이 기사에서는 전기 분무 이온 이동성 - 질량 분광법, 반 경험적 양자 계산 및 에너지 해결 임계 충돌 유도 해리를 사용하여 관련 삼원 금속 착물의 해리의 상대적 열화학을 측정하는 실험 프로토콜을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
이 기사에서는 전기 분무 이온 이동성 - 질량 분광법 (ES-IM-MS) 및 에너지 분해 임계 충돌 유도 해리 (TCID)를 사용하여 음전하를 띤 [amb + M (II) + NTA]- 삼원 복합체를 두 개의 제품 채널로 해리시키는 열화학을 측정하는 실험 프로토콜을 설명합니다 : [amb + M (II)] + NTA 또는 [NTA + M (II)]- + amb, 여기서 M=Zn 또는 Ni이고 NTA는 니트릴로트리아세트산이다. 상기 복합체는 1차 구조를 갖는 대체 금속 결합(amb) 헵타펩타이드 중 하나를 함유하며, 여기서 아미노산은 아세틸-His 1-Cys 2-Gly 3-Pro 4-Tyr 5-His 6-Cys 7 또는 아세틸-Asp1-Cys 2-Gly3-Pro 4-Tyr 5-His 6-Cys7이며, 여기서 아미노산' Aa 1,2,6,7 위치는 잠재적인 금속 결합 부위이다. 삼항 복합체와 그 제품의 기하학적으로 최적화된 고정 상태는 양자 화학 계산(현재 PM6 반경험적 해밀턴)에서 전자 에너지와 충돌 단면(CCS)을 ES-IM-MS에 의해 측정된 것과 비교하여 선택되었다. PM6 주파수 계산에서, 삼원 복합체 및 그 생성물의 분자 파라미터는 경쟁적인 TCID 방법을 사용하여 두 제품 채널의 에너지 의존적 강도를 모델링하여 해리의 0K 엔탈피(ΔH0)와 관련된 반응의 임계 에너지를 결정한다. PM6 회전 및 진동 주파수를 사용하는 통계 역학 열 및 엔트로피 보정은 해리의 298K 엔탈피를 제공합니다 (ΔH298). 이들 방법은 삼항 금속 이온 착물의 범위에 대한 열화학 및 평형 상수를 결정할 수 있는 EI-IM-MS 루틴을 기술한다.
서론
이 연구는 대체 금속 결합 (amb) 삼원 금속 착물 [amb + M (II) + NTA]의 해리에 대한 상대 열화학의 결정을 허용하는 상업적으로 이용 가능한 이온 이동성 질량 분광계를 사용하는 새로운 기술을 설명합니다 (여기서 M = Zn 또는 Ni 및 NTA = 니트릴로 트리아세트산 (그림 1). 이들 반응은 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)1,2 동안 NTA 고정화된 금속에 부착된 amb-태깅된 재조합 단백질의 해리를 모델링한다. 예로서, 이 방법은 amb A 및 H의 amb 헵타펩티드 태그를 사용하여 기술된다 (도 2) (이전 연구로부터 선택된 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12
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프로토콜
참고: 그림 1 에서는 프로토콜의 개요를 보여 줍니다.
1. 시약의 제조
- 동결건조된 amb 펩티드(>98% 순도)를 구입하여 -80°C 냉동고에 보관한다.
- >99% 순도의 아연(II) 질산염 육수화물과 니켈(II) 질산염 육수화물을 구입합니다.
주의: 니켈(II) 질산염 육수화물은 환경 및 건강에 위험을 초래합니다. - 니트릴로트리아세트산, 폴리DL-알라닌 중합체, 초순수/미량 금속 등급 암모늄 아세테이트, 수산화암모늄, 빙초산 및 HPLC 등급 아세토니트릴을 구입하십시오.
2. 스톡 솔루션의 준비
- 펩티드 amb 원액
- 12.5 mM amb 농도의 수용액을 제조하여 10-20 mg의 동결건조된 펩타이드를 칭량하여 3가지 이상의 유의한 수치를 사용하고 이를 1.7 mL 폴리프로필렌 마이크로원심분리 튜브에 넣었다.
- 적절한 부피의 탈이온수 (>17.8 MΩ cm)를 마이크로 원심분리 튜브에 첨가하십시오. 뚜껑을 닫고 적어도 20 개의 반전과 잘 섞으십시오.
