광학 핀셋과 디포커싱 현미경을 사용한 적혈구의 점탄성 특성에 대한 정량적 분석

요약

여기에서는 세포의 유변학적 특성을 측정하기 위해 광학 핀셋과 디포커싱 현미경을 기반으로 하는 통합 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 다양한 생리병리학적 조건에서 적혈구의 점탄성 특성을 연구하는 데 광범위하게 적용할 수 있습니다.

초록

적혈구의 점탄성 특성은 다양한 기술에 의해 조사되었습니다. 그러나 보고된 실험 데이터는 다양합니다. 이것은 세포의 정상적인 가변성뿐만 아니라 세포 반응의 방법과 모델의 차이에 기인합니다. 여기서, 광학 핀셋 및 디포커싱 현미경을 사용하는 통합 프로토콜은 1 Hz 내지 35 Hz의 주파수 범위에서 적혈구의 유변학적 특징을 얻기 위해 사용된다. 광학 핀셋은 적혈구 복합 탄성 상수를 측정하는 데 사용되지만, 디포커싱 현미경은 복잡한 탄성 상수를 복잡한 전단 계수로 변환할 수 있는 매개변수인 세포 높이 프로파일, 부피 및 폼 팩터를 얻을 수 있습니다. 또한, 부드러운 유리질 유변학 모델을 적용하면 두 모듈리에 대한 스케일링 지수를 얻을 수 있습니다. 개발 된 방법론은 적혈구의 기계적 거동을 탐구하여 여러 생리 학적 및 병리학 적 조건에 대해 잘 정의 된 실험 조건에서 얻은 점탄성 매개 변수를 특성화 할 수 있습니다.

서론

적혈구라고도 알려진 성숙한 적혈구(RBC)는 인체의 가장 좁은 모세혈관을 통과할 때 크기가 두 배 이상 확장될 수 있습니다¹. 이러한 용량은 외부 하중을 받을 때 변형되는 고유한 능력에 기인합니다.

최근 몇 년 동안, 다른 연구들은 적혈구 표면 ^2,3에서 이 특징을 특징지었다. 외부 하중으로 인한 재료의 탄성 및 점성 반응을 설명하는 물리학 영역을 유변학이라고합니다. 일반적으로 외력이 가해지면 재료의 특성에 따라 변형이 발생하며, 에너지를 저장하는 탄성 변형 또는 에너지를 소산하는 점성 변형으로 나눌 수 있다⁴. 적혈구를 포함한 모든 세포는 점탄성 거동을 나타냅니다. 즉, 에너지는 저장되고 소산됩니다. 따라서 전지의 점탄성 반응은 복소 전단 계수 G*(ω) = G'(ω) + iG"(ω)로 특성화될 수 있으며, 여기서 G'(ω)는 탄성 거동과 관련된 저장 탄성률이고, G"(ω)는 점도와 관련된 손실 계수이다⁴. 더욱이, 현상학적 모델은 세포 반응을 기술하기 위해 사용되어 왔으며, 가장 많이 사용되는 것 중 하나는 하중 주파수에 따른 복잡한 전단 계수의 멱법칙 의존성을 특징으로 하는 연질 유리질 유변학 모델⁵라고 합니다.

단일 셀 기반 방법은 힘을 가하고 부과 된 하중 ^2,3의 함수로 변위를 측정함으로써 적혈구의 점탄성 특성을 특성화하는 데 사용되었습니다. 그러나, 복잡한 전단 계수의 경우, 문헌에서 거의 결과를 찾을 수 없다. 동적 광 산란을 사용하여 RBC 저장 및 손실 계수 값은 1-100Hz⁶의 주파수 범위에서 0.01-1Pa로 변하는 것으로 보고되었습니다. 광학 자기 비틀림 세포분석법을 사용하여 겉보기 복합 탄성률(complex elastic modulus)^{을 얻었으며}7, 비교 목적으로, 불일치를 명확히 하기 위해 곱셈 계수(multiplicative factor)를 주장했다.

보다 최근에, 시간 의존적 하중에 대한 인간 적혈구의 전단 계수의 저장 및 손실을 정량적으로 매핑하는 통합 도구로서 광학 핀셋(OT)과 디포커싱 현미경(DM)을 기반으로 하는 새로운 방법론이 확립되었습니다 ^8,9. 또한, 부드러운 유리질 유변학 모델을 사용하여 결과를 피팅하고 RBC ^8,9를 특징짓는 멱법칙 계수를 얻었습니다.

전반적으로, 개발된 방법론(^8,9)에 대한 프로토콜은 아래에 상세히 기술되어 있으며, RBC 표면의 응력 및 변형에 대한 힘 및 변형을 관련시키는 폼 팩터 _Ff에 대한 측정값을 사용하여 이전의 불일치를 명확히 하고^, 상이한 혈액을 가진 개인으로부터 얻어진 적혈구의 점탄성 파라미터 및 연질 유리질 특징을 정량적으로 결정할 수 있는 새로운 진단 방법으로서 활용될 수 있다 병리학. 아래에 설명된 프로토콜을 사용하는 이러한 특성화는 기계생물학적 관점에서 적혈구의 거동을 이해할 수 있는 새로운 가능성을 열 수 있습니다.

