방법 논문

인간 신경근 접합부의 광유전학 모델의 공학 및 특성화

DOI:

10.3791/63759

⸱

2022년 4월 14일

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1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2Department of Medicine, Columbia University, 3Gladstone Institutes, 4College of Dental Medicine, Columbia University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 인간 공학 골격근 조직과 광유전학적 모토뉴런을 사용하여 신경근 접합 기능을 특성화하기 위한 재현 가능하고 자동화되고 편향되지 않은 이미징 시스템을 설명합니다. 이 시스템은 시간이 지남에 따라 신경 근육 연결성의 기능적 정량화를 허용하고 신경 독소 및 중증 근무력증 환자 혈청으로 인한 감소 된 신경 근육 기능을 감지합니다.

초록

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중증 근무력증 (MG)과 같은 많은 신경 근육 질환은 동물과 인간 사이의 생리적 차이로 인해 동물 모델에서 특성화하기가 어려운 신경 근육 접합부 (NMJ)의 기능 장애와 관련이 있습니다. 조직 공학은 NMJ 병리를 진단 및 조사하고 잠재적 치료제를 테스트하는 데 사용할 수있는 기능적 인간 NMJ의 시험관 내 모델을 제공 할 수있는 기회를 제공합니다. 광유전학 단백질을 유도만능줄기세포(iPSCs)에 통합함으로써, 우리는 특정 파장의 빛으로 자극될 수 있는 뉴런을 생성했다. NMJ가 건강하고 기능적이라면, 모토뉴론으로부터의 신경화학적 신호는 근육 수축을 초래한다. 광유전학과 미세 제작을 조직 공학과 통합함으로써 우리는 비디오 분석을 사용하여 NMJ 기능을 특성화하기위한 편견없는 자동화 된 방법론을 수립했습니다. NMJ 형성, 동시 비디오 녹화를 통한 광학 자극 및 조직 수축성의 비디오 분석을 위해 표준화 된 프로토콜이 개발되었습니다. 골격근 수축을 유도하기 위해 빛에 의한 광유전학적 모토뉴런의 자극은 인간 NMJ 생리학을 되풀이하고 시간에 따라 그리고 다양한 입력에 반응하여 NMJ의 반복적인 기능적 측정을 허용한다. 우리는 시간이 지남에 따라 신경 근육 연결의 기능적 개선을 보여주고 NMJ 기능에 대한 환자 MG 항체 또는 신경 독소의 손상 효과를 특성화하는 이 플랫폼의 능력을 입증합니다.

서론

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신경 근육 접합부 (NMJ)는 근육 수축을 허용하는 모토 뉴런 (MN)과 골격근 세포 (SkM) 사이의 화학적 시냅스입니다. 독소, 예컨대 신경독소 α-분가로톡신 (BTX), 또는 중증 근무력증 (MG)과 같은 신경근 질환 (NMD)은 NMJ의 변성 및 근육 조절의 감소를 야기할 수 있다1. 생체 공학 인간 조직 모델은 인간 NMJ의 기능적 및 생리적 메커니즘을 더 잘 재구성하고 동물 모델보다 더 큰 번역 잠재력을 제공합니다.

동물 모델이 NMJ의 형성과 기능에 대한 이해를 향상 시켰지만, 인간과 동물의 시냅스 사이에는 결과의 번역을 제한하고 NMJ의 생체 내 특성화를 도전하는 2,3,4에 도전하는 상당한 차이가 있습니다. 연구에 따르면 마우스와 인간 NMJ 사이에 뚜렷한 생리적 차이가 나타났습니다. 마우스는 인간 NMJs4와 비교할 때 더 큰 NMJ와 더 작은 활성 영역밀도를 가지고 있습니다. 또한 동물 모델에서 수행 된 약물 연구가 인간 임상 시험에서 발견 된 효과를 항상 반영하는 것은 아닙니다. 조작 된 인간 조직 모델은 NMJ의 건강한 발달과 신경 근육 질환의 병리학을 연구하고 약물 검사를 허용 할 수있는 기회를 제공합니다. 인간 유도만능줄기세포(hiPSCs)5는 골격근세포(6,7) 및 모토뉴런(8,9)을 포함하는 다양한 세포 유형으로 분화될 수 있다. hiPSC는 환자 세포로부터 쉽게 생성될 수 있어, 환자 특이적 조직 모델을 통해 더 나은 질병 모델링(10) 및 약물 스크리닝(11,12)을 가능하게 한다.

