발색단의 존재 및 부재 하에 Cu(II)와 펩티드 잔기 사이의 결합 상호작용을 정량화하기

요약

이 기사는 펩티드 및 단백질에 결합하는 Cu (II)의 열역학을 조사하고 정량화하기 위해 전자 흡수 분광법 및 등온 적정 열량계의 사용에 중점을 둡니다.

초록

구리(II)는 생물학적 시스템에서 필수적인 금속으로, 그것이 상호작용하는 생체분자에 독특한 화학적 성질을 부여한다. 다양한 펩타이드에 직접 결합하고 매개구조에서 전자전달 특성, 촉매 기능 부여에 이르기까지 필요하고 병리학적인 역할을 모두 수행하는 것으로 보고되었다. 시험관 내에서 이러한 Cu(II)-펩티드 복합체의 결합 친화도 및 열역학을 정량화하는 것은 결합의 열역학적 추진력, 펩티드에 대한 상이한 금속 이온 사이의 또는 Cu(II)에 대한 상이한 펩티드 사이의 잠재적 경쟁, 및 생체내에서 Cu(II)-펩티드 복합체의 보급에 대한 통찰력을 제공한다. 그러나, 결합 열역학을 정량화하는 것은 적정 실험 내의 모든 경쟁 평형을 고려하는 것을 포함하여 무수한 요인들로 인해 어려울 수 있으며, 특히 펩티드, d-블록 금속 이온 및 이들의 상호작용을 나타내는 이산 분광학적 핸들이 부족한 경우에 더욱 그러하다.

여기에서, Cu(II)-펩티드 열역학의 정확한 정량화를 위한 강력한 실험 세트가 제공된다. 이 기사는 Cu (II)에 필요한 분광학적 핸들을 제공하고 라벨이없는 등온 적정 열량계의 사용을 제공하기 위해 염색체 리간드의 유무에 전자 흡수 분광법을 사용하는 데 중점을 둡니다. 두 실험 기술 모두에서, 모든 경쟁 평형을 설명하기 위해 프로세스가 설명된다. 이 기사의 초점은 Cu (II)에 있지만, 설명 된 일련의 실험은 Cu (II) - 펩티드 상호 작용을 넘어 적용 할 수 있으며 생리 학적 관련 조건 하에서 다른 금속 - 펩티드 시스템의 정확한 정량화를위한 프레임 워크를 제공 할 수 있습니다.

서론

생물학은 생명체가 주변 환경에 적응하고 생존하는 데 필요한 금속 이온의 다양한 화학을 활용하도록 진화했습니다. 단백질의 약 25%-50%가 구조와 기능을 위해 금속 이온을 사용한다¹. 금속 이온의 특정 역할 및 산화환원 상태는 이를 배위하는 생물학적 리간드의 조성 및 기하학적 구조와 직접적으로 관련된다. 또한, Cu(II)와 같은 산화환원 활성 금속 이온은 반응성 산소 종(ROS)^2,3,4를 형성하기 위해 펜톤과 같은 화학을 통해 산화제와 상호작용하지 않도록 엄격하게 조절되어야 한다. 생화학을 주도하는 결합 모드와 친화도를 이해하면 금속 이온의 생물학적 역할을 밝히는 데 도움이됩니다.

많은 기술이 금속과 펩티드의 결합 상호작용을 연구하기 위해 사용된다. 이들은 대부분 분광학적 기술이지만 아밀로이드 베타 (Aβ)⁵의 단편과의 Cu (II) 상호 작용을 통해 볼 수 있듯이 분자 역학을 사용하는 컴퓨터 시뮬레이션도 포함합니다. 많은 대학에서 접근 할 수있는 널리 사용되는 분광 기술은....

프로토콜

1. 전자 흡수 분광법 : 완충 경쟁을 통한 직접 적정

1. 시료 준비
   1. 초순수 (>18 MΩ 저항)를 사용하여 pH 7.4에서 50 mM 2-[비스(2-히드록시에틸)아미노]-2-(히드록시메틸)프로판-1,3-디올 (비스트리스)의 완충 용액을 제조하였다. 후속 여과와 함께 적어도 2시간 동안 고친화성 수지와 함께 인큐베이션함으로써 미량 금속 이온을 제거한다.
   2. 공지된 양의 펩티드를 무금속 완충제 내로 용해 또는 희석시킨다.
      참고: 작은 흡광 계수²¹을 갖는 d-d 밴드를 모니터링할 때, 더 높은 농도의 펩티드가 사용되어야 한다. 여기서, 완충용액 중의 C-펩티드의 최종 농도는 300 μM이었다(부피는 큐벳의 크기에 따라 달라진다). C-펩티드는 고체상 펩티드 합성에 의해 합성되었고, 문헌¹⁴의 다른 곳에서 상술되어 있다.
   3. 알려진 질량의_CuCl2 를 초순수에 용해시켜 10-15 mM에서 용액을 만든다.
      참고 : 침전을 방지하기 위해 처음에는 금속염을 완충되지 않은 물에 용해시키는 것이 중요합니다. 다른 Cu(II) 염이 사용될 수 있지만, 음이온이 약하게 배위되도록 하기 위해 주의를 기울여....