프로토콜

인간 혈액 샘플은 리우데자네이루 연방 대학교 연구 윤리 위원회(프로토콜 2.889.952)에서 승인한 프로토콜에 따라 성인 남녀 지원자가 제공했으며 CAAE 번호 88140418.5.0000.5699로 브라질 플랫폼에 등록되었습니다. 서면 동의서가 모든 자원 봉사자에게 발행되고 수집되었습니다. 혈색소병증이 있거나 통제된 약물을 복용하는 사람은 제외되었습니다. 전체 과정은 연구소의 윤리위원회가 승인 한 지침을 따랐습니다.

1. 시료 홀더 준비

1. 각 샘플 홀더에 대해 2개의 커버슬립(24mm x 60mm 및 24mm x 32mm, 두께 = 0.13-0.17mm)과 1개의 고무 링(직경 = 10mm, 두께 = 2mm)을 획득합니다.
2. 전체 둘레를 덮는 방식으로 고무 링 표면에 실리콘 그리스를 붓습니다.
3. 그리스 면이 커버슬립을 향하도록 고무 링을 커버슬립에 놓습니다. 적절한 부착을 위해 5분 동안 기다리면 샘플 홀더가 세포 배양을 받을 준비가 됩니다.
   참고: 또한 앞서 설명한 대로 상업용 또는 수제 유리 바닥 접시도 사용할 수 있습니다¹⁰.

2. 세포 배양

참고: 아래 단계는 인간의 혈액에서 건강한 적혈구를 얻는 방법을 설명합니다. 각 실험 전에 샘플을 새로 준비하는 것이 중요합니다.

1. 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1.8 mM KH₂PO₄, 10 mM 포도당을 함유하는 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 용액 250 μL에 혈액 20 μL를 희석하고 1 mg/mL 소 혈청 알부민(BSA)으로 보충합니다.
2. 실온에서 2분 동안 200 x g 에서 원심분리한 후 피펫을 사용하여 상층액을 흡인하고 1x PBS/BSA 용액 1mL에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 완충액에서 세포를 2x 세척합니다.
3. 상기 단계 1에서 제조된 시료 홀더에 50,000 내지 100,000개의 세포를 시딩하고 혈구측정기를 이용하여 세포 밀도를 계산한다. 커버슬립에 비특이적 셀이 부착될 때까지 10-15분 동안 기다리십시오. 대기 시간은 세포에 영향을 미치지 않습니다.
4. 추가 OT 실험을 위해 10% v/v 폴리스티렌 구 용액(반경 = 1.52 ± 0.02 μm)의 샘플 0.2 μL을 추가합니다. 현미경으로 샘플을 보고 적절한 혼합을 확인합니다.
5. 세포 파종 후 두 번째 커버슬립을 고무 링 위에 놓고(부착을 위해 그리스를 추가할 필요가 없음) 설정을 닫고 샘플 준비를 마칩니다. 시료는 현미경 분석 및 조작을 위해 준비되었습니다.

3. 광학 핀셋 현미경 설정

참고: OT는 고도로 집중된 레이저 빔을 사용하여 미세한 물체를 가두고, 피코네톤 범위의 힘과 나노미터 단위의 변위를 측정하는 도구입니다. 사용된 OT 레이저(1064nm 파장)는 앞서 설명한 대로 적절하게 정렬되어야 합니다¹⁰.

1. 간단히 말해서, 몇 센티미터(최소 10-20cm)의 거리로 분리된 최소 두 개의 거울을 사용하여 선형 편광 레이저 빔을 도립 현미경의 후면 입구로 향하게 합니다. 레이저 빔을 정밀하게 정렬하여 현미경에 직선으로 진입시킵니다(그림 1).
2. 그런 다음 현미경에 설치된 이색성 거울을 사용하여 레이저 빔을 반사하여 대물 렌즈의 축과 평행하게 진행하고 후문 중앙 근처의 렌즈에 들어갑니다. 이렇게 하면 레이저가 초점을 맞춰 광학 트랩을 생성합니다(그림 1).
3. 다음으로, OT로 힘을 측정하기 위해 시스템을 보정하여 트랩 강성(κ_OT)을 얻습니다. OT 교정 절차에 대한 자세한 설명은¹⁰ 을 참조하십시오. κ_OT 가 발견되면 OT 시스템은 유변학 실험을 위한 준비가 됩니다.

4. DM 설정

참고: DM은 명시야 기반 광학 현미경 기술로, 현미경의 초점이 약간 흐려지면 투명한 물체를 볼 수 있습니다^11,12. 이와 같은 기술은 RBC 형상(¹³)을 얻기 위해 적용되었다. OT 시스템에 사용된 것과 동일한 현미경을 DM에 사용하여 3D 재구성을 통해 높이 프로파일을 얻을 수 있습니다.

