우리는 인간의 치아에서 시작하여 상피 오가노이드 문화를 개발하기위한 프로토콜을 제시합니다. 오가노이드는 견고하게 확장 가능하며 아멜로아세포 분화 능력을 포함하여 치아의 상피 줄기 세포를 재생산합니다. 독특한 오가노이드 모델은 치아 재생 접근법에 대한 관점으로 인간 치과 (줄기 세포) 생물학을 연구 할 수있는 유망한 도구를 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
치아는 음식 매스틱 화와 연설뿐만 아니라 심리적 안녕을 위해 삶에서 매우 중요합니다. 인간의 치아 발달과 생물학에 대한 지식은 부족합니다. 특히, 치아의 상피 줄기 세포와 그 기능에 대해서는 많이 알려져 있지 않다. 우리는 인간의 치아 조직 (즉, 추출 된 사랑니에서 분리 된 치과 모낭)에서 시작하여 새로운 오가노이드 모델을 개발하는 데 성공했습니다. 오가노이드는 견고하고 장기간 확장 가능하며 기능적 활성뿐만 아니라 마커 발현 측면에서 제안 된 인간 치아 상피 줄기 세포 구획을 재구성합니다. 특히, 오가노이드는 아멜로제닉 동안 생체내에서 발생하는 것으로서 아멜로아세포 분화 과정을 전개할 수 있다. 이 독특한 오가노이드 모델은 인간의 치아 발달뿐만 아니라 치과 병리학을 연구 할 수있는 강력한 도구를 제공 할 것이며 치아 재생 요법으로 나아갈 길을 열어 줄 수 있습니다. 이 새로운 오가노이드 모델을 기반으로 잃어버린 치아를 생물학적 치아로 대체하는 것은 합성 물질의 현재 표준 이식에 대한 매력적인 대안이 될 수 있습니다.
서론
치아는 음식 매스틱화, 연설 및 심리적 웰빙 (자기 이미지)에 필수적인 역할을합니다. 인간의 치아는 다양한 밀도와 경도의 고도로 미네랄화 된 조직으로 구성됩니다1. 치아 크라운의 주요 구성 요소 인 치과 에나멜은 인체에서 가장 높은 미네랄 화 된 조직입니다. 에나멜 형성 (amelogenesis) 동안, 치아가 발달 할 때, 치과 상피 줄기 세포 (DESCs)는 에나멜 형성 세포 (아멜로 아세포)로 분화됩니다. 일단 형성되면, 에나멜은 치아 분출 시작시 아멜로 아멜 세포의 사멸 적 손실로 인해 거의 수리되거나 갱신되지 않습니다1. 외상이나 박테리아 질환으로 인한 손상된 에나멜 조직의 복원은 현재 합성 물질을 사용하여 수행됩니다. 그러나 이들은 미세 누출, 열등한 골유착 및 앵커리지, 유한 수명 및 완전한 기능 수리 부족과 같은 중요한 단점으로 인해 어려움을 겪고 있습니다2. 따라서 아멜로아세포를 생성할 수 있는 능력과 미네랄화된 조직을 생산할 수 있는 잠재력을 갖춘 인간 DESC의 견고하고 신뢰할 수 있는 문화는 치과 재생 분야에서 중요한 진전이 될 것입니다.
인간 DESC 표현형과 생물학적 기능에 대한 지식은
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프로토콜
여기에 설명 된 모든 방법은 윤리위원회 연구 UZ / KU 루벤 (13/0104U)의 승인을 받았습니다. 추출된 세 번째 어금니(사랑니)는 환자의 정보에 입각한 동의 후에 얻어졌다.
1. 준비
- 48-웰 배양 플레이트를 37°C에서 1.9%CO2 인큐베이터에서 15-20 h 동안 예열한다.
- 액화된 마트리겔 분취량 (성장 인자-환원; 페놀 적색-무함유; 추가로 기저막 매트릭스로 지칭됨; BMM) 단계 2.1 이전에 최소 2시간 동안 얼음(4°C) 상에서.
