있습니다. 이러한 세포는 노화되고 병에 걸린 환자에게서 쉽게 얻을 수 있지만 그 효과는 제한적입니다. 따라서 건강한 기증자의 IFP-MSC를 사용하는 것은 생물 의학 응용 분야에서 효능을 결정하는 데 중요합니다. 건강한 인간 기증자에 대한 접근이 어렵 기 때문에 동물 모델은 근본적인 이해를 가능하게하는 더 나은 대안이 될 수 있습니다. 개, 말, 양, 염소와 같은 큰 동물은 중개 연구에서 중요한 역할을 합니다. 이 중 염소의 질식 관절이 인간의 무릎 관절에 가장 가까운 해부학을 가지고 있기 때문에 염소가 선호되는 모델이 될 수 있습니다. 또한 goat-IFP는 조직 재생 응용 분야에 필요한 더 높은 MSC 수치를 충족할 수 있습니다. 또한 저렴한 비용, 가용성 및 동물 연구를 위한 3R 원칙 준수로 인해 매력적인 모델입니다. 이 연구는 IFP-MSC를 염소의 질식 관절과 확장 및 분화를 위한 시험관 내 배양 조건에서 분리하기 위한 간단한 프로토콜을 보여줍니다. 염소로부터 무균적으로 단리된 IFP를 세척하고, 다지고, 효소적으로 소화시켰다. 여과 및 원심분리 후, 수집된 세포를 배양하였다. 이 세포는 부착되었고 MSC와 유사한 형태를 가지고 있으며 놀라운 클론 생성 능력을 보여주었습니다. 또한, 그들은 지방 형성, 연골 형성 및 골 형성 계통으로 분화하여 다분화능을 입증했습니다. 결론적으로이 연구는 조직 공학 및 재생 의학 응용 분야에서 잠재력을 보여주는 MSC의 분리 및 확장을 보여줍니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

중간엽 줄기세포(MSC)는 재생 의학 1,2에서 세포 기반 요법의 매력적인 후보입니다. 골수, 탯줄, 태반, 치수 및 피하 지방 조직과 같은 다양한 조직 공급원에서 수확 할 수 있습니다3. 그러나 성인에서 줄기 세포의 가용성이 제한적이고 분리 절차가 종종 침습적이기 때문에 (기증자 부위 이환율을 초래) 이러한 문제를 피할 수있는 대체 줄기 세포 공급원을 갖는 것이 바람직합니다.

무릎 관절은 슬개하부 지방 패드 유래 MSC, 활막 유래 MSC, 활액 유래 MSC, 인대 섬유아세포, 관절 연골세포 등다양한 세포 유형의 저장소입니다. 이 세포는 근골격계 조직 공학 기반 연구에서 널리 탐구 될 가능성이 있습니다. 따라서 무릎 관절은 여러 유형의 MSC의 가능하고 신뢰할 수있는 공급원이 될 수 있습니다. 슬개골 하 지방 패드 (IFP) 또는 Hoffa의 지방 패드로 알려진 무릎 관절에 위치한 지방 저장소는 MSC 저장소의 유망하고 대안적인 선택입니다. IFP는 무릎 관절경 검사 또는 개복 무릎 수술 중에 수술 폐기물로 일상적으로 절제되고 폐기되기 때문에 비교적 쉽게 접근 할 수 있고 임상 적으로 얻을 수있는 MSC 공급원입니다. IFP의 제거는 최소 기증자 부위 이환율과 관련이 있으며, 이는 또한 매력적인 조직 공급원이됩니다. 유사한 표현형 프로파일을 가지고 있지만, IFP의 MSC (IFP-MSCs)는 골수 유래 중간 엽 줄기 세포 (BM-MSC)와 비교할 때 클론 생성 잠재력이 향상되고 피하 지방 유래 줄기 세포 (ADSC)에 비해 더 나은 증식 능력을 가지고 있습니다 7. 흥미롭게도 활액 유래 MSC (SF-MSC)와 비교하여 IFP-MSC는 늦은 계대에서 증식 능력을 잃지 않으며 늦은 계대에서 배가 시간이 증가하지도 않습니다. 이는 세포 확장 동안, IFP-MSC가 이들의증식 속도(8)를 손상시키지 않으면서 시험관내 조직 공학 응용을 위해 충분히 많은 수의 세포를 달성할 수 있음을 시사한다. 최근 연구에 따르면 IFP-MSC는 골수 유래 MSC (BMSC) 및 지방 유래 MSC (ADSC)에 비해 우수한 연골 생성 분화 잠재력을 가지고 있으며, 이는 아마도 관절 연골에 대한 해부학 적 근접성으로 인해 연골 조직 공학에 대한 적합성을 나타냅니다 6,7,9,10. 또한, 그들은 또한 연령 독립적 인 골 형성 분화 잠재력을 가지고 있습니다11. IFP-MSC의 관절 내 주사는 골관절염 (OA) 환자의 통증을 줄이고 무릎 관절 기능을 향상시키는 것으로 나타났습니다12,13. 또한, 병리학 적 조건 동안 염증성 사이토 카인의 존재하에 IFP-MSC의 강력한 면역 억제 반응 및 개선 된 면역 조절 특성이보고되었다6.

