이 프로토콜은 단일 실험 내에서 35kb만큼 큰 고유한 miRNA 클러스터 부재 결실 조합을 운반하는 유전자 변형 세포주 패널의 신속한 생성을 가능하게 하는 마이크로RNA 클러스터 네트워크 분석을 위한 고처리량 클러스터 규칙적인 간격 간 짧은 팰린드로믹 반복(CRISPR) 유전자 편집 워크플로우를 기술합니다.
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이 논문에서
요약
초록
MicroRNA (miRNAs)는 암 및 전이의 중요한 세포 조절자 (종양 억제제, 발암 유발 인자)로 부상했습니다. 대부분의 발표 된 연구는 암에서 작은 RNA의 역할을 특성화 할 때 단일 miRNA에 중점을 둡니다. 그러나, 인간 miRNA 유전자의 ~30%는 종종 공동-발현되는 클러스터된 단위로 조직되며, 이는 비코딩 RNA 조절의 복잡하고 배위된 시스템을 나타낸다. 클러스터링된 miRNA 네트워크가 종양 성장, 암 공격성 및 약물 내성을 조절하기 위해 어떻게 협력적으로 기능하는지에 대한 명확한 과소평가는 비코딩된 작은 RNA를 클리닉으로 번역하기 전에 필요하다.
전립선암의 맥락에서 ∼35,000 bp 길이에 걸쳐 있는 유전자좌 내에 위치한 일곱 miRNA 유전자의 게놈 클러스터의 종양원성 역할을 연구하기 위해 고처리량 클러스터가 규칙적으로 간격이 짧은 팰린드로믹 반복(CRISPR)-매개 유전자 편집절차의 사용을 이용하였다. 이러한 접근법을 위해, 인간 암 세포주를 48시간 동안 DOX 함유 배지에서 성장시킨 독시사이클린(DOX)-유도성 Cas9 뉴클레아제에 대한 렌티바이러스 벡터로 감염시켰다. 세포를 후속적으로 게놈 부위와 복합체화된 합성 트랜스활성화 CRISPR RNA (tracrRNA) 올리고뉴클레오티드로 공동-형질감염시켜 전체 miRNA 클러스터를 운반하는 암 세포주의 신속한 생성을 허용하여 단일 실험 내에서 결실 및 개별 또는 조합 miRNA 유전자 클러스터 결실을 허용하였다.
이 고처리량 유전자 편집 시스템의 장점은 시간이 많이 걸리는 DNA 벡터 서브클로닝을 피할 수 있는 능력, 24-웰 포맷의 고유한 가이드 RNA 조합으로 세포를 형질감염시킬 때의 유연성, 조세포 용해물을 사용한 저비용 PCR 유전자형화입니다. 이 간소화 된 접근법을 사용하는 연구는 miRNA 클러스터 구성원 간의 기능적 중복성 및 시너지 효과 / 적대적 상호 작용을 밝혀 낼 것을 약속하며, 이는 인간 질병과 관련된 복잡한 작은 비 코딩 RNA 네트워크를 특성화하고 미래의 치료 설계를보다 잘 알리는 데 도움이 될 것입니다.
서론
인간 질병에서 비코딩 RNA의 기여도를 조사하기 위해서는 더 나은 연구 도구가 필요하다. MiRNA 조절 이상은 암 환자의 조직 및 체액(예를 들어, 혈액, 소변)에서 이러한 작은 비코딩 RNA의 발현 프로필을 비암, 건강한 개인과 비교할 때 암과 같은 인간 장애에서 종종 관찰되며, 마이크로어레이, 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR) 및 차세대 심층 시퀀싱 기술 1,2를 채택한다. . 최근의 연구는 종양 형성, 질병 진행 및 약물 내성을 조절하는 종양 억제자, 종양형성 및 전이 인자로서 이들 miRNAs의 큰 서브세트를 특성화하였다. miRNA의 실험적 과발현 및/또는 하향조절/손실은 세포에서 기능적 및 pleiotropic 결과를 초래하며, 이러한 비코딩 RNA가 조정하는 광범위한 암 관련 활동(성장, 아폽토시스, 분화, 염색질 리모델링, 혈관신생, 상피-중간엽 (EMT) 및 MET 전이, 대사 및 면역 반응3.
