Method Article

진공 안정화 이미징 시스템을 이용한 실험적 급성 폐 손상에서의 폐 미세순환의 생체내 광역 형광 현미경 검사

DOI:

10.3791/63733

⸱

April 6th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, Dalhousie University, 2Department of Microbiology and Immunology, Dalhousie University, 3Department of Neuroscience, Dalhousie University, 4Department of Anesthesia, Pain Management, and Perioperative Medicine, Dalhousie University, 5Live Cell Imaging Center, University of Calgary, 6Department of Physiology and Pharmacology, University of Calgary, 7Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Calgary, 8Department of Pharmacology, Dalhousie University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

생체 내 형광 현미경 검사는 백혈구 - 내피 상호 작용 및 모세관 관류를 실시간으로 연구하는 데 활용 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 진공-안정화된 폐 영상화 시스템을 사용하여 폐 미세순환에서 이러한 파라미터를 영상화하고 정량화하는 방법을 기술한다.

Abstract

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백혈구 - 내피 상호 작용의 생체 내 영상은 살아있는 동물의 면역 매개 질환에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 생체 내에서 급성 폐 손상 (ALI) / 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS) 및 기타 호흡 병리에 대한 연구는 제한된 접근성과 폐의 고유 한 운동 아티팩트로 인해 어렵습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 도전을 극복하기 위해 다양한 접근법이 개발되었습니다. 이 프로토콜은 ALI의 실험 모델에서 폐 미세순환에서의 실시간 백혈구-내피 상호작용을 연구하기 위해 생체내 형광 현미경 검사에 대한 방법을 기술한다. 생체 내 폐 영상 시스템과 3-D 프린팅된 생체내 현미경 플랫폼은 마취된 마우스를 고정하고 폐를 안정화시키면서 혼란스러운 폐 손상을 최소화하는 데 사용됩니다. 준비 후, 광역 형광 현미경 검사는 백혈구 부착, 백혈구 롤링 및 모세관 기능을 연구하는 데 사용됩니다. 여기에 제시된 프로토콜은 염증성 폐 질환의 급성 모델에서의 이미징에 초점을 맞추지 만, 폐의 다른 병리학 적 및 생리적 과정을 연구하기 위해 적용될 수도 있습니다.

Introduction

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생체 내 현미경 (IVM)은 생체 내에서 다양한 생물 물리학 적 과정을 시각화하고 연구하는 데 유용한 이미징 도구입니다. 폐는 밀폐 된 위치, 조직의 깨지기 쉬운 특성 및 호흡 및 심장 박동에 의해 유도 된 모션 아티팩트 1,2로 인해 생체 내에서 이미지화하기가 매우 어렵습니다. 이러한 도전을 극복하기 위해 폐 미세순환에서 백혈구-내피 상호작용의 실시간 이미징을 위해 다양한 생체내 현미경(IVM) 설정이 개발되었습니다. 이러한 접근법은 영상화를 위해 폐를 외과 적으로 노출시키고 안정화시키는 것을 기반으로합니다.

동물은 전형적으로 외과적 절차에 의해 폐 IVM을 위해 제조된다. 첫째, 동물들은 삽관되고 환기되어 흉부 창문을 외과 적으로 절제하고 이미징을 위해 폐를 안정시키기위한 후속 개입을 허용합니다. 한 가지 기술은 실질종을 유리 커버 슬립3에 붙이는 것인데, 이는 이미지 된 조직에 심각한 신체적 외상을 줄 위험이 있습니다. 보다 진보된 것은 유리 창 하에서 폐를 안정화시키기 위한 진공 시스템의 활용이다(4). 이 설정은 ....

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Protocol

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여기에 설명 된 모든 절차는 Dalhousie University Committee on Laboratory Animals (UCLA)의 사전 승인을 받아 수행되었습니다.