1. Köhler 조명¹⁴ 를 수행하여 현미경 조명 시스템을 조정하고 더 나은 해상도를 위해 콘덴서-다이어프램을 완전히 열어 실험을 수행합니다.
2. 압전 포지셔닝 시스템을 사용하여 모든 좌표에서 샘플을 z축의 나노미터 정밀도로 변위합니다. 모든 축에서 압전 시스템의 자동 보정을 수행합니다. 모든 절차가 수행되면 현미경 시스템은 DM 실험을 위한 준비가 됩니다.

5. OT 기반 유변학 실험 및 분석

참고: 유변학 실험은 다양한 주파수의 작은 진동에 대한 세포의 반응을 관찰하는 것으로 구성됩니다.

1. 실험
   1. OT 시스템을 사용하여 OT 레이저로 구체를 가둔 다음 구체를 상단 표면 근처와 셀 가장자리에 가까운 셀 표면에 대고 눌러 RBC에 부착합니다. 이 단계에서는 현미경을 사용합니다. 그런 다음 다른 구체를 트랩하고 동일한 부착 절차를 반복하되 이제 셀에 가까운 커버슬립에 부착합니다. 커버슬립에 부착된 구체는 기준 비드(그림 2)로, 피에조 변위를 따르고 RBC 구와 비교하는 데 필요합니다.
   2. 측정을 시작하기 전에 선택한 셀이 커버슬립에 잘 부착되어 있고 RBC 및 기준 구가 각각 RBC 표면과 커버슬립에 부착되었는지 확인하십시오. 부착되지 않은 세포가 높은 접착률(약 80%-90%)에도 불구하고 시간이 지남에 따라 이동하므로 시각적으로 식별합니다.
   3. 진폭의 정현파 함수, ξ 0 = 0.500 ± 0.001 μm 및 1 Hz, 7 Hz, 14 Hz, 21 Hz, 28 Hz 및 35 Hz의 다양한 주파수, 각각의 각 주파수, ω, 6.3 rad/s, 169 rad/s, 88 rad/s, 132 rad/s, 176 rad/s 및 220 rad/s를 압전 스테이지 소프트웨어에 추가하고, 이전에 시연 된 바와 같이 압전 소프트웨어를 사용하여 ^8,9.
   4. 압전 스테이지를 사용하여 시작 버튼을 눌러 압전 변위를 허용하고 RBC 구를 트랩에 유지하고 샘플을 이전에 설정된 사인파 함수를 사용하여 움직임 주기에 제출합니다. 790 frames/s 이상의 이미지를 생성할 수 있는 카메라를 사용하여 샘플 움직임을 기록합니다. 실험의 개략도는 그림 2에 나와 있습니다.
   5. 샘플이 정현파 운동에 제출되는 동안 OT를 활성화하여 RBC 표면에 부착된 구를 가둡니다. 실험을 수행하기 위해 선택한 온도, 실온, 37°C 또는 다른 온도에 관계없이 측정 중 변동을 피하기 위해 온도를 주의 깊게 모니터링하십시오. OT를 생성하는 데 사용되는 적외선 (1064 nm) 레이저는 세포의 손상이나 가열을 거의 일으키지 않습니다.
2. 분석
   1. ImageJ를 사용하여 정현파 운동 중에 얻은 이미지를 분석하여 시간 경과에 따른 각 구의 질량 중심 위치를 찾습니다.
      참고: 이 데이터를 사용하면 두 구 사이의 위상 및 진폭 차이를 표시할 수 있는 플롯을 생성할 수 있습니다. 이러한 정보는 적혈구의 점탄성 반응을 얻는 데 중요합니다.
   2. 각 구의 질량 중심을 구하려면 ImageJ 소프트웨어를 엽니다. 정현파 이동 중에 얻은 전체 동영상을 가져옵니다.
   3. Image( 이미지 ) 탭에서 Adjust( 조정)를 클릭한 다음 Threshold(임계값)를 선택합니다. 임계값 창이 열립니다. B&W를 선택합니다. 이렇게 하면 배경이 흰색으로 바뀌고 구체가 검은색으로 바뀝니다.
   4. 히스토그램 아래에 있는 두 스크롤 막대로 임계값을 조정하여 두 구가 최대 픽셀 수로 표시되도록 합니다.
   5. File > Rectangle 을 클릭하여 참조 구를 선택합니다. 사각형을 그려 구를 선택합니다. 한 이미지에서 참조 구를 선택한 후 사각형이 동영상의 다른 모든 이미지에서도 동일한 구를 올바르게 선택하는지 확인합니다.
   6. 그런 다음 분석 탭에서 측정 설정을 클릭하고 질량 중심 옵션을 선택합니다.
   7. 분석(Analyze) 탭을 다시 클릭하고 파티클 분석(Analyze Particles)을 선택합니다. 새 창이 열립니다. 크기와 원형도(구 반경에 따라 다름)를 정의합니다. 결과 표시 및 결과 지우기 확인란을 선택합니다. 마지막으로 확인을 클릭하여 모든 이미지를 처리합니다.