참고: BMM의 동결/해동 사이클을 피하십시오. BMM을 마이크로원심분리 튜브에서 1 mL의 얼음 및 분취량에 15-20 h 동안 액화시키고 -20°C에서 보관한다. - 원심분리기를 4°C로 냉각시킨다.
- 매체를 준비하고 0.22 μm 필터를 통해 용액을 여과하십시오. 다음 볼륨은 일반적으로 동시에 추출되는 네 개의 세 번째 어금니로부터의 DF의 수집을 기반으로 합니다.
- 20 mL의 DF 수집 배지를 준비한다(표 1): 10% 소 태아 혈청(FBS), 0.5% 암포테리신 B 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 최소 필수 배지....
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결과
치아 오가노이드 발달
우리는 사랑니 추출 후 획득 한 인간 DF 조직에서 오가노이드 배양을 확립하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다 (그림 1A). 단리된 DF는 효소적으로 및 기계적으로 해리된다. 수득된 세포는 최적의 오가노이드 발달 및 성장을 위해 경험적으로 정의되었던 배지에서 BMM 내에서 배양된다 (치아 오가노이드 배지; 톰)19.
오가노이드는 전형적으로 DF 세포 시딩 후 2주 이내에 발달한다(P0; 도 2A). 오가노이드는 장기간 확장 가능(지금까지 최대 11개 통로)입니다(그림 2B, P4 참조). BMM 액적 당 약 20,000 개의 세포를 시딩하는 것은 (P0 및 추가 계대 모두에서) 오가노이드의 최적 밀도를 산출하는 반면(그림.......
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토론
이 프로토콜은 인간 치아에서 시작하는 오가노이드의 효율적이고 재현 가능한 생성을 설명합니다. 우리의 지식에 따르면, 이것은 인간의 치과 조직에서 시작하여 현재 개념 (상피) 오가노이드를 확립하기위한 첫 번째 방법론입니다. 오가노이드는 장기간 팽창이 가능하며 치아 상피 줄기 표현형을 나타내며, DF7의 ERM 구획에서 이전에 보고된 DESC를 복제한다. 더욱이, 오가노이드는 아멜로아세포 분화 과정 7,25,26의 전개를 포함하는 기능적 DESC/ERM 특성을 복제한다. 연구 결과는 독립적 인 환자 오가노이드 라인19에서 유사한 결과가 발견되었으므로 강력합니다.
이 치아 오가노이드 프로토콜을 실행할 때 몇 가지 중요한 사항을 고려해야.......
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공개 사항
해당 저자는 모든 저자가 모든 이해 상충을 공개했는지 확인합니다.
감사의 글
우리는 UZ Leuven의 구강 및 악안면 수술 (MKA)의 모든 직원과 환자들에게 갓 추출 된 세 번째 어금니를 수집하는 데 귀중한 도움을 주신 것에 감사드립니다. 우리는 또한 샘플 수집에 도움을 주신 Reinhilde Jacobs 박사와 Elisabeth Tijskens 박사에게 감사드립니다. 이 작품은 KU Leuven (BOF)과 FWO-Flanders (G061819N)의 보조금으로 지원되었습니다. L.H.는 FWO Ph.D. 펠로우(1S84718N)입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브 | Eppendorf | 30120.086 | |
| 15 mL 원심분리기 튜브 | Corning | 430052 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-6250 | |
| 48웰 평면 바닥 플레이트 | Corning | 3548 | |
| 50 mL 원심분리기 튜브 | Corning | 430290 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | ||
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| 알부민 소 (세포 배양 등급) | Serva | 47330.03 | |
| AMELX 항체 | Santa Cruz | sc-365284 | |
| Amphotericin B | Gibco 15200018 | ||
| B27 (비타민 A 제외) | Gibco | 12587-010 | |
| 카세트 | VWR | ||
| 소 간에서 추출한 7202191 카탈라아제 | Sigma-Aldrich | C100 | |
| CD44 항체 | Abcam | ab34485 | |
| Cell strainer, 40 µ m | Falcon | 352340 | |
| 콜레라 독소 | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| 구연산 | Sigma-Aldrich | C0759 | |
| CK14 항체 | Thermo Fisher Scientific | MA5-11599 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| 커버 유리 | VWR | 6310146 | |
| Cryobox | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | |
| DMEM 1:1 F12 without Fe | Invitrogen | 074-90715A | |
| DMEM powder high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Dnase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | |
| 당나귀 세럼 | Sigma-Aldrich | D9663 - 10ML | |
| 임베딩 워크스테이션, 220에서 240 | Vac Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| 에탄올 앱솔루트, ≥ 99.8% (EtOH) | 피셔 케미컬 | E/0650DF/15 | |
| 소 태아 혈청(FBS) | 시그마-알드리치 | F7524 | |
| FGF10 | 페프로텍 | 100-26 | |
| FGF2 (= 기본 FGF) | R& D Systems | 234-FSE-025 | |
| FGF8 | Peprotech | AF-100-25 | |
