골격근의 지질 액적 함량의 섬유 유형 및 세포내 특이적 분석

요약

증가하는 증거는 골격근 내부의 지질의 과도한 침투가 지방 독성과 당뇨병을 초래한다는 것을 나타냅니다. 여기에서, 우리는 조직 처리, Bodipy로 염색, 이미지 획득 및 분석을 포함하는 완전한 프로토콜을 제시하여 섬유 유형 특이적 방식으로 지질 방울의 크기, 밀도 및 세포 내 분포를 정량화한다.

초록

근막증으로 알려진 골격근 지질 침투는 비만과 노화에 따라 증가합니다. 근막증은 또한 최근에 심혈관 질환 및 암과 같은 여러 다른 장애에 대한 부정적인 예후 인자로 발견되었습니다. 과도한 지질 침투는 근육 질량과 힘을 감소시킵니다. 또한 총 교내 세포 지질 함량, 지질 액적 (LD) 형태 및 아세포 분포에 따라 지방 독성 및 인슐린 저항성을 초래합니다. 섬유 유형 (산화 대 글리콜 성)도 중요한데, 산화 섬유는 지질을 활용할 수있는 능력이 더 크기 때문입니다. 병태생리학에 중요한 영향을 미치기 때문에 LD 역학과 섬유 유형별 기능에 대한 심층적 인 연구가 보장됩니다.

본원에서, 섬유유형별 방식으로 교내 지질 함량의 정량화 및 LD 형태학 및 아세포 분포의 분석을 위한 완전한 프로토콜이 제시된다. 이를 위해, 직렬 근육 동결절편을 형광 염료 보디피 및 미오신 중쇄 이소형에 대한 항체로 염색하였다. 이 프로토콜은 서로 다른 근육을 동시에 처리하여 시간을 절약하고 가능한 아티팩트를 피할 수 있으며 피지에서 생성 된 개인화 된 매크로 덕분에 LD 분석의 자동화도 가능합니다.

서론

근막증으로 알려진 골격근 지질 침투는 비만과 노화에 따라 증가합니다. 근막증은 근육량과 강도 및 인슐린 민감성과 부정적인 상관 관계가 있습니다¹. 더욱이, 최근의 연구들은 근막증의 정도가 심혈관 질환², 비알콜성 지방간 질환³ 또는 암⁴과 같은 다른 병태에 대한 예후 인자로서 사용될 수 있음을 나타낸다. 지질은 근세포 외 지질로서 또는 섬유 내에서, 근세포 내 지질(IMCLs)로서 근섬유 사이의 골격근에 축적될 수 있다. IMCL은 주로 신체 운동 ^5,6 동안 대사 연료로 사용되는 지질 방울 (LDs)의 트리글리 세라이드로 저장됩니다. 그러나 지질 공급이 수요를 초과하거나 미토콘드리아가 기능 장애가되면 IMCL은 대사 적으로 건강에 좋지 않은 비만인 개인 및 제 2 형 당뇨병 환자⁷에서 볼 수 있듯이 근육 인슐린 저항성에 연루됩니다. 흥미롭게도, 지구력 운동 선수는 높은 인슐린 민감성을 유지하면서 제 2 형 당뇨병을 앓고있는 비만 환자에서 발견되는 것과 비슷한 수준의 IMCL을 가지고 있습니다. 이 현상은 "운동 선수의 역설"^8,9로 묘사되며, 크기, 밀도, 국소화^, 역학 및 지질 종 구성과 관련된 근육 LDs에 대한보다 미묘한 평가에 의해 설명됩니다.

첫째, LD 크기는 인슐린 민감성 및 체력^10,11과 반비례하여 상관관계가 ^있다. 실제로, 더 작은 LD는 리파아제 작용에 대해 상대적으로 더 큰 표면적을 나타내므로, 잠재적으로 지질⁽¹²)을 동원할 수 있는 더 큰 능력을 갖는다. 둘째, LD 밀도 (수 / 표면)는 인슐린 작용 ^8,10에서 논란의 여지가있는 역할을합니다. 그러나 운동 선수에서 증가한 것으로 보입니다. 셋째, LDs의 세포하 국소화는 중요한데, 이는 표면 막(아사르콜렘말 또는 주변부) 바로 아래에 위치한 LD가 중심 것들보다 인슐린 감수성에 더 해로운 영향을 미치기 때문이다(^8,9,13). 후자는 호흡 활동이 더 크고 수축¹⁴에 필요한 높은 에너지 수요를 충족시키기 위해보다 전문화 된 중앙 미토콘드리아에 연료를 제공합니다. 대조적으로, 말초 LD는 막 관련 공정에 관여하는 아사르콜렘말 미토콘드리아를 공급한다⁸. 마지막으로, 트리글리세라이드 이외에도 근육 내의 특정 복합 지질은 다른 지질보다 더 해로울 수 있습니다. 예를 들어, 디아실글리세롤, 장쇄 아실-CoA, 및 세라마이드는 트리글리세리드 턴오버 속도가 낮을 때 근육에 축적되어 인슐린 신호전달 ^9,15를 손상시킬 수 있다. "운동 선수의 역설"로 돌아가서, 지구력 운동 선수는 유형 I (산화성) 섬유에서 높은 회전율을 가진 더 작은 중앙 LD의 수가 많은 반면, 비만 및 당뇨병 환자는 유형 II (글리콜 성) 섬유 8,15,16에서 낮은 회전율을 가진 더 큰 말초 LD를 가지고 있습니다. 에너지 저장 및 방출에서의 그들의 역할 외에도, 유도 지방산 (FA) 및 코트 단백질 (페리리핀 5)을 통한 LDs는 또한 FA 산화 및 미토콘드리아 생물 발생의 전사 조절에 관여하는 중요한 선수로서 기능 할 수 있습니다⁸. 생리학 및 병태생리학에 중요한 영향을 미치기 때문에 LD의 역학과 기능에 대한 심층적 인 연구가 보장됩니다.

