방법 논문

만성 요통의 기계론적 조사를 위한 쥐의 등 기계적 민감도 평가

DOI:

10.3791/63667

⸱

2022년 8월 30일

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1Department of Anatomy, Université du Québec à Trois-Rivières, 2CogNAC Research Group, Université du Québec à Trois-Rivières, 3Division of Physiology, Department of Basic Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, University of Tabriz

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

요통의 예방 및 관리를 위한 새로운 치료적 개입을 개발하기 위해 동물 모델은 번역 관점에서 이러한 치료법의 메커니즘과 효과를 조사해야 합니다. 현재 프로토콜은 쥐의 기계적 민감도를 평가하기 위한 표준화된 방법인 BMS 테스트를 설명합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

요통은 전 세계적으로 장애의 주요 원인이며 극적인 개인적, 경제적, 사회적 결과를 초래합니다. 새로운 치료법을 개발하기 위해서는 번역 관점에서 새로운 치료법의 메커니즘과 효과를 조사하기 위한 동물 모델이 필요합니다. 허리 통증의 여러 설치류 모델이 현재 조사에 사용됩니다. 그러나 놀랍게도 요통 모델에서 기계적 민감도를 평가하기 위한 표준화된 행동 테스트는 검증되지 않았습니다. 이는 요통이 추정되는 동물이 통각 수용 자극에 국소 과민증을 나타내는지 확인하고 요통을 완화하기 위해 고안된 중재 중 민감도를 모니터링하는 데 중요합니다. 이 연구의 목적은 쥐 등의 기계적 민감도를 평가하기 위한 간단하고 접근 가능한 테스트를 마련하는 것입니다. 이 방법을 위해 특별히 테스트 케이지를 제작했습니다. 세로 x 너비 x 높이: 50 x 20 x 7cm, 상단에 스테인레스 스틸 메쉬가 있습니다. 이 테스트 케이지를 사용하면 등에 기계적 자극을 가할 수 있습니다. 테스트를 수행하기 위해 관심 영역에서 동물의 등을 면도하고 필요에 따라 다른 날에 테스트를 반복하도록 테스트 영역을 표시합니다. 기계적 역치는 앞에서 설명한 상하 방법을 사용하여 척수주위 근육에 적용된 Von Frey 필라멘트로 결정됩니다. 긍정적인 반응에는 (1) 근육 경련, (2) 아치형(등 신전), (3) 목 회전, (4) 등을 긁거나 핥기, (5) 탈출이 포함됩니다. 이 행동 테스트(BMS(Back Mechanical Sensitivity) 테스트)는 요통의 예방 및 관리를 위한 치료적 개입 개발을 위한 요통의 설치류 모델을 사용한 기계론적 연구에 유용합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

요통(low back pain, LBP)은 전 세계적으로 장애의 주요 원인이며, 이는 개인적, 경제적, 사회적으로 극적인 결과를 초래한다 1,2,3,4. 매년 인구의 약 37%가 요통의 영향을 받습니다5. 요통은 보통 몇 주 이내에 해결되지만 개인의 24%-33%에서 재발하고 사례의 5%-10%에서 만성화된다2. 요통의 메커니즘과 영향 및 다양한 치료적 중재의 효과를 이해하기 위해 요통의 여러 동물 모델을 사용하여 요통의 임상 상태 또는 요통의 일부 구성 요소를 모방했습니다6. 이들 마우스 및 래트 모델은 다음 범주 중 하나 이상으로 분류될 수 있다: (1) 추간판 요통 7,8,, (2) 신경근성 요통 8,9,10,11, (3) 후관절 골관절염 12, 및 (4) 근육-유도성 요통 13,14 . 인간이 아닌 종에서는 통증을 직접 측정할 수 없기 때문에, 이러한 모델에서 통증과 유사한 행동을 정량화하기 위한 수많은 실험이 개발되었다8. 이 테스트는 유해한 자극 (기계적 힘 15,16,17, 열 자극18,19,20,21,22,23,24,25)에 의해 유발되거나 자발적으로 생성 된 행동 26,27,28,29를 평가합니다.