   8. 질량 중심에 대한 xy 좌표가 있는 테이블이 포함된 새 창이 나타납니다. 이러한 좌표 값을 .txt 파일로 저장합니다. RBC 표면에 부착된 다른 구에 대해 이 절차를 반복합니다.
   9. 두 구의 진폭과 위상 차이를 구하려면 해석 소프트웨어를 엽니다. 이전에 가져온 .txt 파일을 가져옵니다.
   10. 세 개의 열이 있는 새 테이블을 만듭니다. 첫 번째 열(c0)에 프레임 수를 추가하고, 두 번째 열(c1)에 참조 구의 x 좌표를 추가하고, 세 번째 열(c2)에 RBC 표면에 부착된 구의 x 좌표를 추가합니다.
       참고: 이 예에서는 정현파 이동이 x축에서만 수행되었으므로 두 구에 대해 x 좌표만 사용하면 됩니다.
   11. 그런 다음 프레임을 시간과 연관시킵니다. Windows > 수식 항목을 클릭합니다. 수식 입력이라는 새 창이 열립니다. 이 창에서는 8 개의 다른 방정식을 설정할 수 있으며 각 방정식은 특정 키 (F1에서 F8까지)에 있습니다.
   12. F1 키를 선택하고 다음 수식을 입력합니다.
       C 3 = C0 / (카메라 FPS)
       실행을 클릭합니다. 이렇게 하면 테이블(열 4)에 일정 시간 동안 새 열이 만들어집니다.
   13. 각 프레임의 x 좌표 값을 각각의 평균값으로 뺍니다. 이렇게 하려면 수식 항목에 두 개의 키를 지정하고 각 키에 대해 다음 수식을 입력합니다.
       C 4 = (C 1 - 평균 (C 1)) 및 C 5 = (C 2 - 평균 (C2))
       실행 버튼을 클릭합니다. 결과는 참조 및 RBC 구체에 대해 각각 5열과 6열에 나타납니다.
   14. 질량 중심 값을 픽셀에서 마이크로미터로 변환합니다. 이를 위해 수식 항목에 다른 키를 사용하고 다음 수식을 입력합니다.
       C 4 = C 4 / 변환 번호
       열 5에 대해 동일한 프로세스를 반복합니다.
       참고: 변환은 마이크로미터 눈금자/자를 사용하여 획득하고 측정에 사용된 것과 동일한 현미경 설정(동일한 대물 렌즈 포함)으로 이미지를 얻습니다. 이 절차는 현미경 보정 중에 수행할 수 있습니다. 따라서 픽셀/마이크로미터 관계가 얻어집니다.
   15. 두 구의 질량 중심이 y축에 있고 시간이 x축에 있는 플롯을 생성합니다. 이를 위해 Gallery > Linear 및 Scatter를 클릭하십시오. 새 창이 열립니다. x축에 대한 시간 열을 선택하고 y축에서 기준 구와 RBC 구 모두에 대해 질량 중심의 열을 마이크로미터 단위로 선택합니다.
   16. 그림에서 첫 번째 각 주파수(6.3rad/s)와 관련된 데이터만 선택합니다. 그림 3에 표시된 도구를 사용합니다.
   17. 참조 구의 데이터 곡선을 조정하는 방정식을 정의합니다. 이를 위해 커브 피팅(Curve Fit) > 일반(General) 및 피트1(Fit1)을 클릭하고 참조 구의 위치와 관련된 데이터 상자를 선택한 다음 정의(Define)를 클릭합니다. 방정식을 정의하는 새 창이 열립니다. 기준 구의 위치 ξ(t)는 다음과 같이 설명됩니다.
       ξ(t) = ξ₀cos(ωt)
       여기서 ξ 는 샘플의 정현파 이동, ω 는 각 주파수, t 는 s 단위의 시간입니다. 이 방정식을 분석 소프트웨어로 바꾸면 다음과 같습니다.
       여기서 m1은 ξ이고, m2는 f이고, m0는 시간 t이고, m3은 t =0에 대한 코사인 함수의 위상입니다.
   18. 그림에서 m1, m2, m3의 값을 추정합니다. 방정식을 정의한 후 확인을 클릭합니다. 데이터는 방정식에 따라 피팅되고 작은 사각형과 함께 곡선이 m1, m2 및 m3 값으로 그래프에 나타납니다.
   19. RBC 구의 데이터 곡선을 조정하는 방정식을 정의합니다. 이를 위해 Curve Fit > General 을 클릭하고 데이터의 곡선을 조정할 방정식을 정의합니다. RBC 구의 위치 ρ(t)는 다음과 같이 주어집니다.
       