MiRNAs는 단일 유전자로서 코딩되거나 게놈 클러스터에 상주하며, 이는 핵에 전사되고 생물학적으로 성숙한, 세포질4에 국소화된 22개의 뉴....
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프로토콜
1. CRISPR 유전자 편집을 위한 준비 및 miRNA 클러스터 녹아웃 세포주를 생성하기 위한 가이드 RNA 설계
- DNA 서열 주석 소프트웨어 프로그램(19)을 사용하여 관심 대상 miRNA 클러스터 영역(intergenic, intronic) 및 적어도 1 kB의 주변 게놈 영역의 완전한 게놈 서열을 포함하는 DNA 파일을 생성한다.
- 생성된 DNA 파일의 특징 편집 도구를 사용하여 miRNA 클러스터에 속하는 표적 miRNA 클러스터 유전자좌(인터제닉, 인트로닉) 및 각 개별 miRNA 헤어핀 서열을 표시하고 근처의 다른 코딩 및 비코딩 유전자 및/또는 조절 기능 5,20,21,22에 표시하십시오.
- 결실을 목표로 하는 miRNA 영역이 근처의 단백질 코딩 유전자, 비코딩 유전자 또는 중요한 조절 DNA 요소를 실수로 방해하지 않도록 합니다.
참고: 이 프로토콜에 사용된 세포주의 게놈 복잡성(예를 들어, 염....
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결과
이 고처리량 CRISPR 결실 프로토콜은 전립선암의 맥락에서 연구된 miR-888 클러스터를 표적화하는 합성 올리고뉴클레오티드 가이드 RNA와 함께 Cas9 유도성 LNCaP 및 PC3-ML 인간 암 세포주의 형질감염을 사용하여 성공적으로 채택되었다. miR-888 클러스터는 발현 프로파일링 스크린에서 저등급 및 비암 환자 9,10명에 비해 고등급 질환을 가진 전립선암 환자에서 상승되는 것으로 초기에 확인되었다. 35,124 bp에 걸친 miR-888 클러스터는 인간 염색체 Xq27.3 상의 7개의 miRNA(miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b 및 -891a)로 구성된다(그림 2A). 이 유전자좌는 HPCX1 (유전성 전립선 암, X 연결 1, Xq27-28) 내에 있으며, 이는 유전성 전립선 암11,.......
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토론
이 CRISPR 유전자 편집 절차를 통해 조사자는 독특한 miRNA 클러스터 결실 조합을 운반하는 세포주의 전체 패널을 신속하게 생성 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 합성 tracrRNA (1:1 몰비)로 어닐링된 5' 및 3' 게놈 부위 특이적 crRNA로 구성된 합성 가이드 RNA의 형질감염은 시간이 많이 걸리는 플라스미드 벡터 서브클로닝을 방지하고 24-웰 포맷을 사용하여보다 유연하고 높은 처리량의 실험 설계를 가능하게합니다. DOX 유도성 Cas9 렌티바이러스 카세트를 운반하는 세포주의 생성은 가이드 RNA의 세포 형질감염 동안 단단히 DOX 조절되고 강력한 Cas9 발현을 가능하게 하고, 후속 단계에서 배양 배지로부터 DOX 철수시 이 박테리아 단백질의 신속한 제거를 가능하게 한다. 이 절차는 또한 분석을 위해 최소한의 세포 물질을 필요로하고 비용이 많이 들고 노동 집약적 인 실리카 컬럼 DNA 정제 방법의 사용이나 분광 광도계를 사용하여 핵산 농도를 측정 할 필요성을 피하고 조사자를위한 방법을 더욱 간소화하는 PCR.......