IMCL을 연구하는 몇 가지 기술이 있지만, LD 크기, 밀도 및 분포를 섬유 특정 방식으로 정확하게 정량화하는 데 모두 적합한 것은 아닙니다. 예를 들어, 자기 공명 분광법에 의한 IMCL의 평가는 비침습적이지만 섬유 내의 LD의 크기와 정확한 위치를 연구하기에 충분하지 않은 수준의 분해능을 제공하며 섬유 유형 특이^17,18이 아닙니다. 마찬가지로, 전체 근육 균질물⁽¹⁹)에 대해 수행된 생화학적 기술은 지질의 위치 및 크기를 평가할 수 없다. 결과적으로, LD 형태학 및 위치를 분석하는 가장 적절한 방법은 정량적 투과 전자 현미경(¹³)이지만, 이 기술은 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요된다. 따라서 Oil Red O (ORO) 20,21, monodansylpentane (MDH) ²² 또는 Bodipy 23,24,25와 같은 염료를 사용한 제제에 대한 공초점 형광 이미징이 이러한 연구에 가장 적합한 도구로 부상했습니다.

여기에서, 조직 샘플링 및 처리, 보디피 염색, 및 공초점 이미지 획득 및 분석을 포함하는 완전한 프로토콜이 설명되어 마우스 근육 동결절편에서 LD 크기, 수 및 국소화를 정량화한다. IMCL은 산화 섬유와 글리콜 섬유간에 고르게 분포되어 있지 않으며 각 섬유 유형은 LD 역학을 다르게 조절하기 때문에 IMCL에 대한 연구는 섬유 유형 별 ^16,25,26,27이어야합니다. 따라서, 이 프로토콜은 각 섬유에 의해 발현되는 미오신 중쇄(MyHC) 이소형(들)을 확인하기 위해 직렬 절편에 면역형광을 사용한다. 이 프로토콜의 또 다른 장점은 동결 전에 나란히 놓인 글리콜 (신근 디지토럼 롱구스, EDL)과 산화 (단독) 근육을 동시에 처리하는 것입니다 (그림 1). 이 동시 처리는 시간을 절약 할뿐만 아니라 샘플의 개별 처리로 인한 변동성을 방지합니다.

그림 1: 절차의 개략적인 개요. 근육 해부 (1) 후, 유사한 크기의 선택된 근육이 준비되고 함께 얼어 붙습니다 (2). 10 μm의 직렬 횡단 절편은 냉동 장치를 사용하여 얻어지며 접착 슬라이드(3)에 직접 장착된다. 두 개의 연속 슬라이드에서, 첫 번째 (4A)는 라미닌에 대해 면역 표지되고 LD를 인식하기 위해 Bodipy로 염색되고 두 번째 (4B)는 근육 섬유 유형의 인식을 위해 MyHC에 대한 항체로 면역염색됩니다. 이미지는 Bodipy (5A)의 공초점 현미경과 근육 섬유 유형 (5B)에 대한 epifluorescence 현미경을 사용하여 획득됩니다. 이미지는 피지에서 역치 및 정량화 입자(6A)를 적용하여 LDs(7) 또는 카운팅 셀(6B)에 의해 점유된 전체 면적의 수, 평균 크기, 밀도 및 백분율을 구하여 섹션(7)에서 각 유형의 섬유의 백분율을 구함으로써 분석된다. 약어: LDs = 지질 방울; EDL = 신근 디지토럼 경도; MyHCs = 미오신 중쇄 이소형. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜

마우스에 대해 수행 된 모든 절차는 Université Catholique de Louvain (2019 / UCL / MD / 013)의 의료 부문의 동물 실험 윤리위원회의 승인을 받았습니다.

1. 동결을위한 샘플의 해부 및 준비

1. 각 근육 쌍에 대해 3mm 두께의 코르크 조각에 라벨을 붙입니다.
2. 코르크 중앙에 칼날로 만든 작은 절개를 통해 지지대 역할을 할 경질 플라스틱(0.5cm W, 1cm H)의 직사각형 조각을 수직으로 삽입합니다(그림 2B).
   참고 : 직사각형 플라스틱 조각의 크기는 근육의 크기에 따라 다릅니다. 여기서, 설명된 치수는 3개월된 C57BL/6J 수컷 마우스의 단독(∼9 mg, 1 cm L, 2-3 mm W) 및 EDL(∼5 mg, 1 cm L, 2-3 mm W)의 크기에 적응된다.
3. 해부시 마우스 뒷다리의 발바닥과 EDL을 제거하십시오. 해부 중에 샘플이 건조되는 것을 방지하려면 얼음 위에 놓인 페트리 접시에 식염수로 가볍게 적신 압축 위에 놓습니다.
   참고 :이 두 사지 근육을 해부하는 방법에 대한 설명은 Wang et ^al.28 을 참조하십시오.
4. 최적의 절삭 온도 화합물(OCT)을 코르크/플라스틱 접합부에 작은 방울씩 떨어뜨려 기포를 피하십시오.
5. 종이 타월로 부드럽게 건조시켜 샘플에서 과도한 수분을 제거하고 (그림 2A) 코르크에 수직인 플라스틱에 두 근육을 놓습니다 (그림 2C).
6. 스테레오 현미경으로 근섬유의 방향을 확인합니다(그림 2D).
   참고 : 절연 효과가 빠른 동결을 방지하고 얼어 붙은 아티팩트를 생성하기 때문에 OCT로 근육을 덮지 않는 것이 중요합니다.