IFP-MSC는 MSC의 유망하고 대체 소스입니다. 그러나 조직 공학 및 재생 의학에서의 치료 적 이점은 상대적으로 덜 탐구됩니다. IFP-MSC에 대한 기존 연구는 주로 인간 기증자의 세포를 활용했습니다. 이 중 최근 몇 가지 연구에서는 건강한 인간 기증자 (비 관절염 환자, 17-60 세)의 IFP-MSC를 조사한 반면,14 대부분의 연구에서는 무릎 교체 수술을받는 노인 환자 (질병 환자, 70-80 세)의 IFP-MSC를 사용했습니다. 나이와 질병 모두 줄기 세포의 정상적인 기능을 변화시키는 것으로 알려져 있기 때문에 (수 감소 및 기능적 잠재력 상실), 이는 잠재적으로 MSC 기반 연구 7,15,16,17의 결과에 불일치를 초래할 수 있습니다. 그 외에도 병태생리학적 상태(예: 관절염 및 비만)가 있는 환자의 IFP-MSC를 사용하면 시험관 내에서 건강한 세포의 기본 특성을 이해하는 데 어려움이 있어 중간엽수 기반 치료법 개발에 제한 요소로 작용합니다. 이러한 문제를 극복하기 위해서는 건강한 기증자의 IFP-MSC를 사용하는 것이 중요합니다. 건강한 인간 기증자에 대한 접근이 어렵 기 때문에 동물 모델이 더 나은 대안이 될 수 있습니다. 이와 관련하여 IFP가 마우스18에서 분리 된 몇 가지 연구가 있습니다. 그러나, 정상 마우스에서 지방 패드의 크기가 작기 때문에, 다수의 동물로부터의 지방 조직이 정교한 실험 절차(19)를 실행하기에 충분한 조직을 얻기 위해 결합되었다. 따라서, 더 많은 수의 세포에 대한 요구 사항을 충족시키고 동시에 동물 연구20에서 3R 원칙 (정제, 교체 및 감소)을 준수 할 수있는 대형 동물 모델이 필요합니다. 큰 동물의 사용은 중개 연구에서 중요한 의미를 갖는다. 특히, 근골격계 조직 공학에서는 개, 돼지, 양, 염소 및 말과 같은 다양한 대형 동물이 조사되었습니다21. 염소 (Capra aegagrus hircus)는 질식 관절이 인간의 무릎 관절22,23,24에 가장 가까운 해부학 적 구조를 가지고 있기 때문에 큰 동물의 탁월한 선택입니다. 염소의 연골하 골 섬유주 구조와 연골하 뼈 두께는 인간과 유사하며 연골과 뼈의 비율도 인간에 가까운 것으로 보고됩니다21. 또한 염소는 전 세계적으로 널리 길들여져 골격이 성숙했을 때 쉽게 구할 수 있습니다. 또한 유지 보수 비용이 낮고 취급이 용이하여 연구22에 매력적인 동물 모델이되었습니다.

본 연구에서, Capra aegagrus hircus (염소)의 질식 관절로부터 IFP-MSC를 분리하기위한 간단한 프로토콜과 이들의 확장 및 분화를위한 시험관 내 배양 조건이 입증된다. 분리된 세포는 부착되어 있고, MSC 유사 형태를 가지며, CFU-F(콜로니 형성 단위-섬유아세포) 콜로니를 형성하고, 지방형성, 연골성 및 골형성 분화 잠재력을 가지고 있습니다. 따라서 IFP-MSC는 생물 의학 응용 분야를위한 MSC의 대체 공급원으로서의 잠재력을 보여줍니다.

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프로토콜

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이 프로토콜은 염소에서 IFP-MSC의 분리를 기반으로합니다. 염소 IFP와 혈액은 지역 도축장에서 수집되었습니다. 이러한 조직 수집은 기관 동물 윤리위원회의 범위를 벗어나기 때문에 윤리적 승인이 필요하지 않았습니다.