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결과
A 및 H의 삼항 복합체를 [amb+M(II)]- + NTA 또는 [NTA+M(II)]- + amb로 [amb+M(II)+NTA]- + amb로 경쟁적 충돌-유도된 해리가 도 3에 도시되어 있다. amb는 A 또는 H로 표시되고 M=Zn 또는 Ni로 표시된다. [A+Zn(II)+NTA]- 삼원 복합체(도 3A)는 [A+Zn(II)]를 생성하기 위해 약 0.7eV 충돌 에너지(CE)의 겉보기 임계값을 나타내고 [NTA+Zn(II)]-를 생성하기 위해 약 0.9eV를 나타낸다. [A+Ni(II)+NTA]- 복합체(그림 3B)의 해리는 [N.......
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토론
중요한 단계
ES-IM-MS 역치 충돌 유도 해리(TCID) 분석. TCID는 아르곤의 존재하에 전달 T-파 셀을 충돌 셀로 사용했다. 해리 전에, 전구체 이온은 이온 이동성 (IM) 셀을 통과 할 때 질소 가스와의 저에너지 충돌에 의해 열화됩니다. 이는 트랩을 충돌 셀(6,40)로서 사용함으로써 달성되는 것보다 더 재현가능한 에너지 분해능 TCID를 초래한다. 해리 전에 [amb + M (II) + NTA]- 의 열화는 또한 삼원 복합체의 사용 가능한 내부 에너지가 298K 온도를 사용하여 특성화 될 수있게합니다. 전달 세포에서의 해리는 또한 삼원 복합체를 의미하며 그의 생성물 이온은 검출기에서 동일한 평균 도달 시간을 가지며, 이는 전달 세포에서만 발생한 삼원 복합체의 해리를 확인하는데 유용했다. 해리가 발생할 수 있는 다른 영역은 ES.......
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 자료는 1764436, NSF REU 프로그램 (CHE-1659852), NSF 계측기 지원 (MRI-0821247), 성공을위한 물리학 및 천문학 장학금 (PASS) NSF 프로젝트 (1643567), 웰치 재단 (T-0014) 및 에너지부 (TX-W-20090427-0004-50) 및 L3 통신의 컴퓨팅 자원에 따라 국립 과학 재단이 지원하는 작업을 기반으로합니다. 저자들은 CRUNCH 프로그램을 공유하고 PBA의 피팅에 대한 조언을 해준 Kent M. Ervin (University of Nevada - Reno)과 Peter B. Armentrout (University of Utah)에게 감사드립니다. 저자들은 시그마 프로그램을 공유해 준 캘리포니아 대학교 산타바바라의 마이클 T. 보워(Michael T. Bower) 그룹에게 감사를 표한다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아세토니트릴 HPLC 등급 | Fisher Scientific (www.Fishersci.com) | A998SK-4 | |
| 대체 금속 결합(amb) 펩타이드 | PepmicCo (www.pepmic.com) | 설계 펩타이드는 | |
| 아세트산 암모늄(초순수) | VWR | 97061-014 | |
| 수산화암모늄(미량 금속 등급) | Fisher Scientific(www.Fishersci.com) | A512-P500 | |
| Driftscope 2.1 소프트웨어 프로그램 | Waters (www.waters.com) | 소프트웨어 분석 프로그램 | |
| Gaussian 09 | Gaussian | Electronic Structure Modeling Software | |
| GaussView | 빙 | ||
| 초산 (Optima grade) | Fisher Scientific (www.Fishersci.com) | A465-250 | |
| 이온 스케일 Lennard-Jones (LJ) 방법 | Sigma | Michael T. Bowers의 산타 바바라 캘리포니아 대학교 그룹 | |
| MassLynx 4.1 | Waters (www.waters.com) | 소프트웨어 분석 프로그램 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브 | VWR | 87003-294 | 1.7 mL, 폴리프로필렌 |
| 마이크로 원심분리기 튜브 | VWR | 87003-298 | 2.0 mL, 폴리프로필렌 |
| Ni(II) 질산염 육수화물(99% 순도) | Sigma-Aldrich(www.sigmaaldrich.com) | A15540 | |
| 폴리-DL-알라닌 | Sigma-Aldrich(www.sigmaaldrich.com) | P9003-25MG | |
| Waters Synapt G1 HDMS | Waters(www.waters.com) | 사중극자 - 이온 이동성 - 비행 시간 질량 분석기 | |
| Zn(II) 질산 육수화물(99%+ 순도) | Alfa Aesar (www.alfa.com) | 12313 |
참고문헌
- Kim, Y. -M., Chen, P. Ligand binding energy in [(bipy)Rh(PCH)]+ by collision-induced dissociation threshold measurements. International Journal of Mass Spectrometry. 202 (1-3), 1-3 (2000).
- Plattner, D.
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재인쇄 및 허가