2. 냉동 절제를위한 골격근 샘플 냉동

주의: 근육의 동결은 화학 후드 아래에서 적절한 개인 보호 장비를 착용해야합니다 ( 자료 표 참조).

1. 최소 25cm 길이의 두 개의 측면 스트랩이 부착된 스테인리스 스틸 텀블러(~8cm H, 6cm Ø)를 사용하고(그림 2F), 텀블러를 최대 용량의 2/3까지 이소펜탄으로 채웁니다.
2. 텀블러를 스트랩으로 잡고 액체 질소로 채워진 폴리스티렌 상자에 부드럽게 담그면 용기 외부의 질소 수준이 내부 이소펜탄 수준보다 높습니다(그림 2F,G).
   주의: 텀블러가 질소와 접촉하면 열 충격으로 인해 소용돌이가 발생할 수 있습니다. 텀블러가 충분히 침지되어 있는지 확인하되 이소펜탄 침전을 일으킬 수 있으므로 질소의 유입을 피하십시오. 이런 일이 발생하면 이소펜탄을 식히고 텀블러를 새로운 이소펜탄으로 채우고 다시 시작하십시오.
3. 텀블러 내부가 이소펜탄의 흰색 고체 층으로 완전히 덮여 있으면 액체 질소 상자에서 꺼내십시오 (그림 2H).
   참고 : 이소 펜탄의 용융 온도는 -159 ° C이며, 텀블러의 가장자리는 충분히 추울 때 흰색으로 변합니다.
4. 전체 부피가 다시 액체가 될 때까지 나머지 액체 이소펜탄에 고체 이소펜탄 조각을 포셉으로 부드럽게 저어줍니다.
5. 이소펜탄이 텀블러의 바닥과 가장자리 전체에 흰색 자갈을 형성할 때까지 텀블러를 액체 질소에 다시 담그십시오(그림 2G,H).
   참고: 이 두 번째 냉각 단계는 이소펜탄의 적절한 동결 온도를 보장합니다.
6. 액체 질소에서 텀블러를 제거하고 텀블러 바닥에 근육을 빠르게 담그고 쥐 치아 핀셋으로 코르크를 잡으십시오. 코르크를 이소펜탄에서 15초 동안 소용돌이치고, 처리될 때까지 -80°C에서 보관한다(도 2I).
   참고: 단기 보관을 위해 샘플은 -20°C 냉동고에서 유지될 수 있습니다. 골격근의 빠른 동결을위한 완전한 프로토콜은 이미 다른 곳에서 출판되었습니다. 자세한 참고 문헌 및 문제 해결은 Meng et ^al.29, Kumar et al.30 및 Leiva-Cepas et ^al.31을 참조하십시오.

3. 냉동 절제술

1. 샘플을 -20°C로 이전에 냉각하고 블레이드 온도를 -25°C로 설정된 냉동 장치의 챔버 내로 가져온다.
   참고: -20°C/-80°C 냉동고에서 드라이 아이스로 채워진 폴리스티렌 상자의 냉동 상태로 샘플을 운반하고 절단하기 전에 챔버 온도까지 최소 20-30분 동안 샘플을 평형화할 수 있도록 합니다.
2. 미세한 핀셋으로 코르크에서 플라스틱을 제거하고 냉동 시편 디스크를 빠른 동결 플레이트에 올려 냉각시킵니다. 플레이트가 -50 °C에 도달하면 디스크에 약간의 OCT를 놓고 코르크를 디스크 위에 빠르게 올려 놓고 단단히 누릅니다. OCT가 고형화되고 코르크가 디스크에 잘 고정될 때까지 기다리십시오.
3. 원하는 절단 방향(그림 2J,K)으로 개체 헤드에 디스크를 놓고 근육 길이의 1/3 이상을 넘어 근육의 두 단면이 모두 보일 때까지 근육 블록을 트리밍합니다.
4. 절단 두께를 10μm로 설정하고 접착 슬라이드에 한 섹션을 배치하여 밝은 필드 현미경에서 섬유의 올바른 방향을 확인합니다.
   참고: 섬유의 가로 방향을 확인하는 것이 중요합니다. 섬유의 방향이 적절하지 않으면 개체 헤드의 각도를 조정하고 다른 부분을 잘라낸 다음 다시 확인하십시오.
5. 미리 라벨이 붙은 두 개의 접착 슬라이드에 두 개의 직렬 단면을 놓습니다: 하나는 섬유 유형을 결정하기 위한 슬라이드이고, 다른 하나는 지질 함량을 정량화하기 위한 슬라이드입니다(그림 2L).
   참고: 추가적인 직렬 단면을 수득하고 다른 조직학적 연구를 위해 -80°C에서 유지할 수 있다. 그러나, 지질 함량 및 세포내 형태학(²⁴)의 변화를 피하기 위해, 공기 건조를 방지하기 위해 절단 직후에 처음 두 슬라이드를 처리하는 것이 필수적이다. LD 정량화를 위해 슬라이드를 동결 및 해동하는 것은 동일한 효과를 가질 것이므로 매우 바람직하지 않습니다.