1. 염소 무릎의 대퇴골 관절에서 IFP-MSC의 분리

  1. 뒷다리의 대퇴 및 경골 부위 각각 ~ 15cm를 포함하는 염소 대퇴골 관절 (샘플)을 수집합니다. 즉시 멸균된 샘플 수집 상자에 샘플을 넣고 추가 처리를 위해 실험실로 운송하기 위해 4°C에 보관하십시오. 절차 전반에 걸쳐 멸균된 수술 도구를 사용하여 생물안전 캐비닛에서 샘플을 무균적으로 처리합니다(그림 1, 1단계).
  2. 샘플을 150mm 페트리 접시에 놓고 오염을 피하기 위해 항생제(5μg/mL 암포테리신 B, 200U/mL 페니실린-스트렙토마이신 및 50μg/mL 시프로플록사신)가 보충된 오토클레이브 인산염 완충 식염수(PBS)로 완전히 헹굽니다. 항상 PBS를 사용하여 샘플이 수화 상태를 유지하는지 확인하십시오.
  3. 샘플의 해부학 적 영역을주의 깊게 검사하십시오. 관절낭에 쉽게 접근할 수 있도록 두 긴 뼈의 여분의 조직이 완전히 제거되었는지 확인하십시오(그림 1, 2단계).
  4. 이를 위해서는 먼저 한 손으로 대퇴골의 끝면을 잡고 날카로운 가위로 관절쪽으로 세로로 자릅니다. 이 과정에서 뼈에서 주변 근육과 지방 조직을 제거하십시오. 즉각적인 관절낭을 둘러싼 조직이 처음에는 방해받지 않도록주의하십시오.
  5. 유사하게, 샘플의 경골 끝에서 다른 절개를하고 경골 뼈에서 근육과 지방 조직을 제거하십시오. 이 단계 후에 긴 뼈가 완전히 노출되고 관절낭이 명확하게 보이는지 확인하십시오(그림 1, 3단계).
  6. 다음으로, 활막의 양쪽에서 절개하여 관절 관절을 잘라냅니다 (그림 1, 4 단계). 멸균 된 가위와 집게의 새로운 배치를 사용하여 활막과 슬개골 인대 모두에서 슬개골을 잘라냅니다. 분리된 슬개골을 PBS가 포함된 페트리 접시에 즉시 보관하십시오(그림 1, 5단계).
  7. 가위와 집게를 사용하여 슬개골 내부 표면에 있는 전체 지방 패드를 제거하고 다른 신선한 페트리 접시에 지방 패드를 수집합니다(그림 1, 6단계). 메스를 사용하여 수집 된 지방 패드를 말하십시오. ~2-3mm의 가능한 가장 작은 지방 조각/세그먼트를 얻기 위해 필요에 따라 다른 수술 도구(예: 가위 또는 수술용 칼날)를 포함합니다.
    참고: 좋은 다지는 세포의 좋은 수율을 얻는 데 중요합니다. 항상 조직에 수분을 공급하고 격리 절차의 어떤 단계에서도 건조시키지 마십시오.
  8. 주걱을 사용하여 다진 조직을 50mL 원심분리 튜브로 옮기고 시험관 믹서에서 15분 동안 실온(RT)에서 항생제가 보충된 PBS로 세척합니다. 세척 단계를 각각 3x, 15 분 반복하십시오.
  9. 효소 소화를 위해 다진 조직 (~ 5g)을 1.5mg / mL 유형 II 콜라게나제 (20mL)를 함유 한 Dulbecco의 변형 독수리 배지 (DMEM 저혈당)에서 배양하고 37 ° C에서 12-16 시간 동안 2 % FBS를 보충합니다.
    알림: 시험관 믹서에서 분당 ~15회전(RPM)으로 분해를 수행합니다.
  10. 소화된 조직을 조심스럽게 흡인하고 세포 여과기(70μm)로 여과하여 소화되지 않은 조직을 제거합니다. 15mL 원심분리 튜브에서 여과액을 150 x g 로 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거하고 적어도 2x DMEM 저혈당으로 펠렛을 세척한다.
    알림: 엎질러지지 않도록 소화된 조직을 여과기에 천천히 붓습니다. 저용량 원심분리 튜브(15mL)를 사용하여 좋은 펠릿을 얻으십시오.
  11. 수득한 세포 펠릿을 후속 단계에서 프로토콜에서 확장 배지로 지칭하는 완전한 DMEM 배지(10% FBS 및 항생제[2.5μg/mL 암포테리신, 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 및 25μg/mL 시프로플록사신]로 보충된 DMEM 저혈당)에 재현탁시킨다.
  12. 세포를 150mm 페트리 접시에 파종하고 5ng/mL 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 및 50μg/mL 2-포스포-L-아스코르브산 삼나트륨 염이 보충된 확장 배지에서 배양합니다. 세포를 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 인큐베이션하여 세포가 부착 및 증식할 수 있도록 한다. 매일 세포의 부착과 성장을 모니터링하십시오.

