생체 내 형광 현미경 검사는 백혈구 - 내피 상호 작용 및 모세관 관류를 실시간으로 연구하는 데 활용 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 진공-안정화된 폐 영상화 시스템을 사용하여 폐 미세순환에서 이러한 파라미터를 영상화하고 정량화하는 방법을 기술한다.
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방법 논문
진공 안정화 이미징 시스템을 이용한 실험적 급성 폐 손상에서의 폐 미세순환의 생체내 광역 형광 현미경 검사
이 논문에서
요약
초록
백혈구 - 내피 상호 작용의 생체 내 영상은 살아있는 동물의 면역 매개 질환에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 생체 내에서 급성 폐 손상 (ALI) / 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS) 및 기타 호흡 병리에 대한 연구는 제한된 접근성과 폐의 고유 한 운동 아티팩트로 인해 어렵습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 도전을 극복하기 위해 다양한 접근법이 개발되었습니다. 이 프로토콜은 ALI의 실험 모델에서 폐 미세순환에서의 실시간 백혈구-내피 상호작용을 연구하기 위해 생체내 형광 현미경 검사에 대한 방법을 기술한다. 생체 내 폐 영상 시스템과 3-D 프린팅된 생체내 현미경 플랫폼은 마취된 마우스를 고정하고 폐를 안정화시키면서 혼란스러운 폐 손상을 최소화하는 데 사용됩니다. 준비 후, 광역 형광 현미경 검사는 백혈구 부착, 백혈구 롤링 및 모세관 기능을 연구하는 데 사용됩니다. 여기에 제시된 프로토콜은 염증성 폐 질환의 급성 모델에서의 이미징에 초점을 맞추지 만, 폐의 다른 병리학 적 및 생리적 과정을 연구하기 위해 적용될 수도 있습니다.
서론
생체 내 현미경 (IVM)은 생체 내에서 다양한 생물 물리학 적 과정을 시각화하고 연구하는 데 유용한 이미징 도구입니다. 폐는 밀폐 된 위치, 조직의 깨지기 쉬운 특성 및 호흡 및 심장 박동에 의해 유도 된 모션 아티팩트 1,2로 인해 생체 내에서 이미지화하기가 매우 어렵습니다. 이러한 도전을 극복하기 위해 폐 미세순환에서 백혈구-내피 상호작용의 실시간 이미징을 위해 다양한 생체내 현미경(IVM) 설정이 개발되었습니다. 이러한 접근법은 영상화를 위해 폐를 외과 적으로 노출시키고 안정화시키는 것을 기반으로합니다.
동물은 전형적으로 외과적 절차에 의해 폐 IVM을 위해 제조된다. 첫째, 동물들은 삽관되고 환기되어 흉부 창문을 외과 적으로 절제하고 이미징을 위해 폐를 안정시키기위한 후속 개입을 허용합니다. 한 가지 기술은 실질종을 유리 커버 슬립3에 붙이는 것인데, 이는 이미지 된 조직에 심각한 신체적 외상을 줄 위험이 있습니다. 보다 진보된 것은 유리 창 하에서 폐를 안정화시키기 위한 진공 시스템의 활용이다(4). 이 설정은 ....
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프로토콜
여기에 설명 된 모든 절차는 Dalhousie University Committee on Laboratory Animals (UCLA)의 사전 승인을 받아 수행되었습니다.
1. 준비
- 폐 이미징 시스템 : 창을 준비하려면 진공 채널의 오염을 피하면서 외부 링의 상단에 얇은 진공 그리스를 투여하십시오. 깨끗한 8mm 유리 커버슬립을 창문에 놓고 부드럽게 눌러 씰을 만듭니다.
- 광역 형광 현미경: 20x/0.40 장거리 대물렌즈와 프레임 속도가 25FPS인 흑백 전하 결합 장치(CCD) 카메라가 장착된 기존의 광역 형광 현미경으로 이미징을 수행합니다. 530-550nm 대역통과 여기 필터를 적용하여 로다민-6G를 여기시키고 460-490nm 대역통과 필터를 적용하여 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)를 여기시킵니다.
- 진공 시스템: 보충 그림 1과 같이 50-60mmHg 일정한 흡입을 제공할 수 있는 디지털 압력 게이지가 장착된 진공 펌프에 이미징 창을 연결합니다. 간단히 말해서, 이미징 윈도우를 1.0 mm I.D. 폴리에틸렌 튜빙, 1.0 cm I.D. 폴리에틸렌 튜빙, 진공 플라스크 및 인라인 0.2 μm 필터를 통해 펌프에 연....
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결과
이 프로토콜을 통해 달성가능한 결과를 예시하기 위해, 급성 폐 손상 (ALI)은 비강 내 박테리아 리포폴리사카라이드 (LPS) 점적의 모델을 사용하여 이미징하기 전에 6 h 동안 유도되었다. 간단히 말해서, 마우스 (n = 3)는 이소플루란으로 마취되었고, 멸균 식염수 (10 mg / mL)의 슈도모나스 aeruginosa 의 LPS의 작은 물방울을 5 mg / kg의 용량으로 왼쪽 나리스에 피펫팅했습니다. 이를 순진한 마우스와 비교하였다 (n=3; 비내 투여 없음).
이미징시 성공적인 수술 준비는 여러 가지 요인으로 식별 할 수 있습니다. 폐는 25 μm 이하의 순환 프레임 시프트를 일으키는 호흡으로 비교적 안정적이어야합니다. 폐포는 명확하게 볼 수 있어야하며 갯벌 팽만감 / 수축을 나타낼 수 있습니다. 청색광 (450-490 nm 파장)에 의한 여기는 혈류 방향성의 시각화를 허용하며, 개별 적혈구 (보충 영화 1, 보충 영화
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토론
여기에 제시된 프로토콜은 몇 가지 중요한 단계에 대한 연습과주의가 필요합니다. 첫째, 삽관 및 수술을 시작하기 전에 이미징 창을 준비하는 것이 중요합니다. 최소한의 진공 그리스를 사용하여 이미징 창의 외부 링을 코팅하고, 커버 글라스를 적용하고, 증류수 한 방울로 흡입을 테스트합니다. 이것을 미리 준비하면 그렇지 않으면 설치 중에 노출 된 폐가 건조되는 것을 방지 할 수 있습니다. 따뜻한 식염수로 씻어 낼 수는 있지만 그렇게하면 깨지기 쉬운 폐 조직이 손상 될 위험이 있습니다.
삽관 후, 마우스를 IVM 플랫폼으로 옮기는 동안, 캐뉼러는 때때로 변위될 수 있다. 이를 방지하려면 캐뉼라를 마우스의 앞니에 묶거나 입 주위의 피부에 봉합하는 것을 고려하십시오. 압력 조절 환기를 사용하는 경우 절차 전반에 걸쳐 조력량을주의 깊게 모니터링해야합니다. 약 0.20 mL에서 일정하게 유지되어야하며, 상당히 낮은 값 (예 : ~ 0.10 mL)은 단일 폐 환기를 나타낼 수 있습니다. 이 경우 .......
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공개 사항
Kamala D. Patel 박사는 Luxidea의 사장이자 공동 설립자이며,이 실험에서 활용 된 이미징 창을 구입 한 기업입니다.
감사의 글
저자는이 원고의 편집 및 수정에 상당한 전문 지식을 제공 한 Pina Colarusso 박사에게 감사하고 싶습니다.
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참고문헌
- Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471(2021).
- Gaertner, M., et al.
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