방법 논문

시냅스에서 구조적, 기능적 변화를 시각화하는 방법

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DOI:

10.3791/63746

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2022년 1월 21일

1Department of Psychology and Neuroscience, Duke Institute for Brain Sciences, Duke University

이 논문에서

초록

논의 된 기사 :

Pekarek, B. T., Hunt, P. J., Belfort, B. D. W., Liu, G., Arenkiel, B. R. CLARITY 조직 청소를 통한 온전한 신경 수상돌기의 이미징 및 정량화. 시각화 실험 저널: JoVE. (170), e62532 (2021).

Frankfurt, M., Bowman, R. 해마 및 전전두엽 피질의 수지상 척추 시각화를 위한 빠른 골지 염색. 시각화 실험 저널: JoVE. (178), e63404 (2021).

Śliwińska, M. A., Cały, A., Szymański, J., Radwańska, K. 수상돌기 가시 연구를 위한 직렬 블록 얼굴 주사 전자 현미경(SBEM). 시각화 실험 저널: JoVE. (176), e62712 (2021).

Chan, U., Gautam, D., West, A. E. 소뇌 과립 뉴런 형태 및 시냅스 발달을 연구하기 위해 생체 내 출생 후 electroporation을 활용합니다. 시각화 실험 저널: JoVE. (172), e62568 (2021).

Cuentas-Condori, A., Miller III, D. M. Caenorhabditis elegans의 수상돌기 가시 이미징. 시각화 실험 저널: JoVE. (175), e62676 (2021).

사설

포유류 뇌의 흥분성 시냅스에서 시냅스 전 방출된 글루타메이트는 시냅스 후 막에 내장된 수용체를 활성화합니다 1,2. 이러한 시냅스 연결의 강도는 다양한 형태의 학습 및 기억을 허용하는 특성인 경험 의존적 가소성을 거칩니다 3,4,5,6,7,8,9. 시냅스 수와 신호 전달 특성의 병리학적 변화는 수많은 신경학적 및 정신 장애에서 나타나는 변경된 회로 활동 및 정보 처리로 이어집니다 10,11,12. 따라서 신경 연결성과 시냅스 연결의 강도를 지배하는 기본 메커니즘을 이해하는 것이 매우 중요합니다.

흥분성 시냅스는 수지상 가시, 스캐폴드 단백질, 수용체, 신호 전달 인자, 세포골격 단백질 및 운송 소기관을 포함하는 작은 시냅스 후 돌출부에 형성됩니다 1,2,13,14,15,16. 이러한 미크론 크기의 신호 구획은 시냅스 단위로 시냅스 강도를 제어할 수 있습니다13,16. 수지상 척추 형태는 신경 수상돌기의 길이에 따라 다양하며, 척추 모양은 일반적으로 얇고, 사상부자형, 뭉툭하고, 버섯 또는 분지형으로 설명됩니다13. 중요한 것은 척추 모양이 시냅스 기능 및 안정성과 상관관계가 있다는 것입니다. 예를 들어, 가시가 클수록 수용체의 수가 증가하고 시냅스 강도가 더 커집니다 16,17,18. 얇은 가시와 달리 더 큰 가시는 생체 내에서 몇 달 동안 지속될 수 있으며, 이는 안정적인 시냅스 연결과 장기 기억 저장을 허용할 수 있는 특성입니다19,20.

수상돌기를 따라 척추 형태와 밀도는 정상 상태와 질병 상태 모두에서 특정 뇌 영역 내에서 신경 연결성 정도와 흥분성 시냅스의 특성을 조사하기 위해 일반적으로 추적됩니다13. 표준 광학 및 형광 현미경, 초고해상도 및 전자 현미경(EM)21을 사용하여 다양한 조직 준비 및 모델 시스템에서 척추 형태를 시각화하기 위한 다양한 방법이 개발되었습니다. 이러한 강력한 이미징 기술은 뇌 조직, 기능 및 질병에 대한 현재 이해에 대한 엄청난 통찰력을 제공했습니다. 이 방법 수집에는 수상돌기와 가시의 형태학적 복잡성을 모니터링하는 중요한 이미징 기술과 수상돌기와 단일 가시의 신경 활동을 활성화하고 측정하는 광유전학적 도구가 포함됩니다.

Pekarek et al.22는 온전한 신경 조직 깊숙한 곳에 있는 신경 수상돌기의 구조를 이미지화하고 정량화하기 위한 비교적 빠르고 처리량이 많은 프로토콜을 제시합니다. 저자는 뇌 조직에서 지질을 제거하고후속 이미징 동안 빛 산란을 최소화하는 데 도움이 되는 조직 제거 기술인 C lear Lipid-exchanged A크릴아미드 혼성화 Rigid Imaging/면역염색/in situ hybridization compatible Tissue-hYdrogel(CLARITY)을 수행합니다. 제거 후, 형광 단백질을 발현하는 뉴런의 Z-스택을 공초점 또는 이광자 현미경으로 수집했습니다. 이미지 분석 및 자동 정량화를 통해 척추 밀도와 모양은 물론 수지상 나무의 복잡성을 정확하게 측정할 수 있었습니다. 이 프로토콜은 단일 척추에서 수지상 나무에 이르는 구조의 동시 이미징을 허용하며 시간이 많이 걸리고 잠재적으로 손상을 줄 수 있는 얇은 단면 절단 단계를 제거합니다. 이 기술은 관심 유전자(들)의 도입 또는 제거 후 온전한 뇌 조직에서 척추 형태 및 수지상 복잡성의 변화를 정량화하려는 연구자에게 매우 유용할 것입니다.