2. 분리된 세포의 유지 및 확장

  1. 세포가 합류 할 때까지 3 일마다 미디어를 교체하십시오. 배지를 교체할 때마다 신선한 5ng/mL bFGF 및 50μg/mL 2-포스포-L-아스코르브산 삼나트륨 염을 페트리 접시에 직접 추가합니다. 세포가 80%-90% 합류가 된 후 세포를 계대배양합니다.
    참고: 각 매체를 변경하는 동안 준수하지 않는 엔티티를 제거하십시오. 배양 3일 후에 기름 방울이 보이면 PBS 1x로 세포를 씻은 다음 페트리 접시에 새 배지를 추가합니다. 오일 방울이 완전히 제거 될 때까지 각 매체를 교체하기 전에 PBS 세척을 계속하십시오.
  2. 세포의 계대 배양: 페트리 접시에서 확장 배지를 제거하고 세포를 PBS로 1x 세척합니다. 4mL의 0.25% 트립신/EDTA를 접시에 넣고 세포를 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 4분 동안 배양합니다.
    알림: 컨플루언시(80%-90%)는 7일 이내에 달성됩니다. 트립신화 동안 트립신/EDTA 용액을 페트리 접시의 전체 표면에 균일하게 분배합니다.
  3. 측면의 플레이트를 두드리고 현미경으로 관찰하여 모든 세포가 분리되었는지 확인하여 세포를 제거합니다. 동일한 부피(4mL)의 확장 배지를 추가한 후 트립신을 중화합니다.
  4. 새로운 15mL 폴리프로필렌 튜브에서 피펫을 사용하여 해리된 세포를 수집하고 RT에서 5분 동안 150 x g 에서 원심분리합니다. 상청액을 버리고 펠릿을 원하는 부피의 팽창 배지에 재현탁합니다.
  5. 추가 확장을 위해 1 x 104 cells/cm2 의 파종 밀도로 150mm 페트리 접시에서 표준 세포 계수 방법 및 계대 배양을 사용하여 세포를 계수합니다. 모든 분석에 대해, 계대 번호 P2-P5의 세포의 합류 단층을 사용하십시오.
    알림: 여분의 셀을 냉동 보존하십시오.

3. 콜로니 형성 분석법(CFU-F)을 이용한 IFP-MSC의 클론 생성 능력 평가

  1. CFU-F 분석의 경우, 50-100 cells/cm2의 파종 밀도로 6-웰 조직 배양 플레이트의 확장 배지에 세포를 시드합니다. 배지를 추가하여 최종 부피 3mL를 얻습니다.
    참고: 분석 및 치료를 위해 세포 농도를 최적화합니다.
  2. 세포를 표준 배양 조건 하에 5% CO2 배양기에서 37°C에서12 일 동안 배양하여 세포가 콜로니를 형성할 수 있도록 하였다. 3 일마다 미디어를 교체하십시오. 미디어를 교체하는 동안 부드럽게 행동하십시오.
  3. 12일 후, 콜로니를 PBS로 1x 헹구고 RT에서 20분 동안 20% 메탄올을 사용하여 고정합니다. RT에서 20분 동안 크리스탈 바이올렛 염료(20% 메탄올 중 0.5%[w/v])로 콜로니를 염색합니다. 도립 현미경을 사용하여 개별 콜로니를 계산합니다.
    참고: 콜로니는 50개 이상의 세포로 구성된 클러스터로 정의됩니다.