SkMs와 MN의 2차원(2D) 단층 공동 배양은 생리학적 NMJ의 형태, 표현형, 조직 및 기능적 거동이 부족합니다. NMJ는 분석을 위한 운동 유닛의 분리를 억제하고, 정확한 기능 측정을 제한하며, 반복적이고 체계적인 실험에 대한 사용을 방해하는 2D 배양물에서 무작위로 형성됩니다.13 . NMJs의 3차원(3D) 조직 모델은 이러한 많은 한계를 극복하여, 생리학적 NMJs 7,14,15,16,17의 형태학적 및 기능적 특성을 되풀이한다. 이 모델을 사용하여 두 가지 조직 유형을 별도로 개발 한 다음 축삭 성장을 지시하여 통합하여 2D 배양 시스템에 비해 더 체계적인 NMJ를 개발할 수 있습니다.

우리의 이전 연구는 광유전학과 조직 공학을 결합하면 NMJ 기능18,19의 정확한 비 침습적 자극 및 평가를 가능하게한다는 것을 보여주었습니다. 유전 공학을 통해 빛에 민감한 단백질은 hiPSC의 게놈에 통합 될 수 있습니다. 청색광에 반응하여 열리는 이온 채널인 채널로돕신-2(ChR2)를 뉴런과 같은 흥분성 세포의 막으로 통합하면 세포 활성화20,21,22에 대한 비접촉식 시공간 조절이 가능하다. ChR2를 운반하는 hiPSC는 청색광에 민감한 광유전학적 모토뉴런으로 분화될 수 있어, 뉴런을 자극하는 전형적인 침습성 전극의 필요성을 제거하고 전극(23)에 의한 근육 세포의 원치 않는 자극을 피한다. 이 시스템은 광유전학적 모토뉴런을 사용하여 비광유전학적 골격근 세포의 수축을 자극합니다. 비디오 획득과 제어된 청색광 조명을 결합하면 NMJ 기능을 위해 공동 배양된 조직을 동시에 자극하고 기록할 수 있습니다.

MG는 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (AChR)를 표적화하는 자가항체에 의해 유발되며, 이는 NMJ 기능 감소 및 근육 약화24를 초래한다. 그것은 제시된 증상, 전기 진단 및 혈청 학적 혈액 검사를 통해자가 항체의 검출을 기반으로 진단됩니다. 그러나 MG에 관여하는 모든 자가항체가 확인된 것은 아니며, 일부 혈청음성 환자는 MG로 진단되지만25,26개의 항체가 인정되지 않았다. 우리의 시스템은 MG 환자로부터의 혈청의 첨가 전후에 NMJ의 반복적 인 기능적 평가를 허용하여 MG 항체18에 의해 야기 된 기능적 및 생화학 적 변화에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 우리의 프로토콜은 NMJ 병리를 진단 및 조사하고 잠재적 인 치료제를 테스트하는 데 사용할 수있는 기능적 인간 NMJ의 시험관 내 모델을 생산하는 방법을 보여줍니다. 우리는 두 개의 플랫폼, 미세 유체 장치 및 더 큰 오픈 웰 생물 반응기 플랫폼에서 시스템의 다양성을 보여줍니다.

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프로토콜

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이 작업을위한 모든 세포주는 미국 뉴욕 컬럼비아 대학의 제도적 지침에 따라 만들어지고 사용되었습니다.

