Na+에 대한 내부 미토콘드리아 막 민감도, 부분적으로 분할된 기능적 CoQ 풀 공개

요약

이 프로토콜은 Na⁺의 존재 또는 부재 하에 미토콘드리아 복합 활성 CI+CIII 및 CII+CIII를 사용하여 부분적으로 분할된 기능적 CoQ 풀의 존재를 연구하는 비교 분석을 기술한다.

초록

내부 미토콘드리아 막 (IMM)의 유비퀴논 (CoQ) 풀은 부분적으로 복합체 I 또는 FAD 의존성 효소로 분할된다. 이러한 세분은 동결-해동된 미토콘드리아에서 전자 공여체로서 NADH 또는 숙시네이트를 사용하는 비교 검정에 의해 용이하게 평가될 수 있으며, 여기서 시토크롬 c(cyt c) 감소가 측정된다. 이 분석은 IMM에 대한 Na⁺의 효과에 의존하여 유동성을 감소시킵니다. 여기에서, NaCl 또는 KCl의 존재 하에서 NADH-cyt c 산화환원효소 활성 및 숙시네이트-cyt c 산화환원효소 활성을 측정하기 위한 프로토콜을 제시한다. 단계적으로 큐벳 내의 시약의 혼합물에 의존하는 반응은 Na+ 또는 K⁺의 존재하에 4분 동안 분광광도법으로 측정된다. 동일한 혼합물은 흡광도의 비특이적 변화를 뺄 수 있도록 특정 효소 억제제의 존재 하에 병렬로 수행된다. NADH-cyt c 산화환원효소 활성은 이들 양이온 중 임의의 존재하에서 감소하지 않는다. 그러나, 숙시네이트-cyt c 옥시도리덕타제 활성은 NaCl의 존재하에서 감소한다. 이 간단한 실험은 다음을 강조합니다 : 1) IMM 유동성 및 CoQ 전달을 감소^{시키는 Na +}의 효과; 2) 초복합 I+_III2가 유비퀴논(CoQ) 전달이 IMM 유동성을 저하시킴으로써 영향을 받지 않도록 보호한다는 것; 3) CII와 CIII 사이의 CoQ 전송이 CII와 CIII 사이의 CoQ 전달과 기능적으로 다르다는 것. 이러한 사실은 IMM에서 기능적으로 차별화 된 CoQ 풀의 존재를 뒷받침하며 미토콘드리아의 변화하는 Na ⁺ 환경에 의해 조절 될 수 있음을 보여줍니다.

서론

미토콘드리아 산화 인산화 시스템 (OXPHOS)은 미토콘드리아에 의한 아데노신 트리포스페이트 (ATP) 합성, 반응성 산소 종 (ROS) 생산, 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 (NADH) 또는 숙시네이트와 같은 환원 등가물의 소비를 유도하는 주요 경로이다. OXPHOS 시스템은 다섯 가지 단백질 복합체로 구성됩니다 : 복합체 I (CI)는 NADH를 산화시키고 CoQ를 유비퀴놀 (CoQH2)로 환원시킵니다. 콤플렉스 II (CII)는 숙시네이트를 푸마레이트로 산화시키고 CoQ를 CoQH2로 환원시킵니다. 콤플렉스 III (CIII)은 CoQH2를 다시 CoQ로 산화시켜 시토크롬 c (cyt c)를 감소시킵니다. 마지막으로, 복합 IV (CIV)는 cyt c를 산화시키고 산소를 물로 감소시킵니다. 이른바 전자 수송 사슬(mETC)이라고 불리는 이 산화환원 사슬은 IMM을 가로질러 H⁺의 펌핑에 결합되며, 이는 아데노신 디포스페이트(ADP)를 ATP로 인산화시키기 위해 복합 V(CV)에 의해 사용되는 전기화학적 구배를 생성한다.

mETC 복합체는 IMM에서 단독으로 있거나 수퍼 콤플렉스라는 사차 구조로 조립 될 수 있습니다. CIV는 CIII와 함께 조립하여<....