4. IFP-MSC의 차별화 가능성

  1. IFP-MSC의 지방형성 분화 유도
    1. 지방 생성을 유도하기 위해, 24-웰 조직 배양 플레이트에서 25 x 103 cells/cm2 의 밀도로 세포를 시드한다. 배지를 추가하여 500 μL의 최종 부피를 얻는다. 세포를 5%CO2 배양기에서 37°C에서 배양한다.
    2. 컨플루언시 후 1일 후, 팽창 배지를 500μL의 지방생성 분화 배지로 교체합니다. 세포가 합류하는 데 약 2 일이 걸립니다.
    3. 확장 배지(DMEM + 10% FBS + 2.5μg/mL 암포테리신, 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 및 25μg/mL 시프로플록사신)에 25mM D(+)-포도당, 10μg/mL 인슐린, 1μM 덱사메타손 및 100μM 인도메타신을 보충하여 지방생성 분화 배지를 준비합니다.
      참고: 분화 매체는 1개월 후 4°C에서 불안정합니다. 따라서 필요에 따라 미디어를 준비하십시오.
    4. 25 mM D(+) 글루코스가 보충된 확장 배지에서 배양된 세포를 유도되지 않은 대조군으로 간주한다. 14일 동안 3일마다 미디어를 교체합니다. 14일이 끝날 때, 세포를 PBS로 1x 세척한다. 4°C에서 15분 동안 중성 완충 포르말린(NBF; PBS 중 4% 포름알데히드)을 사용하여 세포를 고정합니다.
    5. 고정 후, 증류수로 웰을 1x 세척 한 다음 RT에서 5 분 동안 60 % 이소프로판올로 세포를 배양한다. 이소프로판올을 제거한 후, 세포를 RT에서 5분 동안 Oil Red O 염료의 작업 용액 500μL로 인큐베이션하여 지질 방울을 염색합니다. 웰을 증류수로 1x 세척하여 결합되지 않은 염료를 제거하고 도립 현미경을 사용하여 세포를 이미지화합니다.
      알림: 300 % 이소프로판올 100mL에 99mg의 ORO를 용해시켜 오일 레드 O (ORO)의 저장 용액을 준비하십시오. 작업 용액을 준비하려면 스톡 ORO 3 부와 증류수 2 부를 혼합하고 RT에서 10 분 동안 혼합하십시오. 0.2 μm 여과지를 사용하여 혼합물을 여과한다. 작업 솔루션을 사용할 준비가되었습니다. 저장 용액은 어둠 속에서 1 개월 동안 RT에서 준비하고 보관할 수있는 반면, 작업 용액은 매번 사용 / 염색 전에 새로 준비해야합니다.
  2. IFP 중간엽의 연골 분화 유도
    1. 염소 혈장의 분리 :
      1. 증류수에 3.4%(w/v) 나트륨-구연산염을 준비합니다. 준비된 시트르산 나트륨 용액 5mL를 50mL 원심분리 튜브에 추가합니다.
      2. 같은 튜브에서 갓 분리 된 염소 혈액 45mL를 수집합니다. 즉시 튜브를 기울여 혈액을 구연산나트륨과 완전히 혼합하여 응고를 방지하고 4°C의 실험실로 운반합니다.
      3. 수집된 염소 혈액을 1000 x g 에서 4°C에서 20분 동안 원심분리합니다. 상청액(혈장)을 생물안전 캐비닛 내부의 새 튜브로 옮깁니다. 0.2 μm 필터, 분취량을 통해 플라즈마를 여과하고, 추가 사용을 위해 -20°C에서 보관한다.
        알림: 샘플을 취급하는 동안 2-8 °C의 온도를 유지하십시오. 플라즈마의 동결-해동 주기를 최소화하는 것이 중요합니다.
    2. 확장된 세포를 80%-90% 컨플루언시로 배양하고, 트립신/EDTA 용액을 사용하여 세포를 해리하고, 15mL 원심분리 튜브에서 5분 동안 150 x g 에서 세포를 펠릿 다운합니다. 펠렛을 염소 혈장 50 μL 당 2 x 106 세포의 밀도로 염소 혈장 중에 재현탁시킨다.
    3. 멸균된 90mm 페트리 접시에 혈장 함유 세포(50μL) 한 방울을 추가한 다음 최종 농도 0.3%(w/v)로 염화칼슘을 추가합니다. 잘 섞어 가교 플라즈마 하이드로젤을 제작합니다.
    4. 제작된 하이드로겔을 37°C에서 40분 동안 배양한다. 배양 후, 하이드로겔을 연골성 배지를 함유하는 24웰 조직 배양 플레이트로 옮긴다.