4. 섬유 타이핑 및 보디피 염색

1. 근육 섬유 유형의 면역 조직 화학적 검출
   참고: 다음 프로토콜의 경우, 250μL의 총 용액 부피는 소수성 펜으로 그려진 원으로 둘러싸인 전체 근육 부분을 1센트 동전의 대략적인 크기로 덮기에 충분합니다.
   1. 소수성 펜으로 그려진 윤곽선으로 단면을 감싸고 실온에서 1분 동안 빙냉 0.1M 인산완충식염수(PBS)로 헹구십시오(RT). 슬라이드를 습한 챔버에 놓고 블로킹 용액 (PBS 중의 10% 정상 염소 혈청 (NGS) 및 1:30 마우스 (MOM) 블로킹 시약 상에서 37°C에서 90분 동안 차단한다.
   2. 블로킹 용액을 제거하고 슬라이드를 37°C에서 90분 동안 인큐베이션하여 1차 항체(5% NGS, 1:30 MOM 차단 시약, 마우스 I형을 인식하는 1차 항체(IgG2b, 1:10), 유형 IIa(IgG1, 1:10), 및 IIx형(IgM, at 1:5) 섬유 및 래트 항-라미닌(α2 쇄, 1:1,000) PBS에서.
   3. 슬라이드를 RT에서 PBS 3 x 5분으로 세척한다.
   4. 슬라이드를 2차 항체 (염소 항-IgG2b AF405 (1:500), 염소 항-IgG1 AF488 (1:500), 염소 항-IgM AF568 (1:1,000), 및 염소 항-라미닌 AF647 (1:500) PBS 중)을 함유하는 용액과 함께 RT에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
      주의: 프로토콜의 나머지 부분에서는 형광을 보존하기 위해 슬라이드를 빛으로부터 멀리 떨어뜨려 두십시오.
   5. PBS로 다시 3 x 5 분간 세척하고, 이중 증류_H2O로 헹구고, 과량의 물을 제거하고, 안티페이드 시약으로 장착한다.
      참고: 슬라이드를 4°C에 보관하고 빛으로부터 보호하여 이미지 획득까지 형광을 보존합니다. 슬라이드는 고정되어 있지 않으므로 각 실험에 대해 새로 만들어진 솔루션을 사용하고 PBS를 오토클레이브하고 가능한 한 빨리 이미지를 획득하여 섹션의 오염을 피하는 것이 좋습니다.
2. 보디피로 LD의 염색
   참고: 단계 4.1.과 유사하게, 250 μL의 총 용액 부피는 소수성 펜으로 그려진 원으로 둘러싸인 전체 근육 부분을 1 센트 동전의 대략적인 크기로 덮기에 충분하다.
   1. 소수성 펜으로 그려진 윤곽선으로 섹션을 감싸고 RT에서 10분 동안 얼음처럼 차가운 0.1M PBS로 헹구십시오. 모든 헹굼 및 세척에 얼음처럼 차가운 PBS를 사용하십시오.
   2. RT에서 10분 동안 메탄올 없이 차가운 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정하십시오. 첫 번째 빠른 헹굼 후, 슬라이드를 RT에서 PBS 3 x 5분으로 세척한다.
      주의: 화학 후드 아래에서 이 단계를 수행하십시오.
   3. 슬라이드를 습한 챔버에 놓고 PBS 중의 5% NGS로 RT에서 1시간 동안 차단한다.
   4. 슬라이드를 1차 항체(PBS 중의 2% NGS 및 래트 항라미닌(α2 쇄, 1:1,000))의 용액과 함께 37°C에서 90분 동안 인큐베이션한다. 슬라이드를 RT에서 PBS 3 x 5분으로 세척한다.
      주의: 프로토콜의 나머지 부분에서는 형광을 보존하기 위해 슬라이드를 빛으로부터 멀리 떨어뜨려 두십시오.
   5. PBS 중의 염소 항-AF647 항체 (1:500)를 함유하는 이차 항체 용액과 함께 RT에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 슬라이드를 RT에서 PBS 3 x 5분으로 세척한다.
   6. PBS 중의 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, 0.5 μg/mL) 및 BODIPY(1 μg/mL)의 용액으로 RT에서 20분 동안 인큐베이션한다.
      참고: BODIPY 원액을 준비하려면 1mg/mL의 농도로 DMSO에 녹입니다. 상이한 보디피 제형은 LD 염색을 위해 상업적으로 입수가능하다. 이루어진 선택에 따라, 염색 방법은 동일하다(동일한 단계, 농도 및 배양 시간); 그러나 획득 방법은 약간 다를 것입니다.
   7. 첫 번째 빠른 헹굼 후, 슬라이드를 RT에서 PBS 3 x 5분으로 세척하고, 이중 증류된_H2O에서 헹구고, 과량의 물을 제거하고, 안티페이드 시약으로 장착한다.
      참고: 슬라이드를 빛으로부터 보호하여 4°C에 보관하여 이미지 획득까지 형광을 보존합니다.

5. 이미지 획득

참고: 염색 프로토콜이 완료되면 오염을 피할 뿐만 아니라 LD의 형태, 크기 및 수를 보존하기 위해 즉시 이미지 수집(다음 24시간 이내)을 진행하는 것이 중요합니다.