| GenElute 포유류 총 RNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | RTN350-1KT | 포함 1% &베타;-메르캅토에탄올 |
| 용해 완충액 유리 파스퇴르 피펫 | Niko Mechanisms | 170-40050 | |
| Glycine | VWR | 101194M | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| IGF-1 | PeproTech | 100-11 | |
| InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI) | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| 소 췌장에서 추출한 인슐린 | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| ITGA6 항체 | Sigma-Aldrich | HPA012696 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Matrigel (성장 인자 감소; 페놀 레드-프리) | Corning | 15505739 | |
| 현미경 슬라이드 | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Millex-GV 주사기 필터 유닛, 0.22 &뮤; m | Millipore | SLGV033R | |
| 최소 필수 매체 독수리 (α MEM) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| 마우스 IgG(Alexa 555) 2차 항체 | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| N-아세틸 L-시스테인 | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| 니코틴아미드 | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| P63 항체 | Abcam | ab124762 | |
| Pap Pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | 마킹 펜 |
| 파라포름알데히드(PFA), 16% | Merck | 8.18715 | |
| 페니실린 G 나트륨염 | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| 페니실린-스트렙토마이신(Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| 페트리 접시 | Corning | 353002 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Pipette (P20, P200, P1000) | Eppendorf 또는 기타 | 2231300006 | |
| 플라스틱 이송 pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.001 | |
| Rabbit IgG (Alexa 488) 2차 항체 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| RSPO1 | PeproTech | 120-38 | |
| SB202190 (p38i) | Biotechne (Tocris) | 1264 | |
| Scalpel (surgical blade) | Swann-Morton | 207 | |
| SHH | R& D Systems | 464-SH-200 | |
| 실리콘 몰드(가열 블록) | VWR | 720-1918 | |
| 염화나트륨(NaCl) | BDH | 102415K | |
| 탄산수소나트륨(NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| 나트륨-피루베이트(C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P-5280 | |
| SOX2 항체 | Abcam | ab92494 | |
| StepOnePlus | Thermo Fisher Scientific | Real-Time PCR 시스템 | |
| Stericup-GP, 0.22 µ m | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP 멸균 원심분리기 튜브 상단 필터 유닛, 0.22 μ m | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile 1000 μ 필터가 있는 L 피펫 팁 | Greiner | 740288 | |
| Sterile 20 μ 필터가 있는 L 피펫 팁 | Greiner | 774288 | |
| Sterile 200 μ L 피펫 팁(필터 포함/미포함 | Greiner | 739288 | |
| Sterile H2O | Fresenius | B230531 | |
| 스트렙토마이신 설페이트 염 | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Superscript III first-strand synthesis supermix | Invitrogen | 11752-050 | 역전사 키트 |
| 조직 처리기 | Thermo Scientific | ||
| Transferrin | Serva | 36760.01 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| TrypLE express | Gibco | 12605-010 | |
| Vectashield 장착 매체 + DAPI | Labconsult NV | H-1200 | |
| 이 포함 된 페이드 방지 장착 매체자일렌, 99%, 생화학 및 조직학 VWR | 2,89,75,325 |
참고문헌
- Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development (Cambridge). 147 (2), (2020).
- Arrow, P. Dental enamel defects, caries experience and oral health....
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