    5. DMEM 저혈당에 10mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES), 1.25mg/mL 소 혈청알부민(BSA), 1mM 프롤린, 50μg/mL 2-포스포-L-아스코르브산 삼나트륨염, 100nM 덱사메타손, 1x 인슐린, 트랜스페린, 아셀렌산나트륨+리놀레산-BSA(ITS+1), 항생제(2.5μg/mL 암포테리신, 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 및 25μg/mL 시프로플록사신), 및 10 ng / mL 형질 전환 성장 인자 -β1 (TGF-β1).
    6. TGF-β1이 없는 완전한 DMEM 배지(10% FBS 및 항생제[2.5μg/mL 암포테리신, 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 및 25μg/mL 시프로플록사신]가 포함된 DMEM 저혈당)에서 배양된 하이드로겔은 유도되지 않은 대조군으로 간주됩니다. 14일 동안 3일마다 미디어를 교체합니다.
    7. 혈장 하이드로겔에서 세포의 연골성 분화 14일 후, 하이드로겔을 PBS 3x로 각각 5분 동안 세척한 다음, 샘플을 NBF에 3시간 동안 고정시켰다.
      주의 : 포름 알데히드는 잠재적 인 발암 물질이며 흡입시 코, 목 및 폐에 자극을 줄 수 있습니다. 흄 후드에서 포름 알데히드와 관련된 모든 절차를 수행하십시오.
    8. NBF를 제거하고, 하이드로겔을 PBS 3x로 각각 5분 동안 세척한 다음, 용액이 샘플에 완전히 흡수되도록 밤새 RT에서 35%(w/v) 슈크로스에서 배양합니다. 하이드로겔을 최적 절단 온도(OCT) 화합물에서 3시간 동안 순응시킵니다. 액체 질소 하에서 실리콘 몰드를 사용하여 OCT 화합물에 샘플을 내장합니다.
    9. 저온 추출물을 사용하여 젤라틴 코팅 유리 슬라이드에서 10-12 μm 두께로 샘플을 절단하고 향후 사용을 위해 -20 ° C에서 보관하십시오. 연골 분화 후 세포 외 기질의 존재 또는 침착을 검사하려면 황산화 글리코 사 미노 글리 칸에 결합하는 Alcian Blue 및 Safranin-O 염료로 섹션을 염색하십시오.
      참고: 알시안 블루 염료를 준비하려면 알시안 블루 염료 1g을 0.1N HCl 100mL에 녹이고 시험관 믹서에서 밤새 완전히 혼합합니다. 이 솔루션은 어둠 속에서 1 개월 동안 RT에 보관할 수 있습니다. 사프라닌-O 염료를 제조하려면 사프라닌-O 염료 0.1g을 증류수 100mL에 녹이고 시험관 믹서에서 밤새 완전히 혼합합니다.
    10. Alcian Blue 염색의 경우 하이드로겔 섹션을 증류수로 1x 5분 동안 세척합니다. 섹션을 수정하려면 슬라이드에 4% NBF를 추가하고 30분 동안 배양합니다.
    11. 섹션을 증류수로 1x 5 분 동안 씻은 다음 0.1 N HCl로 각각 30 초 동안 2x 세척합니다. HCl을 제거하고 티슈 페이퍼로 슬라이드를 부드럽게 건조시킵니다. 준비된 Alcian Blue 얼룩을 절편에 첨가하고 가습 챔버에서 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
    12. 결합되지 않은 염료를 0.1 N HCl로 세척 한 다음 3 분 동안 증류수로 세척합니다. 절편을 무수 에탄올로 탈수하고 크실렌으로 투명화한 다음 마지막으로 염색된 부분을 이미징을 위해 수지 매체에 장착합니다.
    13. Safranin-O 염색의 경우 하이드로겔 섹션을 증류수 1x로 5분 동안 세척합니다. 섹션을 수정하려면 슬라이드에 4% NBF를 추가하고 30분 동안 배양합니다. 섹션을 증류수로 1x 5 분 동안 씻은 다음 슬라이드를 1 % 아세트산에 10-15 초 동안 담그십시오. 티슈 페이퍼로 슬라이드를 부드럽게 말리십시오.