100년 전에개발된 골지체 염색은 신경계 조직과 신경 형태를 시각화하는 강력한 도구로 남아 있습니다. 이 방법에서는 희박한 뉴런 집단을 크롬산은의 미세 결정화에 의해 염색하여 축삭, 수지상 나무 및 가시를 시각화할 수 있습니다25. Frankfurt와 Bowman26 은 쥐 해마와 내측 전두엽 피질의 뉴런과 수지상 가시를 시각화하기 위한 신속한 골지 함침 프로토콜을 자세히 설명합니다. 저자는 후속 광학 현미경을 위해 조직을 준비, 염색 및 이미지화하는 방법과 수지상 나무를 따라 척추 밀도를 정량화하는 방법을 보여줍니다. 여기에 설명된 프로토콜은 뉴런의 일관되고 신뢰할 수 있는 함침을 생성하고 독성 화학 물질에 대한 노출을 줄입니다.

광학 및 형광 현미경은 수상돌기와 가시를 이미징하는 데 매우 적합하지만 EM은 시냅스 전 및 시냅스 후 구조의 나노미터 해상도 시각화를 허용합니다21. EM 접근법은 일반적으로 시냅스 후 밀도의 치수와 시냅스 소포의 수 및 크기를 포함하여 시냅스의 미세구조 특성을 측정하는 데 사용됩니다21. 이 컬렉션에서 Śliwińska et al.27은 해마 마우스 조직에서 Serial Block-face 스캐닝 Electron Microscopy(SBEM)에 의해 3차원(3D) EM 이미지를 획득하는 프로토콜을 제공합니다28,29. 구체적으로, 샘플을 준비하고, 레진에 조직을 매립하고, 샘플을 장착 및 다듬고, SBEM을 수행하고, 이미지를 분석하여 3D 재구성을 생성하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 잘 정의된 멤브레인으로 고대비 이미지를 생성하며 다양한 조직 유형에 맞게 조정할 수 있습니다.

신경계가 발달하는 동안 뉴런은 시냅스 연결이 형성되고 신경 활동에 의해 개선됨에 따라 극적인 형태학적 변화를 겪습니다30,31. 발달 중인 소뇌에서 뉴런 성숙을 추적하기 위해 Chan et al.32는 발달 중인 과립 뉴런의 생체 내 출생 후 전기천공을 위한 프로토콜을 제공합니다. 여기에서 연구원들은 출생 후 새끼 쥐의 후뇌에 DNA를 주입하고 전기천공하여 희박한 뉴런 집단에 형광 단백질을 형질감염시켰습니다. 고해상도 공초점 현미경 및 3D 이미징을 통해 연구자들은 출생 후 발달의 여러 단계에서 수상돌기와 수지상 발톱의 형태를 특성화할 수 있었습니다. 중요한 것은 이 접근법이 과립 세포 성숙 및 기능에 영향을 미칠 수 있는 유전자의 삽입 또는 제거를 허용할 수 있으며 소뇌 발달 및 과립 뉴런 성숙을 연구하는 연구자들에게 높은 관심을 끌 수 있다는 것입니다.

마지막으로, Cuentas-Condori 및 Miller33 의 프로토콜은 초고해상도 이미징34, 광유전학35 및 칼슘 역학의 살아있는 세포 이미징36 을 사용하여 선충 C . elegans에서 GABA성 뉴런의 활동을 연구합니다. 초고해상도 이미징37을 위해 장착된 공초점 현미경을 사용하여 저자는 수상돌기에서 형광 단백질을 발현하여 다양한 척추 모양의 빈도를 측정합니다. 또한, 저자는 시냅스 전에서 광유전학적 단백질의 발현과 시냅스 후에서 칼슘 지표의 발현에 의해 신경 기능을 평가합니다. 말단의 가벼운 활성화 후, 개별 수지상 가시 내에서 칼슘 과도 현상이 관찰되었습니다. 이러한 프로토콜은 최근 연구 결과와 함께 38, 척추 형태 및 시냅스 활동을 추적하기 위한 강력한 모델 시스템으로서 C. elegans 의 흥미로운 사용을 강조합니다.

종합하면, 이 방법 모음에 설명된 프로토콜은 신경 구조 및 기능을 시각화하는 데 사용할 수 있는 이미 풍부한 도구 상자에 추가될 것입니다21. 향후 연구에서 이러한 방법을 구현하면 학습 관련 시냅스 가소성을 구동하는 과정과 질병 상태의 기초가 되는 세포 메커니즘에 대한 추가 통찰력을 제공할 수 있습니다.

공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 원고에 대한 유용한 의견을 제시해 주신 Shelley Newpher에게 감사드립니다. 이 연구는 듀크 대학교와 듀크 대학교의 심리 및 신경과학 연구를 위한 찰스 라피트 재단 프로그램의 지원을 받았습니다.

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