기계적 자극을 사용하는 방법에는 Von Frey 테스트 15,16 및 Randall-Selitto 테스트17이 포함됩니다. 열 자극을 사용하는 방법에는 테일 플릭 테스트(18), 핫 플레이트 테스트(19), 하그리브스 테스트(20) 및 열 프로브 테스트(21)가 있습니다. 저온 자극을 사용하는 방법에는 냉판 시험(cold plate test)22, 아세톤 증발 시험(acetone evaporation test) 23 및 저온 발바닥 분석(cold plantar assay)24가 포함된다. 자발적인 행동을 위한 방법으로는 찡그린 얼굴 척도(grimace scales)26, 굴을 파는 방법(burrowing)27, 체중부하 및 보행 분석(weight-bearing and a-pathit analysis)28, 자동화된 행동 분석(automated behavioral analysis)29 등이 있다. 이러한 수많은 테스트에도 불구하고 그 중 어느 것도 허리 통증 모델을 위해 특별히 설계되지 않았습니다.

이 연구의 목적은 쥐 등의 기계적 민감도를 평가하기 위한 간단하고 접근 가능한 테스트를 마련하는 것입니다. 이 기술은 주로 뒷발15,16의 발바닥 표면에 적용된 Von Frey 테스트를 기반으로합니다. Von Frey 테스트의 기본 원리는 관심 영역에 일련의 모노필라멘트를 사용하여 미리 결정된 일정한 힘을 전달하는 것입니다. 쥐가 통각 행동을 보이는 경우 반응은 양성으로 간주됩니다. 그런 다음 반응을 유발한 필라멘트를 기반으로 기계적 임계값을 계산할 수 있습니다. 본 연구에서는 쥐 등의 기계적 민감도를 결정하기 위해 Von Frey 테스트에서 채택한 간단하고 접근 가능한 방법이 제공됩니다.

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프로토콜

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실험 프로토콜은 Université du Québec à Trois-Rivières의 동물 관리위원회의 승인을 받았으며 캐나다 동물 관리위원회의 지침과 국제 통증 연구 협회 (IASP)의 연구 및 윤리 문제위원회의 지침을 준수했습니다. 본 연구에서는 6마리의 수컷 Wistar 쥐(체중: 320-450g, 연령: 18-22주)를 사용했습니다. 동물들은 상업적 공급원으로부터 입수하였다 ( 재료의 표 참조). 이 쥐의 데이터는 이전 연구30의 더 큰 샘플에서 나온 것입니다.

1. 실험 준비

  1. 음식과 물을 임의 로 이용할 수 있고 14시간에서 10시간의 명암 주기가 있는 표준 동물 시설의 온도 조절실에 동물을 수용합니다. 실험 당일 모든 동물의 건강 상태가 양호한지 확인하십시오.
  2. 아래 단계에 따라 만성 요통 동물 모델을 생성합니다.
    1. 만성 요통을 유발하기 위해, 이전 보고에 따라 등 근육에 완전 프로인트 보조제(CFA)를 근육내 주사한다 14,30,31.
    2. 이소플루란(유도 4%, 유지 관리 2%-2.5%)을 사용하여 동물을 마취합니다.
    3. 27G 바늘을 사용하여 프로토콜 요구 사항에 따라 즉시 사용할 수 있는 CFA의 유중수 에멀젼 150μL( 재료 표 참조)를 척추주위 근육에 일방적으로 또는 양측으로 주입합니다.
    4. 주사 완료 후 최소 3분 동안 주사 바늘을 제자리에 두십시오. 대조군의 동물에 대해서는 동일한 과정을 사용하되 30, CFA 대신 멸균 생리식염수 용액(150 μL, 0.9%)을 주입한다.
  3. 테스트 케이지를 제작합니다.
    1. 각 동물에 대해 하나의 챔버로 구성된 두 동물에 대한 테스트 케이지를 만듭니다.
      참고: 본 연구의 경우 각 챔버의 치수는 길이 x 너비 x 높이: 50 x 20 x 7cm입니다( 재료 표 참조).
    2. 33cm 길이의 플렉시 유리 다리 4개에 인접한 두 개의 챔버를 장착합니다. 챔버 벽에는 투명한 플렉시 유리를 사용하되 검은색 플렉시 유리를 사용하여 챔버를 분리하여 동물이 서로 못하도록 합니다.
    3. 와이어 간 거리가 8mm인 1mm 와이어로 만든 스테인리스 스틸 메쉬를 사용하여 테스트 케이지의 바닥과 천장을 만듭니다(그림 1).

