쥐 골수 기질 세포 배양에서 조혈 세포를 줄이기 위해 낮은 산소 장력 활용

요약

골수 기질 세포(BMSC)의 일상적인 배양은 많은 세포가 조혈 기원인 이질적인 세포 집단의 분리로 이어집니다. 여기에서는 쥐 BMSC 배양에서 조혈 오염 물질을 크게 줄이기 위해 낮은 산소 장력을 활용하는 방법에 대해 설명합니다.

초록

현재로서는 동질적인 골격 줄기 세포(SSC) 집단을 전향적으로 분리하기 위해 보편적으로 받아들여지는 마커가 부족합니다. 이러한 이유로 조혈을 지원하고 골격의 모든 기능에 기여하는 BMSC는 다능 중간엽 전구세포(MMP)를 연구하고 SSC 기능을 추론하는 데 계속 널리 사용되고 있습니다. 더욱이, 근골격계 질환을 연구하는 데 사용되는 형질전환 쥐 모델의 폭을 감안할 때, BMSC의 사용은 MMP와 SSC를 조절하는 분자 메커니즘을 조사하는 강력한 도구로도 작용합니다. 그러나 쥐 BMSC에 대한 일반적인 분리 절차로 인해 회수된 세포의 50% 이상이 조혈 기원이 되어 이러한 연구 중에 생성된 데이터의 해석을 방해할 수 있습니다. 여기에서는 BMSC 배양에서 CD45⁺ 세포를 선택적으로 제거하기 위해 낮은 산소 장력 또는 저산소증을 사용하는 방법을 설명합니다. 중요한 것은 이 방법을 쉽게 구현하여 조혈성 오염 물질을 줄일 수 있을 뿐만 아니라 BMSC 배양에서 MMP 및 추정 SSC의 비율을 높일 수 있다는 것입니다.

서론

조혈모세포(HSC)와 유사하게, SSC는 뼈 미세환경 내에 존재합니다. 그러나 HSC와 달리 현재 SSC ^1,2,3을 전향적으로 식별하는 데 사용할 수 있는 보편적으로 허용되는 세포 표면 마커가 부족합니다. 그러나 체외 배양 시스템 및 생체 내 재구성 분석은 BMSC의 일부가 조혈을 지원할 수 있는 능력과 중간엽 계통의 모든 세포로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있음을 보여줍니다 ^4,5. 따라서 BMSC는 매우 이질적인 집단을 나타내지만, 이러한 세포의 일부는 기원 조직의 모든 세포를 자가 재생하고 재구성하는 능력으로 정의되는 진정한 줄기 세포의 특징을 가지고 있습니다. 또한, 세포 표면 마커의 사용과 달리 BMSC는 조직 배양 플라스틱에 대한 빠른 부착을 기반으로 신속하게 분리할 수 있습니다 ^6,7. 이러한 이....

프로토콜

쥐 모델을 사용하여 설명된 모든 방법은 승인된 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee) 프로토콜(A187-19-08)에 따라 수행되었습니다.

1. 뒷다리 뼈 절개

1. 10-12주 된 수컷 또는 암컷 C57BL/6 마우스를 2-4L/min의 유속을 사용하여 CO₂ 질식으로 안락사시킨 후 참수로 사망을 확인합니다. 암컷 또는 수컷 마우스를 이 분석에 사용할 수 있으며 결과에서 예상되는 차이는 없습니다. 털에 70% 에탄올을 뿌립니다.
2. 멸균 수술용 집게와 가위를 사용하여 흉골 아래 피부를 작게 절개합니다. 손을 사용하여 몸 둘레의 피부를 찢은 다음 피부를 뒷다리 쪽으로 원위적으로 당겨 아래 조직을 노출시킵니다.
3. 멸균된 수술용 집게와 가위를 사용하여 대퇴골두(볼)와 골반(엉덩이)의 비구(소켓)를 분리하여 뒷다리를 부드럽게 제거합니다. 멸균 집게와 메스를 사용하여 뼈를 따라 부드럽게 긁어 연조직을 최대한 많이 제거합니다.
4. 멸균 메스를 사용하여 최소한의 저항으로 대퇴골과 경골을 분리하고 두 뼈를 연결하는 인대(측면 및 내측 ....

결과

7일간의 세포 분리 후 21% 산소에서 배양된 세포는 매우 이질적입니다. 구체적으로 말하자면, 크기가 큰 양극성 세포는 여러 개의 돌기를 포함하는 작은 세포와 간격을 두고 있습니다(그림 1A). 대조적으로, 저산소 조건에서 자란 세포는 매우 균질합니다. 군체 내의 세포는 크기가 비교적 비슷하고 양극성 모양을 가지고 있어 조직 배양 플라스틱에서 자란 중간엽 기원의 다른 세포와 유사합니다(그림 1B). 배양 후 14일 후 클론생성 밀도에서 정상 산소 배양에서 유지된 세포는 T25cm² 플라스크당 약 5-30개의 콜로니를 가지고 있으며, 이는 저산소 조건에서 자란 콜로니와 비교할 때 크기가 더 작습니다(그림 2A). 특히, 저산소증에서 성장한 세포는 T25cm² 플라스크당 50-120개의 콜로니 형성으로 특징지어지는 견고한 콜로니 형성으.......

토론

본 연구의 관찰에 따르면, BMSC는 대식세포 및 조혈 기원의 다른 세포보다 먼저 조직 배양 플라스틱에 부착된다¹¹. 이러한 이유로 도금 3시간 후 플레이트를 헹구는 것은 나중에 부착될 가능성이 있는 부유 조혈 세포를 제거하기 때문에 중요한 단계입니다. 또한, 이러한 헹굼은 아직 매트릭스를 배치하지 않고 조직 배양 접시에 퍼지지 않은 느슨하게 부착된 둥근 BMSC의 파괴를 방지하기 위해 접시 측면에 배지를 피펫팅하여 조심스럽게 수행해야 합니다. 세 번 헹구면 대부분의 떠 있는 세포를 제거해야 합니다. 이 시점에서 BMSC 배양을 헹구면 CD45⁺ 세포가 감소하지만, 조혈 세포의 비율을 현저히 감소시키고 기질 세포의 비율을 증가시키기 위해서는 저산소증에서 배양을 유지해야 한다¹¹. 중요한 것은 72시간 후에도 집락이 나타나지 않으면 헹굼이 너무 가혹하여 BMSC와 조.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
100mm2 조직 배양 접시	Corning	353003
1x 인산염 담황 식염수(PBS)	Gibco	100010-023
Bright-Line 혈구계	Sigma-Aldrich	Z359629
C57BL/6J	Jackson Laboratory	664
HyClone 소 태아 혈청(미국), GE	Healthcare Life 특성 Sciences	SH30071.03
InvivO2 400	Baker Ruskinn	https://bakerco.com
MEMα, 뉴클레오시드	Gibco	12571-063
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
적혈구 용해 완충액 Hybri-Max	Sigma-Aldrich	R7757
T-25cm2  조직 배양 플라스크	Corning	430168
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154
Trypsin-EDTA (0.25%), 페놀 레드	Gibco	25200-056