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
PC3-ML 세포주는 Mark Stearn(Drexel University College of Medicine)에 의해 친절하게 제공되었다. 저스틴 톡시는 PCR 유전자형을 도왔다. 이 작업은 Breedan Adams Foundation Grant, Ryan Translational Research Fund 및 Commonwealth Health Research Board Grant (CHRB-274-11-20)가 AE-K에 의해 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.2 mL PCR 튜브, 플랫 캡 | Fisher | 14-230-225 | 플라스틱웨어 |
| 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브 | Seal-Rite | 1615-5500 | 플라스틱웨어 |
| 24-웰 조직 배양 플레이트 | Corning Costar | 09761146 | 플라스틱 용기 |
| 5x Phusion HF Buffer | Thermo Scientific | F-518L | PCR 시약, 유전형 분석 |
| 6-웰 조직 배양 플레이트 | Fisher | FB012927 | Plasticware |
| 96-웰 조직 배양 플레이트 | Falcon | 08-772-2C | Plasticware |
| Anti-CRISPR-Cas9 항체 [7A9-3A3], 마우스 단클론 | AbCam | ab191468 | 웨스턴 블롯 시약; 160 kDa; 희석 1:200 |
| 항생제-항진균제(100x) | Gibco | 15240062 | Tisuue 배양 시약 |
| BLAST 뉴클레오티드 검색 엔진 | National Center for Biotechnology Information | NA | 프리웨어;웹사이트: blast.ncbi.nlm.nih.gov |
| Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenes | Calbiochem | CAS 589205 | CRISPR 시약; 화학, 작업 재고 = 물 중 1 mg/mL |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Invitrogen | A50298 | Equipment; 세포 계수기 |
| 극저온 튜브 | Thermo Scientific | 50001012 | Plasticware |
| Dharmacon CRISPR, Design Tool | Horizon Discovery Ltd. | NA | 프리웨어; 웹사이트: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer |
| DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2 | Dharmacon, Inc. | T-2002-02 | 형질주입 시약; LNCaP 및 PC3-ML 세포주 |
| 디메틸설폭사이드(DMSO) | Fisher | BP231100 | |
| L-글루타민, 4.5g/L 포도당 및 나트륨 피루브산 | 코닝 | 을 | MT10013CV Tisuue 배양 시약; PC3-ML 세포용 매체 |
| Doxycycline Hydrochloride, Ready Made Solution | Sigma-Aldrich | D3072-1ML | CRISPR 시약; 화학, 작업 재고 = 물 중 1 mg/mL 재고 |
| DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음 | Gibco | 14190144 | Tisuue 배양 시약 |
| Edit-R CRISPR-Cas9 합성 tracrRNA, 20 nmol, 설계 | Dharmacon, Inc. | U-002005-20 | CRISPR 시약; 범용 tracrRNA 올리고뉴클레오티드 |
| Edit-R Modified Synthetic crRNA, 탈염/탈보호, 2 nmol | Dharmacon, Inc. | crRNA-460XXX | CRISPR 시약; 설계된 crRNA 올리고뉴클레오티드 |
| EditR 유도성 렌티바이러스 hEF1aBlastCas9 뉴클레아제 입자, 50 μ L, 107 TU/mL | Dharmacon, Inc. | VCAS11227 | CRISPR 시약; 렌티-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system |
| Ensembl genomic viewer | Ensembl | NA | Freeware; 웹사이트: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and around gene/regulatory sequence. |
| GAPDH 항체 (FL-335), 토끼 다클론 | Santa Cruz Biotechnology | sc25778 | 웨스턴 블롯 시약; 37 kDa; 희석 1:500 |