2. 뒤 기계적인 감도 (BMS) 시험

  1. 첫 번째 테스트 전에 연속 5-7일 동안 하루 30분 동안 테스트 케이지에 동물을 익숙하게 하십시오. 필요에 따라 테스트를 반복합니다.
  2. 2% 이소플루란31 을 사용하여 동물을 마취시킨다( 재료 표 참조).
  3. 이소플루란 마취 하에 엎드린 자세에서 동물의 모발 트리머를 사용하여 관심 부위(T6에서 L6 척추 수준까지)의 뒷머리를 면도합니다( 재료 표 참조). 반복 측정의 경우 행동 평가 없이 하루에 3일마다 뒷머리를 면도하여 자극이 항상 피부에 직접 적용되도록 합니다. 영구 마커로 피부에 블랙 마크를 그려 다른 날에 테스트를 반복 할 때 필라멘트가 항상 같은 부위에 적용되도록합니다.
  4. 시험 당일, 동물이 진정될 때까지 시험 전 15-30분 동안 동물을 시험 케이지에 넣습니다.
  5. 테스트하는 동안 Von Frey 필라멘트(0.07, 0.16, 0.4, 0.6, 1, 2, 4, 6, 10, 15 및 26g)를 뒤쪽에 수직으로 도포하고 항상 2g 필라멘트로 시작하여 상하 방법15 를 사용합니다( 재료 표 참조). 동물 뒤에서 필라멘트로 동물의 뒤쪽에 천천히 접근하십시오.
    1. 동물이 깨어 있고 네 발에 서서 움직이지 않을 때만 필라멘트를 바르십시오. 15-30초마다 가시돌기(그림 2)에서 10mm 떨어진 관심 영역에 양측으로 2초 동안 필라멘트를 적용합니다.
      참고: 동물이 필라멘트를 바르는 동안 또는 그 직후에 다음 행동 중 하나 이상을 나타내면 반응이 양성으로 간주됩니다: (1) 근육 경련, (2) 아치형(등 신전), (3) 등을 보기 위해 목을 돌리기, (4) 등을 긁거나 핥기, (5) 탈출.
  6. 앞서도 15에서 설명한 바와 같이, 필라멘트의 적용으로 반응이 관찰되지 않으면, 직렬에서 더 높은 힘으로 다음 필라멘트를 인가한다. 응답이 관찰되면 계열에서 더 낮은 힘의 다음 필라멘트를 사용하십시오. 첫 번째 행동 변화 후 4개의 판독값을 얻을 때까지 이 절차를 계속합니다(일련의 "응답 없음" 후 응답 또는 일련의 "응답" 후 응답 없음).
  7. 데이터 수집이 완료되면 다음 공식을 사용하여 Chaplan et al.15에 설명된 대로 기계적 임계값의 50%를 나타내는 값을 계산합니다.
    50% 임계값(g) = 10(Xf+kδ)/10,000
    알림: 이 공식에서 "Xf"는 마지막으로 사용된 폰 프레이 필라멘트의 핸들 마크입니다. "k"는 동물의 반응 패턴15에 기초한 표 형식 값이고, "δ"는 폰 프레이 필라멘트 사이의 핸들 마크 증분의 평균이다. 실험 설계 및 실험 요구에 따라 척추의 한쪽만 평가하여 하나의 임계값을 보고하거나 두 측면을 평가하고 임계값을 별도로 또는 평균으로 보고할 수 있습니다. 계산 템플릿32에 대해서는 보충 표 1을 참조하십시오.

3. 동물 회복

  1. 근육 주사가 완료된 후 마취를 중단하고 회복을 위해 동물을 표준 하우징 케이지에 단독으로 두십시오.
  2. 회복 기간 동안 동물의 행동을 검사하고 방치하지 마십시오.
  3. 동물이 마취에서 회복되고 5 분 이내에 정상적으로 움직이는지 확인하십시오. 그런 다음 동물을 다른 동물과 함께 일반적인 하우징 케이지로 되돌립니다.
    참고: 실험이 끝나면 동물은 깊은 이소플루란 마취(5%) 하에 10% 포르말린 용액으로 심장을 통해 관류됩니다. 그런 다음 주입된 부위의 등 근육을 추출하여 조직학 및 염증 변화 확인을 수행합니다.