1. 샘플링된 각 근육의 섬유 유형을 평가하기 위한 이미지 획득
   참고: 이 단계는 전체 슬라이드 형광 스캐닝 현미경 또는 기존의 에피형광 현미경을 사용하여 수행할 수 있습니다. 후자의 경우 섹션을 재구성하기 위해 이미지의 수동 또는 자동 스티칭을 수행해야합니다.
   1. 섬유 유형 인식을 위해서는 10x/0.3 목표의 에피형광 현미경을 사용하십시오. DAPI(405nm), FITC, TRITC 및 Cy5용 여기 필터를 선택하여 각각 유형 I, IIa, IIx 섬유 및 라미닌을 검출합니다.
      참고: IIb 타입 섬유는 면역표지가 부착되지 않습니다. 그들은 검은 사르코 플라스마 (sarcoplasm)가있는 사르콜레마의 한계에서 라미닌에 의해 염색 된 섬유로 인식 될 것입니다.
   2. 각 채널에 대해 적절한 노출 시간을 조정합니다.
   3. 종래의 에피형광 현미경을 사용하는 경우, 항상 근육 재건을 용이하게 하기 위해 동일한 순서로 전체 근육의 이미지를 획득한다. 한 이미지의 오른쪽 가장자리에 있는 파이버가 다음 이미지의 왼쪽 가장자리에도 나타나는지 확인합니다. 이미지의 위쪽 부분과 아래쪽 부분에도 동일하게 적용됩니다(그림 3A).
      참고 : 참고로, EDL의 한 부분 또는 3 개월 된 마우스에서 해부 된 발바닥의 경우 각각 평균 여섯 개와 여덟 개의 이미지가 전체 근육 단면을 덮을 것입니다.
   4. 근육을 스캔한 후 캡처된 디지털 이미지를 섬유 형태학(라미닌) 및 근육 단면의 조직학을 기반으로 재구성(스티칭)을 위한 모든 이미지 처리 소프트웨어에 업로드하고 모든 채널(색상)이 병합된 TIFF, PNG 또는 JPG 파일로 저장합니다(그림 3A).
2. 라미닌과 보디피 공동 염색을 통한 이미지 획득
   참고: 섬유 유형을 인식하고 캡처된 각 유형에 대한 섬유 수를 추정하려면 Bodipy-laminin의 이미지 수집을 시작하기 전에 섬유 유형 섹션을 이미 스캔하고 근육을 재구성해야 합니다(그림 3B).
   1. Bodipy 이미지 관찰 및 수집을 위해 수치 조리개가 1.4인 40x 오일 침지 대물 렌즈가 있는 공초점 현미경을 사용하십시오.
   2. 1 AU의 핀홀, 2,048 픽셀 x 2,048 픽셀 해상도, 0.08 μm의 픽셀 크기, 단방향 모드, 4 (~ 4 μs / 픽셀)에서 스캔 속도, 4x로 설정된 라인 평균 및 1로 설정된 디지털 줌 설정을 사용하십시오.
   3. Bodipy-558/568과 laminin-AF647 간의 상호 대화를 방지하려면 공초점 소프트웨어에서 순차 스캔 모드를 사용하십시오.
      참고: 선택한 염료가 Bodipy-493/503인 경우, Bodipy 채널과 laminin-AF647 채널 사이의 누화 없이 동시 공초점 레이저 스캐닝이 가능합니다. 이렇게하면 이미지 수집 속도가 빨라집니다.
   4. 488nm 레이저 라인 또는 아르곤 레이저 라인을 사용하여 Bodipy-493/503을 여기시키고 561nm 다이오드 레이저 라인을 사용하여 Bodipy-555/568을 여기시킵니다. 마지막으로 640nm 다이오드 레이저 라인으로 라미닌-AF647을 감지합니다.
      주의: Bodipy 분자는 광표백에 매우 민감하므로 불필요한 레이저 스캐닝을 피하십시오. 섬유를 인식하려면 라미닌 용 레이저 만 사용하십시오.
   5. 선택한 염료에 따라 Bodipy-493/503²⁴ 의 경우 570-650nm, Bodipy-558/568의 경우 565-620nm에서 방출 범위를 설정합니다. 라미닌의 방출 범위를 656-700 nm로 설정하십시오.
   6. 게인과 디지털 게인을 적절하게 설정하여 범위 표시기에서 포화 픽셀이 감지되지 않도록 합니다. 오프셋을 조정하여 배경 신호를 수정합니다.
      참고: 필터 선택 및 위에서 언급한 기타 스캐닝 파라미터는 각 공초점 현미경에 대해 최적화되어야 합니다. 위에서 언급 한 모든 설정이 샘플에서 캡처 된 모든 이미지를 비교할 수 있도록 일정하게 유지되는 것이 중요합니다.
   7. 공초점 현미경으로 시각화 된 사람들 중 섬유의 유형을 식별하려면 섬유 형 면역 검출 후 재구성 된 섹션의 이미지가 확인되는 개인용 노트북을 사용하십시오 (그림 3B).
   8. 섬유 그룹이 올바르게 식별되면 Bodipy 및 laminin 채널로 이미지를 획득하십시오.
      참고: LD의 나중에 섬유별 분석을 용이하게 하기 위해 MyHC 인식을 위해 획득한 이미지에 이러한 섬유가 있는 근육 부위의 Bodipy-laminin 이미지 이름을 기록해 두는 것이 좋습니다.