1. 준비

  1. 폐 이미징 시스템 : 창을 준비하려면 진공 채널의 오염을 피하면서 외부 링의 상단에 얇은 진공 그리스를 투여하십시오. 깨끗한 8mm 유리 커버슬립을 창문에 놓고 부드럽게 눌러 씰을 만듭니다.
  2. 광역 형광 현미경: 20x/0.40 장거리 대물렌즈와 프레임 속도가 25FPS인 흑백 전하 결합 장치(CCD) 카메라가 장착된 기존의 광역 형광 현미경으로 이미징을 수행합니다. 530-550nm 대역통과 여기 필터를 적용하여 로다민-6G를 여기시키고 460-490nm 대역통과 필터를 적용하여 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)를 여기시킵니다.
  3. 진공 시스템: 보충 그림 1과 같이 50-60mmHg 일정한 흡입을 제공할 수 있는 디지털 압력 게이지가 장착된 진공 펌프에 이미징 창을 연결합니다. 간단히 말해서, 이미징 윈도우를 1.0 mm I.D. 폴리에틸렌 튜빙, 1.0 cm I.D. 폴리에틸렌 튜빙, 진공 플라스크 및 인라인 0.2 μm 필터를 통해 펌프에 연....

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Results

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이 프로토콜을 통해 달성가능한 결과를 예시하기 위해, 급성 폐 손상 (ALI)은 비강 내 박테리아 리포폴리사카라이드 (LPS) 점적의 모델을 사용하여 이미징하기 전에 6 h 동안 유도되었다. 간단히 말해서, 마우스 (n = 3)는 이소플루란으로 마취되었고, 멸균 식염수 (10 mg / mL)의 슈도모나스 aeruginosa 의 LPS의 작은 물방울을 5 mg / kg의 용량으로 왼쪽 나리스에 피펫팅했습니다. 이를 순진한 마우스와 비교하였다 (n=3; 비내 투여 없음).

이미징시 성공적인 수술 준비는 여러 가지 요인으로 식별 할 수 있습니다. 폐는 25 μm 이하의 순환 프레임 시프트를 일으키는 호흡으로 비교적 안정적이어야합니다. 폐포는 명확하게 볼 수 있어야하며 갯벌 팽만감 / 수축을 나타낼 수 있습니다. 청색광 (450-490 nm 파장)에 의한 여기는 혈류 방향성의 시각화를 허용하며, 개별 적혈구 (보충 영화 1, 보충 영화

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Discussion

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여기에 제시된 프로토콜은 몇 가지 중요한 단계에 대한 연습과주의가 필요합니다. 첫째, 삽관 및 수술을 시작하기 전에 이미징 창을 준비하는 것이 중요합니다. 최소한의 진공 그리스를 사용하여 이미징 창의 외부 링을 코팅하고, 커버 글라스를 적용하고, 증류수 한 방울로 흡입을 테스트합니다. 이것을 미리 준비하면 그렇지 않으면 설치 중에 노출 된 폐가 건조되는 것을 방지 할 수 있습니다. 따뜻한 식염수로 씻어 낼 수는 있지만 그렇게하면 깨지기 쉬운 폐 조직이 손상 될 위험이 있습니다.

삽관 후, 마우스를 IVM 플랫폼으로 옮기는 동안, 캐뉼러는 때때로 변위될 수 있다. 이를 방지하려면 캐뉼라를 마우스의 앞니에 묶거나 입 주위의 피부에 봉합하는 것을 고려하십시오. 압력 조절 환기를 사용하는 경우 절차 전반에 걸쳐 조력량을주의 깊게 모니터링해야합니다. 약 0.20 mL에서 일정하게 유지되어야하며, 상당히 낮은 값 (예 : ~ 0.10 mL)은 단일 폐 환기를 나타낼 수 있습니다. 이 경우 .......

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Disclosures

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Kamala D. Patel 박사는 Luxidea의 사장이자 공동 설립자이며,이 실험에서 활용 된 이미징 창을 구입 한 기업입니다.

