MALDI-TOF는 산화된 RNA와 엑소리보뉴클레아제 Xrn-1 사이의 반응성으로부터 수득된 단편을 특성화하는데 사용되었다. 본 프로토콜은 RNA 및/또는 DNA를 포함하는 다른 공정에 적용될 수 있는 방법론을 기술한다.
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이 논문에서
요약
초록
RNA는 생명의 모든 도메인에 존재하는 생체 고분자이며, 다른 분자 및 / 또는 반응성 종, 예를 들어 DNA, 단백질, 이온, 약물 및 자유 라디칼과의 상호 작용은 유비쿼터스입니다. 결과적으로, RNA는 절단, 분해 또는 변형을 포함한 다양한 반응을 겪으며 뚜렷한 기능과 함의를 가진 생물학적으로 관련된 종으로 이어집니다. 한 가지 예는 반응성 산소 종 (ROS)의 존재 하에서 발생할 수 있는 7,8-디히드로-8-옥소구아닌 (8-oxoG)에 대한 구아닌의 산화이다. 전반적으로, 그러한 제품과 변형을 특징 짓는 절차는 과학계에 크게 가치가 있습니다. 이를 위해, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간(MALDI-TOF) 질량 분광법은 널리 사용되는 방법이다. 본 프로토콜은 효소적 처리 후에 형성된 RNA 단편을 특성화하는 방법을 기술한다. 선택된 모델은 RNA와 엑소리보뉴클레아제 Xrn-1 사이의 반응을 사용하며, 여기서 효소 소화는 산화된 부위에서 중단된다. 두 개의 20-뉴클레오티드 긴 RNA 서열 [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] 및 [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU]를 고상 합성을 통해 수득하고, UV-vis 분광법에 의해 정량하고, MALDI-TOF를 통해 특성화하였다. 수득된 가닥은 이어서 (1) 5'-인산화되고 MALDI-TOF를 통해 특성화되고; (2) Xrn-1로 처리된 단계; (3) 여과 및 탈염; (4) MALDI-TOF를 통해 분석. 이러한 실험적 셋업은 Xrn-1의 실속과 관련된 단편의 명백한 동정을 이끌었다: [5'-H2PO4-(8-옥소G)g cua AAA 구], [5'-H2PO4-(8-옥소G)(8-옥소G) cua aaa gu], 및 [5'-H2PO4-(8-옥소G) cua AAA 구]. 기술된 실험은 200개의 피코몰의 RNA (MALDI 분석에 사용된 20 pmol)로 수행되었다; 그러나 더 적은 양은이 작업에 사용 된 것보다 더 많은 전력을 가진 레이저 소스를 사용하여 분광계로 감지 가능한 피크를 초래할 수 있습니다. 중요하게도, 기술된 방법론은 일반화될 수 있고 잠재적으로 RNA 및 DNA를 포함하는 다른 공정에 대한 생성물 식별로 확장될 수 있고, 다른 생화학적 경로의 특성화/해명에 도움이 될 수 있다.
서론
MALDI-TOF 1,2,3은 다양한 크기와 특성을 가진 분자의 특성화 및/또는 검출을 위해 널리 사용되는 기술입니다. 그것의 용도 중 일부는 천연 자원으로부터의 탄닌 검출4, 식품5의 대사 산물 이미징, 세포 약물 표적 또는 마커6의 발견 또는 모니터링, 임상 진단7과 같은 다양한 응용을 포함한다. 본 연구와 관련성 중 하나는 MALDI-TOF를 DNA 또는 RNA와 함께 사용하는 것이며, 올리고뉴클레오티드에 대한 사용은 삼십 년8 이상으로 거슬러 올라가며, 몇 가지 한계가 지적되었다. 이 기술은 이제 바이오폴리머(9)를 특성화하고 화학적 및 생화학적 반응, 예를 들어 RNA 10에서 도금된 부위의 특성화, 가닥 절단11,12에 따른 RNA 단편의 확인, 또는 단백질-DNA 가교결합의 형성
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프로토콜
RNase-무함유 초순수 (표 1)를 본 연구에 사용하였다.
1. RNA 용액의 농도 결정
- 아래 단계에 따라 RNA 샘플을 준비한다.
- 마이크로 원심분리 튜브 (0.6 mL)를 사용하여 RNase-free H2O. 159 μL의 RNase-freeH2O.를 넣고 19 μL의 원액을 희석하여 RNA 용액을 제조하였다 (10x).
참고: 다양한 큐벳이 상용화되어 있기 때문에 필요한 부피가 다를 수 있습니다. 이 작업에는 1cm 경로 길이와 감소 된 부피 (150 μL)를 가진 큐벳이 사용되었습니다. - UV-vis 큐벳을 메탄올 (2x)로 헹구고 물을 뿌린 다음 물 (초순수H2O, 3x, 자료표 참조)으로 헹구십시오. 질소 가스의 흐름을 사용하여 큐벳을 완전히 건조시킵니다.
- 피펫을 사용하여 용액(1.1.1단계)을 큐벳으로 옮겨 기포가 없도록 합니다. 큐벳을 뚜껑을 덮고 필요할 때까지 옆으로 놓습니다.
- 마이크로 원심분리 튜브 (0.6 mL)를 사용하여 RNase-free H2O. 159 μL의 RNase-freeH2O.를 넣고 19 μL의 원액을 희석하여 RNA 용액을 제조하였다 (10x).
- UV-vis 분광광도계를 사용하여 제조된 RNA 용....