    14. 준비된 Safranin-O 염료를 절편에 첨가하고 RT에서 10 분 동안 배양합니다. 결합되지 않은 염료를 100 % 에탄올로 세척하십시오. 슬라이드를 100% 에탄올에 5분 동안 담그십시오. 슬라이드를 자연 건조시키고 크실렌으로 투명하게 한 다음 마지막으로 염색된 부분을 이미징을 위해 수지 매체에 장착합니다.
  3. IFP MSC의 골형성 분화 유도
    1. 골형성 분화를 유도하기 위해, 앞서 언급한 바와 같이, 세포를 트립신화한다(단계 2.2.). 세포를 24-웰 조직 배양 플레이트에서 3 x 103 cells/cm2 의 밀도로 시드한다. 배지를 추가하여 500 μL의 최종 부피를 얻는다. 세포를 5%CO2 배양기에서 37°C에서 배양한다. 파종 1일 후, 확장 배지를 500μL 골형성 분화 배지로 교체합니다.
    2. 확장 배지(DMEM + 10% FBS +2.5μg/mL 암포테리신, 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 및 25μg/mL 시프로플록사신)에 25mM D(+)-글루코스, 10nM 덱사메타손, 10mM β-글리세로포스페이트, 50μg/mL 2-포스포-L-아스코르브산 삼나트륨염 및 10nM 비타민 D3를 보충하여 골형성 배지를 준비합니다.
      참고: 25mM D(+) 포도당이 보충된 확장 배지에서 배양된 세포는 유도되지 않은 대조군으로 간주됩니다.
    3. 골 형성 배지를 14 일 또는 28 일 동안 3 일마다 교체하십시오. 14일 후, 알칼리성 포스파타제(ALP) 염색으로 골형성 정도를 측정한다.
      참고: ALP 염색을 위한 기질을 준비하려면 15mL 원심분리 튜브의 증류수 10mL에 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트(BCIP)/니트로블루 테트라졸륨(NBT) 정제 1정을 녹입니다. 정제를 완전히 녹이십시오. 기판 용액을 사용할 준비가되었습니다. 기질 용액은 필요에 따라 더 오래 보관할 수 없으므로 정제를 반으로 나누고 증류수 5mL에 녹입니다. 투과화 완충액을 제조하기 위해, 트리스 완충액 (100 mM) 및 염화마그네슘 (5 mM)을 증류수에 첨가한다. 트리톤 X100 (0.1 %)을 용액에 첨가하고 용해시킨다. 용액의 pH를 9.25-9.75로 조정하십시오.
    4. ALP 염색을 위해, 유도 14일 후, 배지를 제거하고 세포를 PBS로 세척한다. NBF (4 %)를 사용하여 1 분 동안 세포를 고정하십시오. 세포를 PBS로 세척하고 준비된 용해 완충액을 사용하여 2-3분 동안 투과시킨다.
    5. 준비된 기질 용액 500μL를 세포에 첨가하고 발현 수준에 따라 15분 내지 1시간 동안 배양하도록 합니다. 그 사이에 보라색 / 파란색의 발달을 확인하십시오.
    6. 기질 용액을 제거하고 증류수로 세척하십시오. 도립 현미경을 사용하여 염색된 세포를 이미지화합니다.
    7. 28일 후, 알리자린 레드-S 염색에 의한 골형성 유도 후 석회화 정도를 측정한다.
      참고: 알리자린 레드-S 염색 용액(40mM)을 준비하려면 알리자린 레드-S 2g을 증류수 100mL에 녹이고 HCl 또는NH4OH로 pH를 4.1-4.3으로 조정합니다. 0.22μm 멤브레인을 통해 용액을 여과하고 암실에서 4°C에서 보관합니다. 용액의 pH가 중요합니다. 따라서 신선한 용액을 만들거나 1 개월 이상 된 경우 용액의 pH를 다시 측정하는 것이 좋습니다.
    8. 알리자린 레드-S 염색의 경우, 유도 28일 후, 배지를 제거하고 세포를 차가운 PBS로 1x 세척한다. 세포를 70% 에탄올을 사용하여 4°C에서 1시간 동안 고정한다.
    9. 정착액을 제거하고 세포를 증류수로 2x 세척한다. 물을 완전히 제거하고 각 웰에 알리자린 레드-S 용액 1mL를 추가합니다.
    10. RT에서 1 시간 동안 용액으로 세포를 배양하고 도립 현미경을 사용하여 세포를 이미지화합니다.