1. 생물반응기 준비

  1. 생물반응기 주형 만들기
    1. 보충 CAD 파일에서 생물반응기 CAD 파일을 다운로드하거나 사용자 정의 자체 설계를 작성하십시오.
    2. CAM 소프트웨어를 사용하여 3D 모델에서 CNC 공구 경로를 생성합니다.
    3. CNC 밀링 머신을 사용하여 기계 아세탈 금형.
  2. 생물반응기 제조
    1. 폴리디메틸실록산(PDMS, 4개의 플랫폼/몰드 당 77g의 혼합물)의 경화제 혼합물에 10:1 염기를 혼합한다.
    2. 혼합물을 진공 챔버에 넣고, 모든 밸브를 닫고, 진공을 켜고, 기포가 남지 않을 때까지 혼합물을 적어도 30 분 동안 탈기하십시오. 혼합물을 몰드에 붓고 진공 챔버에서 금형을 1 시간 동안 가스 제거합니다.
    3. 금형의 위쪽 절반을 올바른 방향으로 닫습니다. 강철 육각형 막대를 중앙에 놓고 양쪽에 클램프를 놓습니다.
    4. 상단을 PDMS로 다시 채웁니다.
    5. 몰드를 65°C 오븐에서 적어도 4시간 동안 경화시킨다.
    6. 실온으로 냉각한 후 금형에서 플랫폼을 제거하십시오.
    7. 1 시간 사이클의 접시 비누, 400 mL의 100 % 이소프로판올 및 증류수를 사용하여 초음파 욕조에서 장치를 청소하십시오.
    8. 65°C에서 하룻밤 동안 건조시킨다.
    9. 유리 커버슬립을 1% 비이온성 계면활성제 폴리올에 30분 동안 담그고 커버슬립이 모두 제대로 코팅되도록 쌓이지 않도록 하십시오.
    10. 증류수로 잘 헹구고 65°C에서 밤새 건조시킨다.
    11. 6 L/min의 산소와 함께 높은 곳에 플라스마 클리너를 1-2분 동안 사용하여 처리 유리 커버슬립 및 PDMS 플랫폼에 사용하십시오. 일단 처리되면, PDMS를 커버슬립 상으로 적어도 30초 동안 눌러서 둘을 함께 결합시킨다.
    12. 셀을 추가하기 전에 접합된 장치를 오토클레이브합니다.

2. 광학 자극 설정 구축

  1. 30mm 케이지 큐브 시스템을 사용하여 중앙에 573nm 이색성 거울을 부착합니다. 빨간색 627nm LED를 594nm 장역 여기 필터와 결합하고 LED가 거울을 향하도록 큐브의 위쪽에 연결합니다. 그런 다음 546nm 단거리 통과 여기 필터가 있는 파란색 488nm LED를 큐브의 인접한 측면에 부착하고 도 3A의 개략도에 표시된 것처럼 LED가 거울을 향하게 합니다.
  2. 링 작동 아이리스 다이어프램을 케이지 큐브의 하단에 부착하여 조명 영역의 크기를 제어합니다.
  3. T-큐브 LED 드라이버로 각 LED에 전원을 공급하고 Arduino Uno Rev3 보드를 통해 제어합니다. LED 드라이버의 측면 입력을 전원 플러그에 연결하고 중간 출력을 Arduino에 연결한 다음 측면 출력을 LED에 직접 연결합니다.
  4. USB 케이블로 아두 이노 우노를 PC에 연결하십시오.
  5. GitHub 링크에서 파일을 다운로드합니다(https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
  6. GitHub 폴더에서 "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" 파일을 엽니다.
  7. 시작 매개 변수 설정: 단계 = 30; 시작 주파수 = 0.5; 끝 주파수 = 3; 펄스 길이 = 100.
  8. 핀 출력 4가 파란색 LED 드라이버에 할당되고 핀 출력 2가 빨간색 LED 드라이버에 할당되었는지 확인합니다. LED 드라이버의 중간 전선이 접지 및 각 핀 출력에 연결되어 있는지 확인합니다.
  9. "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino"프로그램을 컴파일하고 Arduino에로드하십시오.
  10. 각 LED 드라이버를 해당 채널에 연결합니다.