       여기서 ξ'는 위상 이탈 진폭이고 φ는 위상 이탈각입니다. 이 공식을 분석 소프트웨어로 바꾸면 다음과 같이 표시됩니다.
       여기서 m1, m2 및 m3은 기준 구의 곡선 피팅에서 얻은 값입니다. m4는 ξ'이고 m5는 φ입니다.
   20. 그림에서 m4 값과 m5에 대한 값을 추정합니다. 수식을 정의한 후 확인을 클릭합니다. 데이터는 방정식에 따라 적합되며 작은 정사각형과 함께 곡선이 m4 및 m5 값으로 그래프에 나타납니다.
   21. 그런 다음 새 테이블을 생성하여 곡선 피팅에서 얻은 데이터를 해당 열에 추가합니다. 다음 매개변수에 대해 각 주파수, 진폭(기준 구), 초기 시간, 진폭(RBC 구) 및 위상 이탈각에 대해 5개의 서로 다른 열을 정의합니다. 다른 모든 주파수에 대해 동일한 절차를 수행합니다.
   22. 다음 방정식을 사용하여 저장 상수(K')와 손실 상수(K")를 구합니다.
       
       
       여기서 κ_OT 는 OT 탄성 상수이고 β 는 스톡스 항력 계수입니다. 방정식을 분석 소프트웨어로 바꾸면 다음과 같이 보입니다.
       그리고
       
        , 여기서 β 및 κ_OT 는 시스템에서 찾은 값으로 대체해야 합니다.
   23. K"의 경우 x축을, K'의 경우 y축을 사용하여 그래프에 결과를 표시합니다(그림 4).

6. 전체 세포 폼 팩터를 얻기 위한 DM 실험 및 분석

1. 비디오 획득
   1. 소프트웨어를 사용하여 압전 스테이지를 xy 방향으로 이동하여 커버슬립에 부착된 절연 셀을 검색합니다. 알려진 직경의 폴리스티렌 구체를 RBC 표면에 걸러서 부착합니다. 압전 스테이지를 사용하여 셀을 변형시키기 위해 RBC 표면에 부착된 트랩 비드를 약간 움직인 다음 비드를 커버슬립에 부착합니다.
      참고: OT 측정에서 동일한 셀을 사용할 수도 있습니다.
   2. z축 위치를 변경하여 초점이 맞춰진 이미지를 찾습니다. 여기서 초점 평면은 선택한 셀의 중간에 있습니다. 이 이미지는 셀 중앙의 회색 수준(배경)과 동일한 더 작은 대비를 제공합니다.
   3. 위치가 고정되면 카메라 소프트웨어를 사용하여 25fps의 프레임 속도로 8비트 및 256픽셀 x 256픽셀에서 약 5,000개의 이미지가 있는 전체 셀의 동영상을 만듭니다. 그런 다음 z축 위치를 2μm 아래 또는 위로 이동하여 선택한 셀에 대한 초점이 흐려진 이미지를 얻습니다. 매개 변수를 반복하여 이 상황에 대한 동영상을 만듭니다.
   4. 마지막으로 z축 위치를 변경하지 않고 셀이 없는 영역을 검색하여 동일한 절차를 반복하고 이미지 배경의 동영상을 만듭니다.
2. 콘트라스트 이미지 획득
   1. 세 개의 영화를 각각 세 개의 평균 이미지로 변환합니다. ImageJ를 사용하여 동영상 중 하나를 선택하고 이미지 > 스택 > Z 프로젝트를 클릭한 다음 평균 강도 옵션을 선택합니다. 다른 동영상에 대해 이 절차를 반복하여 각각의 이미지를 얻습니다.
   2. 얻은 모든 이미지를 8비트에서 부동 소수점 32비트로 변경합니다. ImageJ를 사용하여 이미지 > 유형 > 32비트를 클릭합니다. 그런 다음 측정 분석 > 설정을 클릭하고 평균 회색 값 옵션을 선택합니다. 마지막으로 Analyze > Measure(측정 분석)를 다시 클릭합니다.
   3. 그런 다음 Process > Image Calculator 를 클릭하고 초점이 맞춰진 이미지를 배경 이미지로 나눕니다. 이 결과를 얻으려면 초점이 맞춰진 이미지의 그레이 레벨 평균값을 곱합니다. Process > Math > Multiply를 클릭하여 평균값을 구합니다.
   4. 평균값을 얻으려면 초점이 맞춰진 이미지를 선택한 다음 분석 > 측정을 클릭합니다. 대표 이미지의 경우 그레이 레벨의 평균값은 69,199입니다. 초점이 흐려진 이미지에 대해 위의 절차를 반복합니다. 이 경우 그레이 레벨의 평균값은 69,231입니다. 그림 5 는 시술 전후의 초점이 맞춰진 이미지와 초점이 맞지 않는 이미지를 보여줍니다.
   5. 작업 중에 이미지가 시각적 대비를 잃을 수 있습니다. 이미지를 더 잘 시각화하려면 이미지 > 밝기/대비> 조정 을 클릭하고 자동 옵션을 선택합니다.
   6. 그런 다음 이미지 대비를 찾으려면 다음 관계를 사용합니다.
      여기서, _Nimg 는 셀의 그레이 레벨이고, N0는 셀 외부의 그레이 레벨이며, 카메라에 의존하는 제로 광 강도에 대한 그레이 레벨에 대응하는 상수 파라미터이다.
   7. 값 B를 찾으려면 파워 미터를 사용하여 광도를 측정합니다. 광도의 각 값에 대해 비디오를 녹화해야 합니다. 따라서, 상이한 강도 값들은 상이한 레벨의 회색과 관련될 수 있다. 마지막으로, 선형 피팅을 구하고 B를 제로 광도¹⁵와 관련시킵니다.
   8. N₀의 값을 찾고 Polygon Selection 아이콘을 클릭한 다음 그림 6과 같은 다각형을 그립니다. 그런 다음 분석 탭을 클릭하고 측정을 선택하여 선택한 영역의 평균 그레이 레벨을 찾습니다. 각 이미지는 픽셀 집합으로 구성되며 각 픽셀에는 특정 그레이 레벨이 있습니다. 이미지를 구성하는 모든 픽셀로 인한 모든 그레이 레벨의 집합은 N_Img에 해당합니다.
   9. 대조 방정식을 사용하여 _{N Img} - Ño 를 결정하고 Process > Math > Subtract를 선택하여 이를 실행합니다. 결과를 N₀ - B로 나눕니다. 마지막으로 초점이 맞춰진 이미지(C0)와 초점이 맞지 않는 이미지(C1)의 대비를 찾습니다.
3. 높이 프로파일 얻기
   1. 높이 프로파일을 얻기 위해, 이미 설명된 방법¹³을 사용한다. 간단히 말해서 Hartley 변환(FHT)을 사용하여 RBC 두께를 얻습니다. ImageJ에서 FFT > FFT > 처리를 클릭한 다음 FHT를 선택합니다.
   2. Process > Math > Subtract를 사용하여 ImageJ에서 이미지 C0과 C1을 빼서 다음 절차인 C= C0 - C1에 대한 이미지를 구합니다.
   3. 이미지 C의 경우 FFT > FFT > 처리를 클릭한 다음 FHT 를 선택하여 이미지의 Hartley 변환을 수행합니다. 그런 다음 맞춤형 플러그인 DivideQ2를 사용하여 공간 주파수 q² 로 나눕니다. 플러그인 > DivideQ2를 클릭합니다.
      참고 : 파일 DivideQ2.class ImageJ가 설치된 플러그인 디렉토리에 복사해야 합니다. 플러그인은 ImageJ의 플러그인 폴더에 포함될 .class 파일(Supplementary File 1)로 제공됩니다.
   4. 그 후, FFT > FFT 처리를 이용하여 역변환 FHT> 수행하여 셀의 높이에 비례하는 그레이 레벨의 영상을 획득한다.
   5. 마지막으로 Process > Math > Multiply 를 클릭하여 다음 상수를 사용하여 결과 이미지를 곱합니다.
      
