이 연구는 동형접합 메뚜기 돌연변이의 CRISPR/Cas9 리보뉴클레아제 기반 구성의 체계적으로 최적화된 절차와 메뚜기 알의 냉동 보존 및 소생을 위한 상세한 방법을 제공합니다.
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방법 논문
CRISPR/Cas9 기술을 이용한 철새 메뚜기의 동형접합 돌연변이 구축
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
철새 메뚜기인 Locusta migratoria는 인류에게 막대한 경제적 손실을 초래한 세계적인 역병 메뚜기 중 하나일 뿐만 아니라 곤충 변태에 대한 중요한 연구 모델이기도 합니다. CRISPR/Cas9 시스템은 특정 DNA 유전자좌를 정확하게 찾아내고 표적 부위 내에서 절단할 수 있으며, 이중 가닥 절단을 효율적으로 도입하여 표적 유전자 knockout을 유도하거나 새로운 유전자 단편을 특정 유전자좌에 통합할 수 있습니다. CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집은 메뚜기 연구에서 직면하는 문제를 해결하기 위한 강력한 도구일 뿐만 아니라 메뚜기 제어를 위한 유망한 기술입니다. 이 연구는 철새 메뚜기에서 Cas9 단백질과 단일 가이드 RNA(sgRNA)의 복합체를 사용한 CRISPR/Cas9 매개 유전자 knockout에 대한 체계적인 프로토콜을 제공합니다. 표적 부위의 선택과 sgRNA의 설계에 대해 자세히 설명한 후 시험 관 내 합성 및 sgRNA의 검증을 수행합니다. 후속 절차에는 낮은 사망률로 성공적인 미세 주입을 달성하기 위한 알 뗏목 수집 및 무두질 계란 분리, 계란 배양, 돌연변이 비율의 예비 추정, 메뚜기 번식, 편집된 메뚜기의 개체군 안정성을 보장하기 위한 돌연변이의 탐지, 보존 및 통과가 포함됩니다. 이 방법은 철새 메뚜기 및 다른 곤충에서 CRISPR/Cas9 기반 유전자 편집 응용 분야에 대한 참조로 사용할 수 있습니다.
서론
유전자 편집 기술은 특정 게놈 유전자좌에 삽입 또는 결실을 도입하여 목적1에 표적 유전자를 인위적으로 변형시키는 데 사용될 수 있습니다. 지난 몇 년 동안 CRISPR/Cas9 기술은 빠르게 발전했으며 생명 과학 2,3,4,5,6의 다양한 분야에서 응용 범위가 증가하고 있습니다. CRISPR/Cas9 시스템은 1987년7년에 발견되었으며, 박테리아와 고세균에서 널리 발견되었다. 추가 연구에 따르면 파지8에 대항하기 위해 RNA 유도 뉴클레아제 Cas9에 의존하는 원핵생물 적응 면역 시스템이었습니다. 인공적으로 변형된 CRISPR/Cas9 시스템은 주로 단일 가이드 RNA(sgRNA)와 Cas9 단백질의 두 가지 구성 요소로 구성됩니다. sgRNA는 표적 염기서열에 상보적인 CRISPR RNA(crRNA)와 상대적으로 보존된 보조 trans-activating crRNA(trac....
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프로토콜
1. 표적 부위 선정 및 sgRNA 설계
- 문헌 연구 및/또는 NCBI 및 메뚜기 데이터베이스24에서 유전자의 mRNA 또는 코딩 DNA 서열(CDS) 검색을 통해 관심 유전자에 대해 가능한 한 많은 서열 정보를 수집합니다.
- 관심 유전자의 서열을 게놈 DNA 서열과 비교하여 엑손과 인트론 영역을 구별합니다.
- 연구 목적에 따라 대상 사이트 디자인을 위한 후보 지역을 선택합니다. 후보 영역 단편을 증폭하기 위해 프라이머 쌍을 설계하고 PCR 산물의 염기서열 분석을 통해 야생형 서열을 검증합니다.
참고: 후보 대상 지역을 선택하는 데는 여러 가지 전략이 있습니다. 예를 들어, 대부분의 유전자/단백질 기능 연구에서 시작 코돈에 가까운 엑손 단편을 후보 영역으로 사용하여 게놈 편집(즉, 유전자 녹아웃) 후 전체 단백질/RNA 기능이 손실되도록 합니다. 특정 도메인의 함수 분석을 위해 도메인의 시작 부분(또는 양쪽 끝)에서 후보 영역을 선택합니다. - E-CRISP Design25 와 같은 온라인 리소스를 사용하여 후보 대상 지역에서 잠재적 대상 사이트를 검색합니다.
- 참조 게놈의 드롭다운 목록에서 "Dro....
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결과
이 프로토콜에는 Cas9 단백질과 시험관 내에서 합성된 sgRNA로 구성된 RNP를 사용하여 철새 메뚜기의 동형접합 돌연변이를 생성하기 위한 자세한 단계가 포함되어 있습니다. 다음은 표적 선택, sgRNA 합성 및 검증(그림 1A), 난자 채취 및 주입, 돌연변이 스크리닝 및 계대배양, 냉동보존, 동형접합체 알의 소생술 등 메뚜기에서 CRISPR/Cas9 매개 표적 유전자 knockout의 대표적인 결과입니다.
이 연구에서는 세 가지 온라인 프로그램(E-CRISP, CRISPOR, ZiFit)의 결과에 따라 CRISPR/Cas9 시스템의 표적 부위를 선택하고 첫 번째 엑손에 위치합니다(그림 1B). 시험관 내 Cas9 절단 분석(표 1)에 따르면 CRISPR/Cas9 RNP는 약 55%의 절단 속도로 PCR 단편.......
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토론
메뚜기는 인류 문명 이래 농업에 가장 치명적인 해충 중 하나였습니다23. CRISPR/Cas9 기반 게놈 편집 기술은 메뚜기의 생물학적 메커니즘에 대한 더 나은 지식과 유망한 해충 방제 전략을 제공하는 강력한 도구입니다. 따라서 동형접합체 메뚜기 돌연변이체의 CRISPR/Cas9 매개 구조의 효율적이고 사용하기 쉬운 방법을 개발하는 것은 큰 이점이 있습니다. 메뚜기18,20,21,22의 게놈 편집을 위한 몇 가지 훌륭한 작업이 보고되고 몇 가지 기본 워크플로를 제공했지만 전체 절차의 체계적인 최적화는 여전히 부족합니다. 일반적으로 CRISPR/Cas9 시스템의 배아 주입에 의해 생성된 동형접합 로커스트 돌연변이는 a) sgRNA 설계, 합성 및 in v.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (32070502, 31601697, 32072419과 중국 박사후 과학 재단 (2020M672205)의 지원을 받았습니다.
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재료
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| 2xEs Taq MasterMix (염료) | Cwbio | CW0690 | 유전자 증폭용 |
| 2xPfu MasterMix (염료) | Cwbio | CW0686 | 유전자 증폭용 |
| CHOPCHOP | sgRNA 설계를 위한 온라인 웹사이트, http://chopchop.cbu.uib.no/. | ||
| CRISPOR | sgRNA 설계를 위한 온라인 웹사이트, http://crispor.org. | ||
| sgRNA 설계를 위한 | CRISPRdirect | ||
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참고문헌
- Doudna, J. A. The promise and challenge of therapeutic genome editing. Nature. 578 (7794), 229-236 (2020).
- van Haasteren, J., Li, J., Scheideler, O. J., Murthy, N., Schaffer, D. V. The delivery challenge: fulfilling the promise of therapeutic genome editing. Nature Biotechn....
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