3. 세포 배양 셋업 (일-21-0일)

  1. 원발성 골격근 세포
    1. 해동 및 Myotonic 성장 배지 (+ 보충)를 사용하여 최대 여섯 계대 동안 일차 골격 근세포 (쿡 Myosite로부터 수득)를 확장한다. 세포를 37°C 및 5%CO2로 설정된 인큐베이터에서 유지한다.
    2. 2일마다 미디어를 변경합니다.
    3. 일단 세포가 약 60% 합류하면, 0.05% 트립신-EDTA(1x, 37°C에서 5분 동안)를 사용하여 이를 통과시킨다. 해리 된 세포를 수집하고 트립신을 중화시키기 위해 신선한 배지를 추가하십시오.
    4. 세포를 300 x g 에서 스핀 다운하고 세포 펠릿 위의 상청액을 흡인한다.
    5. 세포를 MGM으로 재현탁시키고 삼중층 플라스크 당 60 mL로 시드 1:3으로 재현탁시킨다.
  2. ChR2-hiPSC
    참고 :이 작업을위한 모든 세포주는 미국 뉴욕 컬럼비아 대학의 제도적 지침에 따라 만들어지고 사용되었습니다. 이 프로토콜에서, ChR2-발현 hiPSCs는 앞서 기술된 방법18을 사용하여 CRISPR-Cas9 게놈 편집을 통해 생성되었지만, 임의의 안정한 광유전학적 세포주(렌티바이러스, piggyBac 등)는 동일한 방식으로 사용될 수 있다. iPSCs 및 모토뉴런 둘 다에서 발현되는 구성적 프로모터(CAG)를 선택하였다. 세포는 이전 간행물18,19에서 언급된 바와 같이 건강한 핵형을 갖는 것으로 밝혀졌다.
    1. 6웰 플레이트를 DMEM/F12(1:80)에 희석된 가용화된 기저막 매트릭스 1mL/웰로 코팅하고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
    2. 2mL의 피더프리 세포 배양 배지(iPSC 배지)로 코팅된 6-웰 플레이트 상에 시드된 iPSCs를 격일로 2mL의 배지를 교환하고 5-7일마다 통과시킨다. 세포를 37°C 및 5% CO2로 설정된 인큐베이터에 유지하십시오.
    3. 패시징
      1. 1 mL의 효소가 없는 줄기세포 방출시약과 함께 4분 동안 인큐베이션하고 넓은 팁 P1000 피펫으로 기계적으로 전단하여 줄기세포를 해리시킨다.
      2. 시드 세포를 iPSC 배지에서 1:24 또는 1:48의 비율로 2 mL/웰의 Y-27632 디하이드로클로라이드 2 μM과 코팅된 6-웰 플레이트 상에 상에.

4. 골격근 조직 파종 (-3 일째)

  1. 자동화된 셀 카운터를 사용하여 30 x 106 근모세포를 분리하고 계수합니다.
  2. 3 mg/mL 콜라겐 I과 가용화된 기저막 매트릭스(콜라겐 혼합물 800 μL + 기저막 매트릭스 200 μL의 4:1 혼합물의 혼합물)에 근아세포를 재현탁시켜 최종 부피 1 mL에 도달한다. 콜라겐 성분에 대해, 수반되는 중화제 (중화제에 콜라겐의 9:1 혼합)를 첨가하고, 혼합물을 1x PBS로 희석하여 800 μL의 부피를 달성한다.
  3. 15μL의 세포-콜라겐 현탁액을 생물반응기의 각 근육 챔버에 첨가하고, 피펫 팁을 사용하여 현탁액을 두 기둥 전체에 걸쳐 확산시킨다(그림 2).
  4. 세포-겔 혼합물을 37°C에서 30분 동안 중합시킨 다음, 각 생물반응기 웰을 450 μL의 근긴장성 성장 배지로 채운다.
  5. 3 일 후 (일단 젤이 압축되면), myotube 분화를 시작하십시오.