      이는 이미지, 샘플 및 실험 설정의 특성에 기초하여 정의된다(¹³). 여기서, n=1.51은 오일 굴절률, p=0.0721 μm는 영상의 마이크로미터와 픽셀 간의 관계,Δn=0.058은 RBC와 수성 매질 굴절률의 차이, 집속 영상과 디포커싱 영상 사이의 거리(Zf1 - _Zf2) = 2μm, 영상의 크기, N 2 = 256 pxl²입니다.
   6. 결과 이미지를 사용하여 높이 프로파일을 얻습니다(그림 7). 결과 이미지는 ImageJ에서 다양한 높이 프로파일을 관찰하는 데 사용됩니다. 셀에서 노란색 수직선이 배치되는 위치에 따라 다릅니다(예: 그림 7 에서 수직선으로 제한된 높이 프로파일이 얻어짐) Ctrl + K를 눌러 이를 관찰합니다.
4. 폼 팩터
   1. RBC 높이 프로파일이 포함된 이미지를 찾은 후 2μm 디포커스 대비를 사용하여 ImageJ에 두 개의 이미지 세트를 만듭니다. Image > Stacks(스택 이미지)를 클릭한 다음 Images to Stack(스택할 이미지) 옵션을 선택합니다. 폼 팩터를 찾으려면 ImageJ 사용자 지정 매크로를 사용하여 스택을 분석합니다. ImageJ 사용자 지정 매크로는 추가 파일 2로 다운로드할 수 있습니다.
      참고: 프로그램은 디포커스 이미지를 사용하여 셀 가장자리를 결정합니다. 그런 다음 높이 프로파일이 포함된 이미지를 사용하여 각 수평 위치에 대한 둘레를 결정합니다. 가장자리 외에도 둘레와 둘레의 역을 결정합니다. 역 둘레 값의 합계에 픽셀 두께를 곱한 값은 폼 팩터의 역에 해당합니다.
   2. 프로그램에 픽셀/마이크로미터 관계식을 삽입합니다. 현미경 대물렌즈 보정 실험에서 이 값을 얻습니다. 사용된 예에서 값은 13.87픽셀/μm입니다.
   3. 수평 시작 위치를 선택하여 스택의 첫 번째 이미지에 노란색 선을 배치합니다. 셀의 시작 부분 앞에 선을 시작하고 셀의 수직 한계를 넘어 그립니다. 이 예에서 노란색 선의 길이는 153픽셀이고 초기 위치는 i = 70, y1 = 80, i = 70, y2 = 195 사이입니다. 그런 다음 최종 위치가 f = 245, y1 = 80, f = 245, y2 = 195가 될 때까지 노란색 선을 수평으로 이동합니다.
   4. 마지막으로 셀 가장자리, 둘레 및 둘레의 반대를 찾으려면 매크로 탭을 선택하고 매크로 실행을 클릭합니다. 매크로는 가장자리 위치, 둘레 및 둘레의 역, 분석된 셀의 이미지가 있는 테이블을 제공합니다. 이 이미지의 가장자리가 그림 7의 가장자리와 유사한지 확인하고, 그렇지 않으면 절차를 반복합니다.
   5. 둘레의 역수의 합을 사용하여 폼 팩터⁸을 찾습니다.

