Method Article

말초 신경 공학을 위한 그래핀 기반 3D 바이오하이브리드 하이드로겔 바이오잉크의 준비 및 특성화

DOI:

10.3791/63622

⸱

May 16th, 2022

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1Vocational School of Health Services, Istinye University, 2Chemical Metallurgy Faculty, Yildiz Technical University, 3Faculty of Medicine, Department of Histology & Embryology, Istinye University, 43D Bioprinting Design & Prototyping R&D Center, Istinye University, 5Stem Cell, and Tissue Engineering R&D Center, Istinye University, 6Vocational School of Health Services, Altinbas University, 7The V. Akhundov National Scientific Research Medical Prophylactic Institute, 8Center for Stem Cells and Regenerative Medicine (LivMedCell), Liv Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 원고에서 우리는 말초 조직 공학에 사용하기 위해 그래핀을 함유하는 바이오하이브리드 하이드로겔 바이오잉크의 제조를 시연합니다. 이 3D 바이오 하이브리드 재료를 사용하여 줄기 세포의 신경 분화 프로토콜이 수행됩니다. 이것은 유사한 생체 재료를 클리닉에 가져 오는 중요한 단계가 될 수 있습니다.

Abstract

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말초 신경 병증은 축삭 손상의 결과로 발생할 수 있으며 때로는 탈수 초성 질환으로 인해 발생할 수 있습니다. 말초 신경 손상은 응급 환자의 1.5%-5%에서 발생하는 세계적인 문제이며 상당한 실직으로 이어질 수 있습니다. 오늘날 스캐폴드, 적절한 세포주 및 생체 신호로 구성된 조직 공학 기반 접근 방식은 3차원(3D) 바이오프린팅 기술의 발전으로 더욱 적용 가능해졌습니다. 다양한 하이드로겔 생체 재료와 줄기 세포, 엑소좀 또는 생체 신호 분자의 조합은 말초 신경 재생의 기존 문제를 극복하기 위해 자주 연구되고 있습니다. 따라서, 하이드로겔과 같은 주사 가능한 시스템, 또는 다양한 바이오프린팅 방법에 의해 형성된 이식형 도관 구조의 생산은 말초 신경 공학에서 중요성을 얻고 있다. 정상적인 조건에서 줄기 세포는 신체의 재생 세포이며 개체군을 보호하기 위해 시간이 지남에 따라 수와 기능이 감소하지 않습니다. 이들은 특수 세포는 아니지만 부상에 대한 반응으로 적절한 자극으로 분화 할 수 있습니다. 줄기 세포 시스템은 줄기 세포 틈새 시장이라고 불리는 미세 환경의 영향을 받고 있습니다. 말초 신경 손상, 특히 신경망증에서 이 미세 환경은 절단된 신경 말단을 외과적으로 결합한 후에도 완전히 구출될 수 없습니다. 복합 생체 재료 및 결합 된 세포 치료 접근법은 생분해 성, 생체 적합성 및 가공성과 같은 다양한 특성 측면에서 재료의 기능성과 적용 가능성을 높입니다. 이에 본 연구는 그래핀 기반 바이오하이브리드 하이드로겔 패터닝의 제조 및 용도를 입증하고, 신경 재생에 효과적인 해결책이 될 수 있는 줄기세포의 신경세포로의 분화 효율을 알아보는 것을 목적으로 한다.

Introduction

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유기체와 환경의 내부 구조를 연결하는 메커니즘 인 신경계는 중추 신경계와 말초 신경계의 두 부분으로 나뉩니다. 말초 신경 손상은 응급실에 내원하는 환자의 1.5%-5%를 차지하는 세계적인 문제이며 다양한 외상으로 인해 발생하여 상당한 실직을 초래합니다 1,2,3.