결과

목표는 전자 흡수 분광법 및 ITC의 상보적 기술을 사용하여 C-펩티드에 결합하는 Cu(II)의 열역학을 정량화하고 확증하는 것이었다. 전자 흡수 분광법의 견고한 특성으로 인해, Cu(II)를 300 μM C-펩티드로 직접 적정을 수행하였다(도 1). 150 μM의 Cu(II)의 첨가는 Cu(II)의 d-d 밴드에 기인하여 600 nm에서 밴드의 즉각적인 증가를 야기하고, 300 μM Cu(II)가 첨가될 때까지 계속 증가하였다. 추가로 300 μM 이상의 Cu(II)를 첨가해도 d-d 밴드의 흡수가 증가하지 않았으며, 이는 포화를 나타내고 Cu(II)가 1:1 복합체에서 C-펩티드에 결합한다는 것을 나타낸다. 또한, Cu(II)에 결합하기 위한 비스-트리스의 비교적 높은 친화도로 인해(log K = 5.27)¹⁶, Cu(II)/C-펩티드 친화도는 금속 이온을 완충액으로부터 멀리 떨어뜨리기 위해 마이크로몰 범위(log K>6)에.......

토론

이 글은 펩티드에 대한 Cu(II) 결합의 친화도 및 열역학을 정량화하기 위한 강력한 방법을 제공한다. Cu(II)를 갖는 착물은^d9 전자 구성으로 인해 금속 부위에서 d-d 흡수 밴드를 모니터링하는 데 이상적으로 적합하다. 비록 소멸 계수가 작고, 따라서 신뢰할 수 있는 신호를 산출하기 위해 복합체의 더 큰 농도가 필요하지만, 펩티드로의 Cu(II)의 적정은 결합 화학량론과 근사 결합 친화도에 대한 통찰력을 신속하게 제공할 수 있다. 그러나 금속이 버퍼와 펩타이드 모두에서 유사한 원자와 기하학에 의해 배위되는 경우 스펙트럼의 차이를 식별하는 것은 어려울 수 있습니다. 결합 친화도를 정량적으로 결정하기 위해, 펜과 같은 염색체 리간드는 금속 이온(²¹)과의 대칭-허용된 전하 전달로 인해 종종 사용된다. 염색체 리간드와 비염색체 펩티드 사이의 경쟁을 설정하고 리간드에 대한 금속의 친화도를 알면, 금속-펩티드 친화도를 직접 결정할 수 있다. 전자 흡수 분광법을 이용한 추.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1,10-phenanthroline	Sigma Aldrich	131377-25G
bis-Tris buffer	Fisher	BP301-100
Bottle-top 0.45 micron membrane	Nalgene	296-4545	오염 물질을 유입시키지 않고 수지를 제거하는 모든 여과 시스템이 허용됩니다
구리(II)	Alfa Aesar	12458
EDTA	Sigma Aldrich	EDS-500G
전자 흡수 분광 광도계	Varian	Cary 5000	또 다른 적합한 민감성 분광 광도계는 허용
고 친화력 수지	: 시그마 Aldrich	C7901-25G
등온 적정 열량계 (ITC)	TA 기기	나노 ITC 저용량
ITC 분석 소프트웨어	TA 기기	NanoAnalyze	SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137– 148)
ITC 소프트웨어	: TA Instruments	ITCRun
경량 섬세함 와이퍼	Kimwipe	34155
로딩 주사기	Hamilton	Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL
매칭 큐벳	Starna Cells, Inc	16.100-Q-10/Z20	소량 큐벳의 창이 분광 광도계
MOPS 버퍼	Alfa Aesar	A12914
분광 광도계 소프트웨어	Cary	WinUV 스캔
스프레드시트 프로그램	Microsoft	Excel	어떤 적합한 스프레드시트 프로그램도 작동합니다
적정 주사기	TA Instruments	5346
초순수	Millipore Sigma	Milli-Q	>18 M&Omega만 있으면 어떤 물도 괜찮습니다.; 저항

염화 가능한 , 도 사용할 수 있습니다 의 빔 높이와 일치하는지 확인.