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결과

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이 방법은 CFA와 대조군 쥐 사이의 기계적 민감도를 비교하기 위해 전체 데이터와 통계가 제시된 이전 연구에서 사용되었습니다30. 이전 연구에 포함된 6마리의 래트로부터의 대표적인 개별 데이터(좌측 및 우측 역치의 평균)가 도 3 및 표 1에 제시되어 있다. 기준선에서 기계적 민감도는 그룹 간에 유사했습니다. 요추 근육에 CFA를 근육 주사하면 CFA 주사 후 7일에서 28일까지 기계적 민감도(역치 감소)가 현저히 증가했습니다. 대조적으로, 대조군(CTL) 쥐는 이러한 변화를 나타내지 않았습니다. 그림 3에서 볼 수 있듯이 이러한 유형의 행동 평가에서 예상한 대로 동물 내 및 동물 간의 변동성이 관찰되었습니다. 그러나 과민성 CFA 쥐는 변동성이 감소한 것으로 나타났습니다. 이전 연구 30에 기초하여, 16마리의 동물 (8 CFA 및 8 CTL)은 5...

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토론

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중요 단계
BMS 테스트는 변화가 발생할 것으로 예상되는 시점 (통증 모델) 또는 약리학 적 또는 비 약리학 적 개입 후에 한 시점 또는 며칠 또는 몇 주에 걸쳐 반복적으로 쥐의 등에서 기계적 민감도를 평가하는 간단한 방법입니다. 이 방법의 중요한 문제에는 테스트 케이지가 포함되며, 그 치수는 쥐가 편안하지만 너무 많이 움직이지 않도록 보장해야 합니다. 동물의 등은 재현 가능한 기계적 자극을 위해 메쉬 천장을 통해 접근할 수 있어야 합니다. 역치 평가의 변동성을 제한하려면 기계적 자극이 피부에 직접 적용되도록 조사 중인 등 부위를 면도해야 합니다. 또한 동일한 부위에 기계적 자극을 가하기 위해 피부를 표시해야 합니다. 마지막으로, 실험자는 동물에게 보이지 않도록 동물 뒤에서 피부에 필라멘트에 접근해야 합니다.

뒷발15,16에서 기계적 감도를...

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공개 사항

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저자는 이해 상충으로 이어질 수 있는 경쟁적인 이해 관계나 관계를 선언하지 않습니다.

감사의 글

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이 연구는 Fondation Chiropratique du Québec과 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회(MP: 보조금 #06659)의 보조금으로 지원되었습니다. 홍콩의 기여는 Université du Québec à Trois-Rivières (PAIR 프로그램)의 지원을 받았습니다. BP의 기여는 Fonds de recherche du Québec en Santé (FRQS)와 Fondation Chiropratique du Québec의 지원을 받았습니다. TP의 기여는 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회(Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada)의 지원을 받았습니다. NE와 EK의 기여는 Fondation Chiropratique du Québec의 지원을 받았습니다. MP의 기여는 FRQS에 의해 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Aerrane(이소플루란, USP) - 수의학 전용BaxterNDC 10019-773-60흡입 마취제 ; 마취 유도용
DIN 02225875 Complete Freund Adjuvant (CFA)Fisher Scientific#77140Mycobacterium butyricum의 사멸 세포를 가진 Complete Freund Adjuvant (CFA)의 유중수 에멀젼.
수컷 Wistar RatsCharles River Laboratories체중: 320– 450 g; 나이 : 18-22 주.
Penlon Sigma Delta 기화기Penlon990-VI5K-SVEEKPenlon Sigma Delta 기화기 마취에 사용
Sharpie 영구 마커SharpieBC23636영구 마커, 파인 포인트, 블랙
테스트 케이지맞춤형너비 : 20cm;  길이 : 50cm; 바닥에서 상단까지의 높이: 40cm; 하단 메쉬에서 케이지 상단까지의 높이 : 7cm; 벽 두께: 5mm; 메시: 1mm 와이어와 8mm 인터-와이어 거리     
폰 프레이 필라멘트에스테시오, 정확한 촉각 감각 평가기514000-20C필라멘트 0.07 g에서 26 g까지의
Wahl 전문 동물, ARCO 무선 애완 동물 클리퍼, 트리머 그루밍 WahlKit #8786-1201동물 털 트리머, 면도용, 제로 블레이드 

참고문헌

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