6. 이미지 분석

1. 각 근육 샘플에 대한 섬유 유형의 분석
   1. 피지(또는 ImageJ)³²에서 섬유 이소폼을 감지하는 데 사용되는 모든 채널의 병합에서 얻은 재구성된 근육으로 TIFF, PNG 또는 JPG 파일을 엽니다.
   2. 셀 카운팅 도구를 시작하려면 플러그인을 클릭하십| | 분석 셀 카운터 | 셀 카운터.
   3. 셀 카운터 창에서 작업 |를 클릭하십시오. 초기화합니다.
   4. 같은 창 의 카운터 에서 유형 1을 선택합니다.
   5. 피지 주 창에서 지팡이 도구를 선택합니다.
   6. 각 유형의 섬유 수를 정량화하려면 동일한 유형의 각 섬유를 클릭하여 프로그램이 클릭 한 섬유 수를 기록하도록하십시오.
   7. 완료되면 다음 유형의 광섬유를 선택하고 동일한 단계를 반복하십시오.
   8. 이미지의 모든 파이버가 지정된 파이버 유형에 지정되면 셀 카운터 창에서 결과를 클릭하여 결과를 테이블에 표시합니다.
   9. 파일 |를 클릭하여 이 테이블을 스프레드시트 테이블로 저장합니다. 결과 창에서 다른 이름으로 저장합니다.
   10. 셀 카운팅 창에서 마커 저장 또는 마커 로드를 클릭하여 언제든지 동일한 이미지에 선택 항목을 저장하고 다시 로드합니다.
2. 섬유 유형 의존적 방식으로 지질 액적의 분석
   1. LDs의 정량화를 위해 피지를 사용하여 공초점에서 얻은 Bodipy 및 laminin의 이미지를 분석하십시오.
      참고: 작성자는 분석을 자동화하기 위해 사용자 지정된 매크로를 설계했습니다. 이 매크로는 사용 방법에 대한 단계별 설명과 함께 각각 보충 파일 1 및 보조 파일 2로 사용할 수 있습니다.
   2. 피지에서 바이오 포맷 가져 오기의 도움으로 각 이미지를 엽니 다. 스택 보기 옵션에서 하이퍼스택을 선택합| 색상 모드, 기본값. 자동 크기 조정 창이 선택되어 있는지 확인합니다.
      참고: 다음 단계는 이미지에서 하나의 파이버를 분석하기 위한 프로토콜을 설명하지만 이미지에 나타나는 전체 파이버 수만큼 반복해야 합니다.
   3. 자유형 선택 도구를 사용하여 라미닌 채널을 기반으로 섬유의 사르콜레마를 수동으로 선택하고(그림 4A) 키보드의 T를 눌러 ROI 창에 선택 또는 관심 영역(ROI)을 기록합니다.
   4. 피지의 메인 창으로 이동하여 | 분석을 클릭하십시오. 측정을 설정하고 팝업 창에서 영역 및 Feret의 지름을 선택합니다. 나머지 상자는 선택하지 않고 다른 매개 변수는 기본적으로 나타나는 대로 그대로 둡니다.
   5. ROI 창에서 측정을 클릭하여 선택한 섬유의 면적 및 최소 페렛 직경(MF)을 구하고 나중에 사용할 수 있도록 기록해 둡니다.
      참고: LD를 분석할 때, 크기와 밀도는 섬유의 중심과 주변부(subsarcolemmal region-SS) 사이에서 다양하다는 것을 명심하는 것이 중요합니다. 따라서 분석은 별도로 수행되어야합니다.
   6. MF의 1/6 값을 계산하여 섬유의 중앙 부분을 구분합니다.
      참고: 매크로에서 기본 MF 값은 6으로 설정되며, 이는 적용된 축소가 MF의 1/6으로 설정됨을 의미합니다. 이 값은 고지방 식단을 먹인 동물의 발바닥에서 얻은 경험적 데이터를 기반으로 선택되었습니다. 그러나 각 연구원은 경험적 데이터와 분석 된 근육, 섬유의 유형 및 동물 상태에 따라이 숫자를 변경해야합니다.
   7. ROI 창에서 추가를 클릭하여 첫 번째 ROI를 복제하고 창에 나타나는 두 번째 ROI를 선택합니다.
   8. 피지의 메인 창에서 | 편집을 클릭하십시오. 선택 | 이전에 계산된 값(6.2.6단계부터)을 숫자 앞에 빼기 기호로 확대하고 도입한 다음 확인을 클릭합니다. ROI 창에서 Add[t] (세 번째 ROI가 나타나야 함)와 삭제를 클릭하여 두 번째 ROI를 삭제합니다.
      참고: 연구원은 ROI 창에서 모두 표시 상자를 클릭하여 결과를 확인할 수 있습니다. 이 시점에서 두 개의 ROI가 나타나야 하는데, 하나는 광섬유의 전체 둘레를 둘러싸는 것(그림 4B)이고 다른 하나는 중앙에 배치됩니다(그림 4C).
   9. ROI 창에서 두 ROI 를 모두 선택하고 자세히|를 클릭하십시오. XOR | 추가[t]. 파이버의 주변부에 해당하는 세 번째 ROI가 나타날 때까지 기다립니다(그림 4D).
   10. 추가 |을 클릭하여 ROI를 저장하십시오 . 나중에 동일한 섬유를 다시 분석해야 하는 경우에 대비하여 ROI를 절약하기 위해 저장합니다.
   11. Bodipy 채널을 선택하고 이미지 |를 클릭하여 임계 값 도구를 엽니 다. | 조정 피지의 주 창의 임계값입니다.
   12. 임계값 팝업 창에서 값을 70/255로 설정하고 임계값을 선택합| B & W 방법, 어두운 배경 |를 클릭하십시오. 적용하십시오.
       참고: 임계값에 적용되는 값은 실험 조건에 따라 달라질 수 있으며 분석을 최적화하기 위해 임계값 을 적절하게 설정해야 합니다. Bodipy 신호가 임계치 한계 이상인 B&W 윈도우는 흰색으로 표시되고 배경은 검은색으로 나타나야 합니다(그림 4E 의 원본 Bodipy 이미지와 그림 4F의 Bodipy 이미지를 비교).
   13. 피지의 메인 창으로 이동하여 | 분석을 클릭하십시오. 측정값을 설정하고 팝업 창에서 영역, 영역 분수 및 임계값으로 제한을 선택합니다. 나머지 상자는 선택하지 않고 다른 매개 변수는 기본적으로 나타나는 대로 그대로 둡니다.
       참고: 연구원이 완벽한 구의 경우 1에서 선의 경우 0 사이의 구형 형태의 인덱스인 LD의 "원형도"를 분석하려면 측정 설정 팝업 창의 모양 설명자 상자를 클릭합니다.
   14. ROI 창으로 이동하여 첫 번째 ROI 를 선택합니다. 피지의 메인 창에서 | 분석을 클릭하십시오. 파티클 분석 도구.
       참고: 이 도구는 각 선택 항목에서 파티클로 덮인 전체 영역의 수, 크기, 커버 영역 및 백분율을 정량화하고 결과를 스프레드시트 파일로 저장합니다.
   15. 파티클 분석 창에서 2에서 무한대(2-Infinity)로 값을 설정하고, 픽셀 상자를 선택하고, 기본 원형도 값을 유지하고, 요약을 선택한 다음, 확인을 클릭합니다.
       참고: 광섬유의 결과를 확인하려면 표시 옵션에서 사용 가능한 옵션 중 하나를 선택합니다. 테이블의 선택 항목에서 각 LD의 정보를 인식하려면 입자 분석 창에서 결과 표시 옵션을 선택합니다. 섬유의 전체 면적에 대한 분석의 결과는 여러 컬럼 (카운트, 총 면적, 평균 크기, % 면적; 이들은 입자 수 [LDs], 이들 입자가 차지하는 면적, 평균 크기 및 입자가 차지하는 선택의 총 면적의 백분율에 해당하며, 각각). 밀도를 계산하려면 입자 수를 각 선택 항목의 전체 영역으로 나눕니다.
   16. 섬유의 중심과 둘레의 값을 얻으려면 6.2.14 및 6.2.15단계를 반복하여 매번 두 번째(중앙) 및 세 번째 ROI(주변)를 선택합니다.
   17. 파일 |을 클릭하여 결과를 저장하십시오 . 요약 창에 그대로 저장합니다.
       참고: 나중에 데이터의 통합 및 통계 분석을 용이하게 하기 위해 결과의 지정된 이름에 광섬유 유형, 조건 및 이미지 이름을 포함시키십시오. 동일한 이미지에서 나머지 파이버를 분석하려면 6.2.3~6.2.17단계를 반복합니다. 통계 분석을 위해서는 각 유형의 섬유를 동물 당 적어도 10-15 개 분석해야합니다.