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결과
이 작업에 사용된 올리고뉴클레오티드는 사용 전에 합성, 특성화 및 정량화되었다. 모든 올리고뉴클레오티드의 농도는 이차 구조물의 잠재적 형성으로부터 발생하는 잘못된 판독을 피하기 위해 90°C에서 기록된 UV-vis 분광법을 통해 결정되었다. 도 3은 이 작업에 사용된 RNA의 모델 올리고뉴클레오티드의 스펙트럼을 상온에서 취하고, 열을 가한 후에 측정한 것이다.
Xrn-1 실속을 일으키는 산화 병변의 구조와 함께 전체 절차가 그림 4에 설명되어 있습니다. 올리고뉴클레오티드 (1)는 위치-11에 하나의 8-oxoG를 함유하고, 여기서 Xrn-1 활성이 차단되어, RNA 가닥의 가수분해가 중단된다. 중요하게도, 이 도면에 묘사된 결과는 모 가닥(1)의 200 pmol을 함유하는 용액을 사용하여 수행된 실험에 해당하지만, 플레이트 상에서 단지 20 pmol만이 발견.......
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토론
이 워크플로우의 주요 과제는 실험을 마무리하고 질량 분광 분석을 수행하는 사이에 있었습니다. 실험은 콜로라도 덴버 대학에서 수행되고 완료되었으며 콜로라도 주립 대학 시설로 (하룻밤) 운송되었습니다. 데이터 수집은 편의에 따라 수령시 수행되었습니다. 몇 가지 예기치 않은 상황으로 인해 프로세스가 시간 지연되었습니다. 일례로, 예상치 못한 기기 오작동으로 인해 시료를 발견하거나 획득하기 전에 샘플을 동결(21일 동안 한 번)해야 했습니다. 그러나이 시간 지연은 RNA의 분해 (신호 강도 감소로 이어짐)를 배제 할 수는 없지만 실험 결과에 영향을 미치지 않는 것으로 보입니다.
기술된 실험의 한계는, RNA 농도의 관점에서, 단일 RNA 서열23,24에 대해, 생체내에서 수득될 수 있는 것보다 더 높은 [RNA]로 실험이 수행되었다는 것이었다. 우리는 20 pmol의.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 세 기관, 두 연구 그룹 및 하나의 핵심 시설 간의 공동 노력이라는 점에 유의해야합니다. 분배 및 작업량은 다음과 같이 수행되었다: 단백질 (Xrn-1) 발현은 덴버 대학 (Denver, CO)에서 수행되었다. 올리고뉴클레오티드 합성, 정량화 및 실험(주로 효소적 분해)은 콜로라도 덴버 대학(Denver, CO)에서 수행되었다. 최적화도 거기에서 수행되었습니다. MALDI-TOF 탐지, 인수 및 분석은 콜로라도 주립 대학의 분석 자원 핵심 시설에서 수행되었습니다. (포트 콜린스, CO). SS는 UROP 어워드(CU Denver)와 유레카 보조금(CU Denver)을 인정하여 지원을 받고 싶습니다. E. G.C.는 R00GM115757 을 통해 NIGMS의 지원을 인정합니다. MJER는 1R15GM132816 을 통해 NIGMS의 지원을 인정합니다. K.B.는 리소스 ID: SCR_021758을 승인합니다. 이 작품은 또한 Henry Dreyfus Foundation의 교사 - 학자 상 (MJER), TH-21-028에 의해 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.6mL MCT 눈금 바이올렛 | 피셔 사이언티픽 | 05-408-127 | |
| 6'-트리하이드록시아세토페논 일수화물 98% | 시그마 알드리치 | 480-66-0 | |
| 아세토니트릴 99.9%, HPLC 등급 | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| 아데노신 삼인산, 10mM | New Englang Bioscience | P0756S | |
| 구연산암모늄, 이염기성 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| 불화 암모늄 98.0%, ACS 등급 | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Bruker 박테리아 테스트 표준 | Bruker Daltonics | 8255343 | |
| Xrn-1 | New England BioLabs | M0338S | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS 유기물 | A0368487 | |
| Flex 분석의 상업적 소스 소프트웨어 | Bruker daltonics | FlexAnalysis 소프트웨어 버전 3.4, Bruker Daltonics | |
| Lambda 365 UV-vis 분광 광도계 | Perkin Elmer | ||
| MALDI 플레이트: MSP 96 ground steel target | Bruker Daltonics | 280799 | |
| 질량 분석기 | Bruker | Microflex LRFTOF 질량 분석기 (Bruker Daltonics, Billerica, MA) | |
| Mili-Q IQ 7000 | Milipore Sigma | A Mili-Q 시스템은 이 작업에 사용된 모든 물을 정화하는 데 사용되었습니다 | |
| OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg) | Pall Corporation | OD010C33 | 필터 매체, Omega(변성 폴리에테르설폰) 10K 기공 크기 |
| NEBuffer 3 | New England Biolabs | B7003S | 이것은 솔루션 B |
| Oligo 분석기 도구 | IDT-DNA | 입니다.https://www.idtdna.com/calc/analyzer | |
| 피펫 팁 P10 | Fisher Scientific | 02-707-441 | |
| 피펫 팁 P200 | Fisher Scientific | 02-707-419 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 | New England BioLabs | M0201S | |
| T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 반응 버퍼 | New England BioLabs | B0201S | This is solution A |
| Triflouroacetic acid | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| Xrn-1 exoribonuclease | Expressed in | 참조 참조 20 | |
| ZipTip Pipette Tips for Sample preparation | Millipore | ZTC 18S 096 | 10 µ L 피펫 팁에는 C18 표준 0.6 µ가 적재되어 있습니다. L 침대 |
참고문헌
- Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
- Karas, M., Hillenkamp, F.
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재인쇄 및 허가