| 겔/PCR DNA 단편 추출 키트 | IBI Scientific | IB47010 | 핵산 겔 전기영동 시약 |
| Gibco Fetal Bovine Serum, 인증 | Gibco | 16000044 | Tisuue 배양 시약 |
| Hexadimethrine bromide | MilliporeSigma | H9268 | CRISPR 시약; 화학, 작업 재고 = 0.8 mg/mL |
| Immobilon-FL PVDF Membrane | MilliporeSigma | IPFL10100 | 웨스턴 블롯 시약; 니트로셀룰로오스 |
| 차단(TBS) 차단 버퍼 | LI-COR | 927-60001 | 웨스턴 블롯 시약 |
| IRDye 680RD 염소 안티 마우스 IgG 2차 항체 | LI-COR | 926-68070 | 웨스턴 블롯 시약 |
| IRDye 800CW 염소 안티 토끼 IgG 2차 항체 | LI-COR | 926-32211 | 웨스턴 블롯 시약 |
| 마이크로 원심분리기 | Eppendorf | 5425 R | Plasticware |
| miRBase microRNA viewer | miRBase | NA | 프리웨어; 웹사이트: [mirbase.org] 사용: Borowser는 10kb 이내의 모든 주석이 달린 miRNA 헤어핀, 성숙한 miRNA 염기서열 및 관련 클러스터형 miRNA 매핑을 나열합니다. |
| NuPAGE 4 - 12%, Bis-Tris, 1.0mm, 미니 단백질 겔, 10웰 | Invitrogen | NP0321BOX | 웨스턴 블롯 시약 |
| Odyssey CLx 이미징 시스템 | LI-COR | CLx | 장비; 웨스턴 블롯 이미징 |
| Opti-MEM 감소 혈청 매체 | Gibco | 31985062 | 형질 주입 시약 |
| 올빼미 D2 와이드 젤 전기 영동 시스템 | 올빼미 | D2-BP | 장비; 핵산 겔 전기영동 시스템 |
| PCR 프라이머, 설계(단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드) | 통합 DNA 기술 | NA | PCR 시약, 유전형 분석 |
| Phusion High-Fidelity DNA 중합효소(2 U/µ L) | Thermo Scientific | F530S | PCR 시약, 유전형 분석 |
| RIPA Lysis Buffer 10x | MilliporeSigma | 20-188 | 웨스턴 블롯 시약 |
| Proteinase K 용액(20 mg/mL), RNA 등급 | Invitrogen | 25530049 | PCR 시약, 유전형 분석 |
| RNase A, DNase 및 프로테아제 무함유(10 mg/mL) | Thermo Scientific | EN0531 | PCR 시약, 유전형 분석 |
| RPMI 1640 배지 | Gibco | MT10041CV | Tisuue 배양 시약; LNCaP 세포용 미디어 |
| SnapGene Viewer | Snap Gene | NA | 프리웨어; 웹사이트: [snapgene.com] 사용: DNA 염기서열 주석 소프트웨어 프로그램을 사용하여 gRNA 설계를 위한 DNA 파일을 생성하고 miRNA 클러스터 유전자 자리(intergenic, intronic), miRNA 클러스터에 속하는 각 개별 miRNA 헤어핀 서열, 기타 인근 코딩 및 비코딩 유전자 및/또는 조절 기능 |
| TrypLE Select Enzyme (1x), 페놀 레드 | Gibco | 12563029 | Tisuue 배양 시약 없음; 재조합 트립신 |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | 핵산 젤, 전기 영동 시약 |
| Veriti, 96-Well Fast Thermal Cycler | , ThermoFisher, Scientific | 4375305 | 장비 |
| XCell, SureLock 미니 세포 전기 영동 시스템 | Invitrogen | EI0001 | 장비; 단백질 겔 전기영동 시스템 |
참고문헌
- Hasegawa, T., Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Translating MicroRNAs to the Clinic. Laurence, J. , Academic Press. 329-369 (2017).
- Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Systems Biology of Cancer. Thiagalingam, S. , Cambridge University Press. Ch. 9 134-153 (2015).
- Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J.
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재인쇄 및 허가