결과

본원에 기재된 프로토콜은 섬유 유형 및 아세포-특이적 방식으로 LDs를 용이하게 정량화하는 효율적인 방법을 제공한다. EDL과 발바닥과 같이 비슷한 크기의 두 근육을 함께 얼림으로써 다음 단계에 소요되는 시간과 자원이 어떻게 절반으로 감소하는지 보여줍니다.

성인 마우스 근육에서 발현된 상이한 MyHC 이소형의 면역염색, 이미지 획득 및 분석을 위한 완전한 프로토콜이 제공된다. 이 프로토콜은 1989 년 Schiaffino et al. 3 3에 의해 처음 설계된 것을 ^{기반으로하며,} 라미닌^을 표지하기 위해 추가 항체를 사용하는 것과 같은 일부 조정이 있습니다. 이러한 나중의 변형은 IIb 타입 섬유의 위치에 매우 중요하며, 이는 어떠한 항체로도 염색되지 않기 때문에 검정될 것이다. 도 5에 도시된 바와 같이, 이러한 면역조직화학 프로토콜은 마우스의 느린 산화성(타입 I 및 IIa) 및 패스트-글리콜...

토론

여기에 자세히 설명된 프로토콜은 Bodipy로 태그가 지정된 LD를 섬유형 및 아세포별 기준으로 정량화하는 효율적인 방법을 설명합니다. 최근 몇 년 동안, ORO 또는 수단 블랙 B와 같은 고전적 지질 염료는 중성 지질 (예를 들어, Bodipy)에 결합하는 세포 투과성, 친유성, 형광 염료의 새로운 어레이로 치환되었다. 다른 컨쥬게이트로서 이용 가능한 Bodipy는 LDs를 태깅하여 다른 고정 조직 및 세포^23,38,39,40뿐만 아니라 살아있는 세포 ^41,42에서도 다른 소기관과의 형태^, 역학 및 상호 작용을 연구하는 데 매우 효과적임이 ^{입증되었습니다.}