프로토콜

모든 동물 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드에 따라 수행되었으며 2010년 9월 22일 유럽 연합 지침(2010/63/UE)과 2013년 2월 1일(53/2013)의 스페인 왕실 법령에 따라 스페인 Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III(CNIC)의 기관 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 사용 된 동물의 수와 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.

참고: 미토콘드리아 CoQ 풀의 세분화를 연구하기 위한 이 비교 분석은 다음과 같이 기술된다:

1. 단백질 정량화

1. 실험 전에 야생형 마우스 간(즉, 미토콘드리아 막)으로부터 분리된 미토콘드리아(²⁶ )를 세 번 동결 및 해동하여 소기관을 반응 기질에 투과성으로 만든다.
2. 분리된 미토콘드리아 샘플의 단백질 양을 브래드포드 또는 비친코닌산(BCA) 방법에 의해 정량한다. 브래드포드의 경우, 샘플 2μL를 1x 브래드포드 시약 1mL에 첨가한다.
3. 샘플을 각각 20 μg의 네 개의 서브샘플로 분할한다(즉: A, B, C, D;

결과

이 프로토콜의 일반적인 결과는 아래에 나와 있습니다(그림 3). 감소된 cyt c 흡광도가 550 nm에서 위치함에 따라, 억제되지 않은 모든 서브샘플은 550 nm에서 흡광도의 증가를 보여줘야 한다. 억제된 서브샘플은 이상적으로 평탄한 선 또는 약간 증가하는 기울기를 보여준다(그림 3). 억제된 하위샘플로부터의 기울기는 억제되지 않은 서브샘플로부터 차감되어야 한다.

샘플 A 및 B는 둘 다 그들의 특파원 억제에 의해 보정되고 NADH:cyt c 산화환원효소 활성을 나타내지만, 유사한 기울기를 갖는다(도 3A). 그러나, 하위샘플 C 및 D는, 둘 다 그들의 특파원 억제에 의해 보정되고 숙시네이트:cyt c 산화환원효소 활성을 나타내지만, 서브샘플 C의 활성이 서브샘플 D의 활성보다 높다는 점에서 다르다(

토론

이 프로토콜은 부분적으로 분할된 CoQ 풀의 존재를 식별하는 매우 간단한 절차이지만, 고려해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 기질 (즉, NADH 또는 숙시네이트)은 바람직하게는 이들 화합물의 자가산화가 발생할 수 있기 때문에 마지막으로 첨가된다. Cuvette의 뒤집기는 독서를 방해 할 수있는 거품의 형성을 피하기 위해주의해야합니다.

또한, 본 기술은 언급할 가치가 있는 몇 가지 제한 사항을 제시한다. 측정은 손상되지 않은 미토콘드리아에서 수행되지 않습니다. 따라서, 완충제의 인위적인 함량 및 비율은 미토콘드리아의 천연 환경과의 차이를 초래할 수 있다.
시약은 과량으로 첨가되며, 이들은 무손상 조직에서 기질의 진정한 이용가능성을 나타내지 않을 수 있다.

현재의 방법은 많은 실험실에서 쉽게 구할 수없는 매우 구체적인 유전 모델 및 장비의 생성 및 사용을 의미합니다¹. 이 프로.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
안티마이신 A	시그마-알드리치	A8674
소 혈청 알부민(BSA)	시그마-알드리치	10775835001
브래드포드 단백질 분석	바이오-라드	5000001
사이토크롬 c	시그마-알드리치	C7752
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P3786
KCl	시그마-알드리치	P3911
말론산	시그마-알드리치	M1296
MgCl2	시그마-알드리치	M8266
NaCl	시그마-알드리치	S9888
NADH	로슈	10107735001
시안화칼	시그마-알드리치	207810
Rotenone	시그마 Aldrich	R8875
분광 매니저 소프트웨어	JASCO	버전 2
분광 광도계	UV/VISJASCO
숙시네이트	시그마 Aldrich	398055

말 심장의 륨