7. 연질 유리 유변학 모델 및 실험 분석

1. 실험 데이터를 표로 구성하기
   1. 파일 탭을 클릭하여 분석 소프트웨어에서 새 테이블을 만듭니다. 다음 매개변수에 대해 10개의 서로 다른 열(c0에서 c9까지)을 결정합니다. 사용된 각 주파수(rad/s): c0; 각 각 주파수에 대해 얻은 K'(pN/μm) 값: c1; ErrK': c2; 각 각 주파수에 대해 얻은 K"(pN/μm) 값: c3; ErrK": c4; 각 각 주파수에 대해 얻은 G'(Pa) 값: c5; ErrG': c6; 각 각 주파수에 대해 얻은 G"(Pa) 값: c7; ErrG": c8 및 F_f와 각각의 오류: c9(그림 8). 다음 수식을 사용하여 다음 열을 채웁니다.
      씨5 = (3 x 씨1) / (8 x 1.28 x 0.087)
      씨6 = (3 / (8 x 0.087 x 1.28)) x 제곱 (씨2^2 + (씨1 x 0.01 / 1.28)^2 + (씨1 x 0.008 / 0.087) ^ 2)
      씨7 = (3 x 씨3) / (8 x 1.28 x 0.087)
      씨8 = (3 / (8 x 0.087 x 씨4)) x 제곱 (씨4^2 + (씨3 x 0.01 / 1.28)^2 + (씨3 x 0.008 / 0.087)^2)
2. 플로팅 곡선 G'(ω) 대 G"(ω)
   1. 분석 소프트웨어에서 곡선 G'(ω) 대 G"(ω)를 생성하려면 이전 표의 데이터를 사용하십시오. Gallery > Linear를 클릭하고 Scatter Plot 형식을 선택합니다.
   2. 새 창이 열립니다. G" 열을 x축으로 선택하고 G' 열을 y축으로 선택합니다. 마지막으로 플롯 버튼을 클릭하여 그래프를 얻습니다.
   3. 플롯에 오차 막대를 추가하려면 플롯 창을 클릭한 다음 플롯 > 오차 막대를 클릭합니다. 새 창이 열립니다. 먼저 Y Err 옵션을 표시합니다. 오류 표시줄 설정이라는 다른 창이 열립니다.
   4. 값의 %를 클릭하고 데이터 열을 선택한 다음 ErrG' 열을 클릭합니다. 마지막으로 플롯> 확인을 클릭하면 y 값에 대한 오차 막대가 나타납니다. 이제 X Err 사각형과 ErrG에 대한 올바른 열을 선택하여 x축 값에 대해 동일한 절차를 반복합니다." 최종 플롯은 그림 9에 표시된 플롯과 유사합니다.
3. 부드러운 유리질 유변학 모델에 파라미터 맞추기
   참고: 데이터 분석은 두 부분으로 나뉩니다: 1) 매개변수 Γ 및 _Gm을 얻기 위해 G'(ω) 대 G"(ω) 플롯을 피팅하는 곡선; 2) 곡선 피팅 G'(ω)와 G"(ω) 주파수의 함수로서 ω, 거듭제곱 법칙 지수 α 구한다.
   1. G'(ω) 대 G"(ω) 플롯을 피팅하여 파라미터 Γ 및 _Gm을 얻는다.
      1. 커브 핏(Curve Fit) 탭을 클릭하고 핏1(Fit1)을 선택합니다. 새 창이 열립니다. Square를 선택하고 Define(정의) 버튼을 클릭합니다. 일반 커브 피팅 정의(general curve fit definition)라는 창이 나타납니다. 다음 수식을 입력합니다.
         m1 + m0/m2
         여기서 m1 = 61.576; m2 = 1, 허용 오차는 1 x ^10-5입니다. 여기서 m0은 G"를 나타내고, m1은 _Gm을 나타내고, m2는 Γ를 나타냅니다.
         참고: m1 및 m2의 경우 곡선 적합 정의 중에 각각의 값을 추정해야 합니다. 위의 추정치는 표시된 예제 실험을 기반으로 합니다. 실험에서는 그림에서 관찰된 값에 따라 숫자를 추정합니다.
      2. 두 창에서 확인 버튼을 클릭하면 그림 10 과 같이 검은색 곡선이 나타납니다. 그림과 함께 나타나는 곡선 적합도표에 나열된 m1과 m2에 대한 올바른 값을 확인합니다.
   2. 곡선 피팅 G' 및 G"는 각 주파수 ω의 함수입니다.
      1. 다음으로, 두 개의 다른 플롯, 즉 ω의 함수로서의 G'와 ω의 함수로서의 G'를 생성합니다. 앞에서 설명한 대로 오차 막대를 y축에만 배치합니다.
      2. 커브 피팅 절차를 반복하되 이제 커브 피팅 선택(Curve Fit Selections)에서 G" 옵션을 선택한 다음 일반 피팅 > 커브 정의(General Fit Curve Definition)에서 다음 방정식을 작성합니다.
         