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

염소의 대퇴골 관절에서 IFP-MSC의 분리
염소의 질식 관절에서 IFP-MSC를 분리하는 단계는 그림 1에 나와 있습니다. 슬개골의 내부 비 관절 표면에 존재하는 지방 패드를 제거하고, 다지고, 효소 적으로 소화시켰다. IFP-MSC를 성공적으로 분리하고 시험관 내에서 배양하였다(도 2A).

IFP-MSC의 확장 및 클론 생성 능력
분리된 세포를 확장 배지에서 시험관내 배양하였다. 세포는 파종 후 12시간 이내에 조직 배양 플레이트에 부착되기 시작했으며 0일째에 대부분 둥근 모양이었습니다. 그들은 플레이트에 균질하게 부착되었고 24시간 이내에 길쭉한 형태를 얻었습니다. 이 형태는 배양 기간 동안 유지되었습니다. 세포는 배양에서 효율적으로 증식했으며 확장 후 6일 이내에 ...

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 프로토콜에서, 염소 IFP로부터 MSC의 단리를 위한 간단하고 신뢰할 수 있으며 재현 가능한 방법이 제공되었다. 이 방법을 사용하여 분리 된 세포는 시험관 내 조직 재생을위한 이전 연구에서 성공적으로 사용되었습니다. 단리된 세포는 증식하고, 다양한 성장 인자에 반응하며, 전기방사 섬유 및 스캐폴드25,26 상에 파종될 때 이들의 생물학적 활성을 유지하는 것으로 관찰되었다. 또한, 시험관 내 관절 연골을 설계하기 위해 주사 가능한 하이드로겔에서 연골세포와 많은 고품질 MSC를 얻고 공동 배양할 수 있는 것으로 관찰되었습니다 27,28,29. 세포의 해부 및 분리 절차는 간단하지만 IFP에서 MSC를 성공적으로 분리하고 확장하기...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SH는 IIT Kanpur의 Institute Post-Doctoral Fellowship 및 DST (SEED Division) (SP / YO / 618 / 2018)의 SYST 보조금의 지원을 인정합니다. AM은 인도 공과 대학-칸푸르 (IIT-Kanpur)를 연구소 펠로우십으로 인정합니다. DSK는 Gireesh Jankinath 석좌 교수직 및 인도 생명 공학과에 자금 지원을 인정합니다 (BT / PR22445 / MED / 32 / 571 / 2016). AM, SH 및 DSK는 IIT-Kanpur의 의학 공학을위한 메타 가족 센터의 관대 한 지원에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
β-글리세로인산Sigma-AldrichG9422-10G10 mM
0.25% Trypsin- 0.02% EDTAHi-MediaTCL049
15-mL 원심분리관Corning
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium saltSigma49752-10G50 µ g/mL
2-프로판올시그마-알드리치I9516
4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES)HiMediaTCL021-50ml10mM
50mL 원심분리관Corning
Alcian BlueHi-MediaRM471sufated gycosaminoglycans 염색용
Alizarin Red SS D Fine-Chem Limited26048-25G칼슘 증착을 위해
암포테리신 BHiMediaA0112.5 &마이크로; g/mL
염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)Sino Biologicals10014-HNAE5 ng/mL
BCIP/NBT ALP 기판시그마B5655-5TABALP 염색용
생물학적 안전 캐비닛
BSAHiMediaMB-083긴 이름: 소 혈청 알부민(1.25 mg/mL)
세포 여과기HiMediaTCP-18270 &마이크로; m
원심분리기REMI
CiprofloxacinRANBAXY LAB. 2.5마이크로B17407T1; g/mL
크리스탈 바이올렛S D Fine-Chem Limited42555
D(+)-글루코스Merck1.94925.052125 mM
덱사메타손시그마-알드리치D29151 &마이크로; M
DMEM LGSIGMAD5523긴 이름: Dulbecco' 의 변형된 독수리' s 미디어 저당
에탄올머크100983
FBSGibco10270긴 이름 : 소 태아 혈청
포름 알데히드 용액 37 % -41 %머크61780805001730
인도 메타신시그마 - 알드리치I7378100 &마이크로; M
인슐린시그마-알드리치I927810 &마이크로; g / mL
도립 현미경Nikon Eclipse TS 100
ITS + 1Sigma-AldrichI2521-5mL긴 이름 : 인슐린, 트랜스페린, 아셀렌산나트륨 + 리놀레산-BSA
L-프롤린HiMediaTO-109-25G1 mM
염화 마그네슘Merck61751605001730용해 완충액
메탄올Meck1.07018.2521
마이크로피펫 및 멸균 팁(20 µ L, 200 &마이크로; L, 1000 &마이크로; L)Thermoscientific
MUSE 세포 분석기Merck Millipore세포 계수
OCT 화합물Tissue-Tek4583긴 이름 : 최적 절삭 온도
오일 레드 O 염료S D Fine-Chem Limited54304지질 액포 염색
용 페니실린-스트렙토 마이신HiMediaA007100 U / mL
페트리 접시 (150mm 및 90mm)NEST
Safranin OS D Fine-ChemLimited 50240sufated gycosaminoglycans 염색
용 구연산Sigma-AldrichC34343.4 % (w/v)
멸균 가위, 겸자 및 메스IFP-MSC
SucroseMerck1.94953.052135 % (w/v)
TGF- &베타; 1Sino Biologicals긴 이름 : 변형 성장 인자 - β 1 (10 ng/mL)
조직 배양 인큐베이터 37 ° C, 5% CO2Thermoscientific
Tris 버퍼Merck61771405001730용해 버퍼
Triton X100S D Fine-Chem Limited40632용해 버퍼
유형 II 콜라겐분해 효소Gibco171010151.5 mg/mL
비타민 D3SigmaC9756-1G10 nM
웰 플레이트(6 -WP 및 24-WP)둥지
염 & 제한나트륨

참고문헌

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