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Equipment
AxioCam 506 mono 6 Mpix 카메라	Zeiss
AxioCam MRm 1.4MPix CCD 카메라	Zeiss
화학 후드	Potteau Labo	EN-14175
컨포칼 현미경	Zeiss	LSM800
코르크 디스크 (ø 20mm, 두께 3mm)	전자 현미경 과학	63305
크라이오-글러브	템프쉴	16072252
크라이오스탯	써모 사이언티픽	Microm Cryo Star HM 560
해부 스테레오 현미경 SMZ745	Nikon
드라이 아이스
Dumont 집게	F.S.T	11295-10
Epifluorescence microscope	Zeiss	AxioImage-Apotome Z1
Extra Fine Bonn Scissors	F.S.T	14084-08
FisherBrand 일회용 베이스 몰드 (0.7 x 0.7 cm)	ThermoFisher	22-363-552	코르크의 근육을 유지하기 위해 조각을 자르는 데 사용됩니다
유리 페트리 접시 (H 25  mm, &오슬래시; 150  mm)	BRAND Petri dish, MERK	BR455751	해부 중 근육을 얼음 위에 올려놓는 데 사용됩니다.
ImmEdge 소수성 장벽 PAP Pen	Vector Labs	H-4000	근육 부분 주변에 히드롭포비아 장벽을 만드는 데 사용됩니다
큐베이터	MMM Medcenter	Incucell 707
현미경 커버 안경 (24x50mm)	보조
현미경 슬라이드 박스	Kartell	278	면역 조직 화학을위한 습한 챔버로 사용
넥 홀더	Linie zwo	SB-035X-02	스테인레스 스틸 텀블러를 고정하기위한 스트랩으로 사용
No 15 멸균 탄소강 메스 블레이드	Swann-Morton	0205
페인트 브러시	Van Bleiswijck	Amazon B07W7KJQ2X	냉동 절제 처리에 사용
영구 마커 펜 블랙	Klinipath/VWR	98307-R	슬라이드에 Pierce
Fixation Forceps	F.S.T	18155-13
폴리스티렌 상자를			H 12 cm x L 25 cm x W 18 cm, 액체 질소 용기로 사용되며 샘플을 cryostat
Scalpel Handle로 운반하는 데 사용됩니다. 메스 핸들, 125 mm (5"), No. 3	Aesculap	BB073R
스테인레스 스틸 컵 10oz	Eboxer	B07GFCBPFH	근육 동결을 위해 이소펜텐으로 채우는 텀블러
Superfrost Ultra Plus 슬라이드	ThermoFisher	J1800AMNZ
수술용 핀셋 1/2 치아	Medische Vakhandel	1303152	"쥐 이빨 핀셋"이라고도 함
Vannas 스프링 가위 - 3mm 커팅 엣지	F.S.T	15000-00
계량 보트	VWR 국제	611-2249
전체 슬라이드 스캐너	형광 Zeiss	Axio Scan.Z1
Reagents
Alexa Fluor 405 염소 안티-마우스 IgG2b	Sigma-Aldrich	SAB4600477	최종 농도 1:500에서 사용
Alexa Fluor 488 염소 안티 마우스 IgG1	ThermoFisher	A-21121	사용 1:500
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgM	Abcam	ab175702	1:1,000
Alexa Fluor 647 goat anti rat-IgG (H+L) 2차 항체	ThermoFisher	A-21247	1:500
BODIPY-493/503 (4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno)	ThermoFisher	D3922	1 µ의 최종 농도에서 사용됩니다. g / mL
BODIPY-558 / 568 C12 (4,4- 디플루오로 -5- (2- 티에닐) -4- 보라 -3a, 4a - 디아자 -s- 인다센 -3- 도데 판산)	ThermoFisher	D3835	1 µ의 최종 농도에서 사용; g/mL
DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole)	ThermoFisher	D1306	0.5 µ의 최종 농도에서 사용; g/mL
디메틸 설폭사이드(DMSO)	Sigma-Aldrich	D-8418	1mg/mL 원액의 Bodipy를 해결하는 데 사용됩니다. CAUTION: 독성 및 인화성. 증기는 자극을 유발할 수 있습니다. 흄 후드에서 조작하십시오. 피부와의 직접적인 접촉을 피하십시오. 고무 장갑, 보호 눈 고글을 착용하십시오.
포름알데히드 용액 4%, 완충제, pH 6.9	시그마-알드리치	1004969011	<강한>주의: 알레르기성 피부 반응을 일으킬 수 있습니다. 유전적 결함을 일으키는 것으로 의심됩니다. 암을 유발할 수 있습니다. 흄 후드에서 조작하십시오. 피부와의 직접적인 접촉을 피하십시오. 고무 장갑, 보호 눈 고글을 착용하십시오.
Isopentane GPR RectaPur	VWR international	24872.298	주의: 인화성이 매우 높은 액체 및 증기. 삼켜서 기도로 유입되면 치명적일 수 있습니다. 졸음이나 현기증을 유발할 수 있습니다. 반복적으로 노출되면 피부가 건조하거나 갈라질 수 있습니다. 보호 장갑/보호복/보안경/안면 보호구를 착용하십시오.
액체 질소			<강한>주의:  매우 춥습니다. 장갑을 착용하십시오. 끓거나 튀는 것을 최소화하기 위해 환기가 잘 되는 곳에서 천천히 다루십시오. 저온 액체용으로 설계된 용기를 사용하십시오.
마우스 차단 시약	Vector Labs	MKB-2213-1	1:30
Myosin heavy chain Type I (BA-D5-s Primary Antibody) 유전자 : MYH7, monoclonal bovine anti mouse IgG2b	DSHB University of Iowa	BA-D5-supertatanant	1:10
Myosin heavy chain Type IIA (SC-71-s Primary Antibody) 유전자의 최종 농도에서 사용 유전자 :   MYH2, 단클론 소 안티 마우스 IgG1	DSHB 아이오와 대학	SC-71-상등액	1:10
Myosin 중쇄 IIX 형 (6H1-s 기본 항체)의 최종 농도에서 사용, 유전자:  MYH1, 단클론 토끼 안티 마우스 IgM	발달 연구 하이브리도마 은행, 아이오와 대학교	6H1-상등액	1:5
정상 염소 세럼 (NGS)	Vector Labs	S-1000
PBS 0.1 M			조직학 실험실에서 일반적으로 사용됨
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P36930
쥐 항-라미닌-2 (&알파;-2 사슬) 1차 항체 (단클론)	Sigma-Aldrich	L0663	1:1,000
Tissue-Tek O.C.T 화합물	Sakura	4583
Software
Adobe Illustrator CC	어도비 Inc.		피규어 Adobe
Photoshop	Adobe Inc.		컨 포칼 소프트웨어
BioRender	https://biorender.com/		그림을 디자인하는 데 사용
피지 / ImageJ	https://imagej.net/software/fiji/		획득 한 이미지를 분석하는 데 사용
마이크로 소프트 파워 포인트	마이크로 소프트		유형을 스캔 한 후 전체 근육의 조직학을 재구성하는 데 사용
젠 블루 2.6	자이스		섬유 유형을 스캔한 후 전체 근육의 조직학을 재구성하는 데 사용됩니다.