         이 경우 m1은 ω = 6.3rad/s일 때 G"(ω) = 23.683Pa의 값으로 추정되었습니다. m2는 0.5로 추정되었습니다(m2는 지수 α이며 0과 1 사이에서 다양함을 기억하십시오). 그림 10의 m2 결과에 따라 Γ = 2.0293에 대한 값을 삽입합니다.
      3. 옵션 가중치 데이터를 표시하십시오. 이 모든 절차가 끝나면 확인을 클릭하면 그림 11과 유사한 곡선 피팅 - 파란색 곡선이 나타납니다. α, α = 0.63 ± 0.02 및 G 0, G 0 = (3.7 ± _0.3)Pa 값이 나타납니다. 이 값을 사용하여 다음 곡선 G'(ω)를 피팅합니다.
      4. 다음 커브를 클릭하고 커브 피팅 절차를 반복하되 이제 일반 맞춤 커브 정의(General Fit Curve Definition)에서 다음 방정식을 작성합니다.
         
         이 경우 m3는 이전에 얻은 값을 확인하기 위해 α의 추정값일 뿐입니다. ω = 6.3rad/s일 때 G ₀ = 3.703 및 G'(ω) = 23.683Pa에 대한 값을 사용합니다.
      5. 다시 1 x ^10-5 를 허용 오차로 추가하고 옵션 가중치 데이터를 표시합니다. 이 모든 절차가 끝나면 확인을 클릭하면 그림 11 과 유사한 곡선 피팅 - 녹색 곡선이 나타납니다.

결과

그림 1은 유변학 측정에 사용되는 OT 시스템의 개략도를 나타냅니다. 도 2에는 두 구체 및 대표적인 RBC를 이용한 미세유변학 실험의 개략도가 도시되어 있다. 그림 3은 정현파 운동이 압전 스테이지에 의해 생성될 때의 시간 함수로서 두 구체의 진폭에 대한 일반적인 곡선을 보여줍니다. 기준 구(그림 3 - 빨간색 곡선)는 스테이지 이동에 따라 진동하는 반면, RBC 구(그림 3 - 파란색 곡선)는 다른 진폭과 위상으로 진동합니다. 이러한 파라미터를 측정함으로써, 샘플의 상이한 적혈구에 대한 복소수 탄성 상수 K*(ω)를 결정할 수 있다. 도 4는 손실 탄성 상수 K"

토론

이 프로토콜에서는 광학 핀셋과 디포커싱 현미경을 기반으로 하는 통합 방법을 제시하여 RBC의 점탄성 특성을 정량적으로 매핑합니다. 저장 및 손실 전단 계수에 대한 결과와 RBC의 연질 유리 유변학을 특징짓는 스케일링 지수가 결정됩니다. 생리학적 상황⁸ 또는 P. falciparum intra-erythrocytic^cycle9 의 각 단계와 같은 다양한 실험 조건에 대한 이 프로토콜의 적용은 이미 수행되었다.

문헌의 참고 문헌은 RBC 유변학의 불일치를 지적하며, 부분적으로는 측정 ^6,7 동안 적절하게 고려되지 않은 세포 형태의 변화에 기인합니다. 동적 광 산란을 사용하여 RBC 저장 및 손실 계수에 대한 값은 1-100Hz⁶의 주파수...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
35mm 배양 접시	Corning	430165
소 혈청 알부민	Sigma-Aldrich	A9418
Coverslips	니트 유리	VD12460Y1A.01 및 VD12432Y1A.01
유리 바닥 접시	MatTek Life Sciences	P35G-0-10-C
포도당	Sigma-Aldrich	G7021
ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/
침지 오일	Nikon	MXA22165
도립 현미경	Nikon	Eclipse TE300
KaleidaGraph	Synergy 소프트웨어	https://www.synergy.com/
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
현미경 카메라	Hamamatsu	C11440-10C
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
Neubauer 챔버	Sigma-Aldrich	BR717805-1EA
대물 렌즈	Nikon	계획 APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H 및 Plan APO 10x XXNA PH2
광학 테이블	Thorlabs	T1020CK
OT 레이저	IPG Photonics	YLR-5-1064-LP
폴리스티렌 마이크로스피어	Polysciences	17134-15
고무 링	Forever Seals	NBR O-Ring
실리콘 그리스	Dow Corning	Z273554
스테이지 포지셔닝	PI	P-545.3R8S
피펫	Gilson	P1000