오늘날 말초 신경 공학에 대한 세포 접근법은 큰 관심을 끌고 있습니다. 줄기 세포는 이러한 접근법에 사용되는 세포 중 가장 먼저 나옵니다. 정상적인 조건에서 줄기 세포는 신체의 재생 세포이며 개체군을 보호하기 위해 시간이 지남에 따라 수와 기능이 감소하지 않습니다. 이 세포들은 특수화되어 있지만, 손상에 대한 반응으로 적절한 자극에 의해 분화할 수 있다 4,5. 줄기 세포 가설에 따르면, 줄기 세포 시스템은 줄기 세포 틈새 (stem cell niche)라고 불리는 미세 환경의 영향을받습니다. 줄기세포의 보존과 분화는 세포와 스캐폴드7를 이용한 조직공학을 통해 재구성될 수 있는 미세환경

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Protocol

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1. 와튼젤리 중간엽 줄기세포의 배양

  1. Wharton's jelly mesenchymal stem cells(WJ-MSC, ATCC의 제품)를 -80°C 냉동고에서 꺼냅니다. Yurie et al.20에 기재된 바와 같이, 실온에서 멸균 층류에서 10% 태아 송아지 혈청(FBS), 1% Pen-Strep 및 1% L-글루타민을 함유하는 DMEM-F12 배지에서 WJ-MSC를 배양한다.
  2. 35% FBS, 55% DMEMF-12 및 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 포함하는 동결 배지를 사용하여 일부 세포를 1 x 106 cells /mL로 냉동 보존합니다. 이를 위해 Thoma 세포 카운팅 슬라이드에서 1 x 106 세포를 계수하고 냉동 용액을 적가합니다. 슬라이드를 액체 질소 용기로 빠르게 옮깁니다.
  3. 배양된 세포가 플라스크에서 80% 합류하면 배지를 붓고 5mL의 PBS로 세척합니다. 5mL의 0.25% 트립신과 2.21mM EDTA-4Na를 추가합니다. 37°C의 인큐베이터에서 5분 동안 배양합니다.
  4. 인큐베이터에서 꺼낸 세포에 10% FBS가 포함된 DMEM-F12 배지 10mL를 추가합니다. 잘 매달고 매체....

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Results

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그래핀 독성 및 2D 이미징
얻어진 MTT 결과의 통계분석은 통계분석 소프트웨어에서 Tukey's test를 이용한 one-way ANOVA로 진행하였으며, 얻어진 그래프는 도 2에 나타내었다. 대조군에 비해 그래핀 백분율은 0.001% 그래핀 농도에 대해서만 유의한 감소를 보였다(**p < 0.01). 다른 군과 대조군 사이에는 유의한 차이가 없었다(p > 0.05). 따라서 최적의 그래핀 농도는 0.1%로 측정되었는데, 이는 MTT 테스트 결과 및 스티칭 이미지에 따라 이 농도에 노출된 후 가장 높은 생존율이 관찰되었기 때문이다.

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Discussion

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기존의 2D 방법에 비해 엔지니어링된 3D 스캐폴드로 적용된 처리의 이점은 날이 갈수록 두드러지고 있습니다. 이러한 치료법에 단독으로 사용되거나 생체 적합성 및 생분해성이 낮은 다양한 생체 재료로 생성된 스캐폴드와 함께 사용되는 줄기 세포는 일반적으로 말초 신경 재생에 부적절합니다. 와튼젤리 중간엽 줄기세포(WJ-MSCs)는 특히 획득 프로토콜의 최적화, 증식 능력 및 분화 능력을 고려할 때 적합한 후보 세포주인 것으로 보인다29. 이 연구에서 우리는 2D 및 3D 배양 모두에서 줄기 세포와 그래핀의 상호 작용을 조사했습니다. 또한 생성된 바이오하이브리드 하이드로겔 그룹의 신경성 분화를 2D 환경과 비교했습니다. 우리는 면역염색을 통해 바이오잉크의 신경구 형성을 입증했습니다. 추가 연구에서 우리는 SEM 및 FT/IR 방법으로 신경 채널로 주입 또는 이식할 수 있는 후보 프로토타입을 특성화했습니다. 이 연구는 생산된 생체 재료의 특성, 세포-생체 재료 상호 작용 및 생체 재료의 존재 하.......