Acknowledgements

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저자는이 원고의 편집 및 수정에 상당한 전문 지식을 제공 한 Pina Colarusso 박사에게 감사하고 싶습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL BD Luer Slip Tip 주사기 멸균, 일회용Becton, Dickinson and Company3096591 mL 주사기
ADSON 드레싱 집게, 팁 너비 0.6 mm, 톱니 길이 11.5 mm, 12 cmRWD Life Science Co.F12002-12무딘 집게
알부민 - 플루오레세인 이소 티오 시아네이시그마 - 알드리치A9771-1GFITC- 알부민
알코올 면봉 이소 프로필 알코올 70 % V / V캐나다 사용자 정의 포장 회사80002455알코올 닦음
AVDC110 고급 디지털 비디오 컨버터Canopus00631069602029디지털 비디오 컨버터
B / W - CCD - 카메라혼 이미징BC-71카메라
Bovie Deluxe 고온 소작 키트파인 사이언스 도구18010-00소작기
C57BL/6 마우스Charles River Laboratories InternationalC57BL/6NCrlC57BL/6 마우스
코튼 팁 애플리케이터Puritan806-WCCotton 애플리케이터
CS-8R 8mm 라운드 유리 커버슬립워너 인스트루먼트64-0701유리 커버슬립
디지털 압력계ITM Instruments Inc.DG2551L0NAM02L0IM& V디지털 압력 게이지
Dr Mom Slimline 스테인리스 LED 검이경Dr. Mom 검이경1001검이경
에틸 알콜 95% Vol상업용 알코올P016EA9595% 에탄올
미세 가위 - 마르텐사이트 스테인리스 스틸미세 과학 도구14094-11가위
Fisherbrand 컬러 라벨링 테이프피셔 사이언티픽1590110라벨링 테이프
Gast DOA-P704-AA 대용량 진공 펌프Cole-Parmer Canada CompanyZA-07061-40진공 펌프
Hartman HemostatsFine Science Tools13003-10지혈 집게
고진공 그리스Dow CorningDC976VF진공 그리스
Isoflurane USPFresenius KabiCP0406V2Isoflurane
LIDOcaine HCl 주입 1% 50mg/5mLTeligent Canada0121AD01리도카인 HCl 1%
폐 수술BoardLuxidea, Inc.IMCH-0001폐의 생체 내 현미경 검사용으로 설계
미네랄 오일Teva Canada00485802미네랄 오일
마우스 기관내 삽관 키트Kent Scientific CorporationETI-MSE삽관 스탠드, 마취 마스크, 20G 기관내 캐뉼라, 광섬유 케이블
MST49 형광 현미경Leica Microsystems10 450 022형광 현미경
N Plan L 20x/0.40 긴 작동 거리 현미경 대물Leica Microsystems56603520x 대물렌즈
부직포 스폰지 2" x 2"AMD-RitmedA2101-CH거
즈 Optixcare 눈 윤활제 플러스Aventix5914322눈물 젤
Original Prusa i3 MK3S+ 3D 프린터Prusa ResearchPRI-MK3S-KIT-ORG-PEI3D 프린터
산소, 압축 린데 캐나다 Inc.산소
PrecisionGlide 바늘 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm)Becton, Dickinson and Company30510630 G 바늘
Pyrex 5340-2L 5340 필터링 플라스크, 2000 mLCole-Parmer Canada Company5340-2L진공 플라스크
Rhodamine 6 GSigma-Aldrich252433Rhodamine 6G
Secure Soft Cloth Medical Tape - 3"PrimedPM5-630709천 테이프
실라스틱 의료용 튜빙 .040 in. ID x .085 인치 ODDow Corning602-2051.0mm I.D. 폴리에틸렌 튜빙
Somnosuite 저유량 마취 시스템Kent Scientific CorporationSS-01, SS-04-모듈소형 설치류 인공호흡기, 저유량 마취 시스템, 가열 패드, 직장 온도 프로브, 맥박 산소 측정기
조직 집게, 길이 12.5cm, 곡선, 1 x 2 치아세계 정밀 기기501216톱니 집게
Transpore 의료용 테이프, 1527-1, 1인치 x 10야드(2.5cm x 9.1m)3M7000002795의료용 테이프
튜브, 투명, 3/8인치 내부 직경Grainger CanadaUSSZUSA-HT33141.0 cm I.D. 폴리에틸렌 튜빙
Whatman 6720-5002 50 mm 인라인 필터, PTFE, 0.2 &마이크로; mCole-Parmer Canada Company6720-5002인라인 0.2&마이크로; M 필터
트 렌즈

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471(2021).
  2. Gaertner, M., et al.

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Intravital MicroscopyPulmonary MicrocirculationAcute Lung InjuryWidefield FluorescenceLeukocyte AdhesionLeukocyte RollingCapillary PerfusionVacuum Stabilized ImagingPulmonary InflammationMouse Lung Imaging

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