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Disclosures

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저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다. 이 프로젝트는 3D 바이오프린팅 기술 개발업체인 HD Bioink와 공동으로 수행되었습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구에 사용된 그래핀은 커클라렐리대학교 기계공학과에서 개발되었다. Karabeyoğlu 박사가 기증했습니다. 그래핀 독성 시험은 TÜBİTAK 2209-B-산업 지향 학부 논문 지원 프로그램의 범위 내에서 완료된 "그래핀 도핑된 바이오잉크를 사용한 3D 바이오프린터에서 중간엽 줄기 세포의 인쇄 및 분화"(출원번호: 1139B411802273)라는 제목의 프로젝트에서 자금을 지원받았습니다. 연구의 다른 부분은 Yildiz Technical University Scientific Research Projects(TSA-2021-4713)에서 제공한 연구 기금의 지원을 받았습니다. 타임랩스 이미징 단계에서 사용된 GFP가 있는 중간엽 줄기 세포는 Virostem Biotechnology에서 기증했습니다. 저자는 생산적인 토론을 해준 Darıcı LAB과 YTU The Cell Culture and Tissue Engineering LAB 팀에 감사드립니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments

원심		분리기 Hitachi세포 배양 및 생체 재료에 사용 단계
0.1N CaCl2HD Bioink교차결합제
0.22 µ에 사용; m 멤브레인 필터Aι 에스&아이오타; mo살균에 사용
0.45 µ m 주사기 필터Aι 에스&아이오타; mo살균에 사용
1.5mL 원뿔 튜브Eppendorfa바이오 잉크 드롭에 사용
15mL 팔콘 튜브둥지세포 배양 단계에 사용
25cm2 세포 배양 플라스크 (Falcon, TPP 조직 배양 플라스크둥지세포 배양에 사용
3D 바이오 프린팅Axolotl Biosystems Bio A2 (터키)바이오프린팅 단계
50mL 팔콘 튜브둥지세포 배양 단계
6/24/48/96 웰 플레이트에 사용 (Falcon, TPP microplates)Merck Millipore세포 배양
단계 75 cm2 세포 배양 플라스크 (Falcon, TPP 조직 배양 플라스크둥지세포 배양에 사용
안티 마우스 IgG-FTIC-rabbitSanta Cruz BiotechnologyJ1514Seconder 항체, 염료
에 사용안티 마우스 IgG-SC2781-goatSanta Cruz BiotechnologyC3109Seconder 항체, 염료에 사용
Au 코팅 장치 EM ACE600LeicaSEM 이미징 전 생체 재료 섹션의 금 도금
AutoclaveNUVE-OT 90L살균 공정에 사용됩니다.
오토클레이브NUVE-OT 90L살균 공정에 사용됩니다.
Cell Cultre CabineHera Safe KS세포 배양 과정에 사용
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12SigmaRNBJ7249세포 배양 배지로 사용
FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEMQuantaFEG 450SEM
Fetal Bovine Serum-FBSCapricornFBS-16A용 세포 배양 배지에 첨가하여 사용하였다.
냉동고 -80° CPanasonicMDF-U5386S-PE세포와 그 결과로 생성된 엑소좀을 저장하는 데 사용되었습니다.
젤라틴-알긴산 바이오잉크 분말HD 바이오잉크된 바이오잉크 단계에 사용
GFP 표지-WJ-MSCsVirostem세포-바이오잉크 상호 작용
그래핀 나노혈소판(Graphene-IGP2)Grafen Chemical Industries Co.생산에 사용 3D-G 바이오 잉크
면역 형광 항체 (N-CAD; β -III Tubulin)세포 신호 및 산타 크루즈염료
JASCO 6600Tetrafor FTIR
MTT 분석시그마생존력 테스트
Penicilin / Streptomycin 용액CapricornPB-S오염을 방지하기 위해 배지에 첨가되었습니다. 세포 배양에서.
Thoma slideIsolab세포 계수에 사용
타임랩스 이미징 시스템Zeiss Axio.Observer.Z1Imaging
Tripsin-EDTAMulticell플라스크는 표면을 덮고 있는 세포를 제거하는 데 사용되었습니다.
VorteksBiobase생산 된 바이오 잉크 단계
WJ-MSCsATCC세포 배양 공정에 사용됩니다.
생산에 대한 이미징에 사용는

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kamasak, B., et al. Peripheral Nerve Injuries and Physiotherapy. Clinical Physiotherapy. 19, Vize Publishing, Istanbul. (2019).
  2. Yegiyants, S., Dayicioglu, D., Kardashian, G., Panthaki, Z. J. Traumatic peripheral nerve injury: A wartime review. Journal of Craniofacial Surgery....

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