5. Myotube 분화 (0-14 일)

  1. 조직을 450 μL의 융합 유도 배지 (FS, 표 1)로 7일 동안 전환하고, 격일로 배지를 변경함으로써 근관 주입을 시작한다.
    참고: 두 세포 유형의 분화 스케줄의 끝에 모토뉴런을 시드하기 위해 hiPSCs로부터의 모토뉴론 분화와 같은 날에 근관 분화를 시작하려고 노력한다.
  2. 7일째에 배지를 450 μL의 성숙 배지 Ia로 변경한다(MMIa, 표 1).
  3. 9일째에, 450 μL의 성숙 배지 Ib로 변경한다(MMIb, 표 1).
  4. 11일째에, 배지를 450 μL의 NbActiv4로 변경한다. 모토뉴런이 시드될 때까지 2일마다 배지를 계속 바꿔 놓으십시오(단계 7).

6. 모토네론 분화 (0-14일)

참고 : 우리의 모토네론 차별화 프로토콜은 Maury et al8에서 채택되었습니다.

  1. 0일째에, 4 x 106 ChR2-hiPSCs를 15 mL의 모토뉴론 현탁액 배양 배지가 있는 초저 부착 페트리 디쉬에 옮긴다(MSCM, 표 1). MSCM을 3 μM CHIR99021, 0.2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 수화물 및 5 μM Y-27632 디하이드로클로라이드로 보충하십시오.
  2. 2일째에, 신경구(NS)를 37 μM 가역성 스트레이너로 분리하고, 3 μM CHIR99021, 0.2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 수화물, 및 0.1 μM 레티노산으로 15 mL의 MSCM에 재접종한다. NS는 2 일째 후에 현미경을 사용하지 않고 페트리 접시에서 볼 수 있어야합니다.
  3. 4 일째에 세포와 배지를 50 mL 튜브로 옮기고 신경 구가 바닥에 정착하도록하십시오 (5 분). 상청액을 흡인하고, 세포를 0.5 μM SAG, 0.2 μM LDN193189, 40 μM SB431541, 및 0.1 μM 레티노산으로 보충된 MSCM의 15 mL에 재현탁시켰다.
  4. 7일째에 6.3단계를 반복합니다. 세포를 0.5 μM SAG 및 0.1μM 레티노산으로 보충된 MSCM 15 mL에 재현탁시켰다.
  5. 9일째에 6.3단계를 반복합니다. 세포를 10 μM DAPT로 보충된 MSCM의 15 mL에 재현탁시켰다.
  6. 11일째에 6.3단계를 반복합니다. 그러나 세포를 20 ng / mL BDNF 및 10 ng / mL GDNF로 보충 된 MSCM 15 mL에 재현탁하십시오.
  7. 14 일째에 모토 뉴런을 플랫폼에 뿌립니다.

7. 생물 반응기에서 모토뉴런 응집체 시딩 (14 일째)

  1. 2 mg/mL 콜라겐 I과 마트리겔(800 μL의 콜라겐 혼합물 + 200 μL의 마트리겔을 1 mL의 최종 부피에 도달)의 4:1 겔 혼합물을 준비한다. 콜라겐 성분에 대해, 수반되는 중화제 (중화제에 콜라겐의 9:1 혼합)를 첨가하고, 혼합물을 1x PBS로 희석하여 800 μL의 최종 부피를 달성한다.
  2. 400nm 세포 스트레이너를 사용하여 큰 신경 구체를 선택하고 젤 혼합물에 재현탁하십시오.
  3. 저수지에서 배지를 흡인하고 신경권 우물에서 조심스럽게 흡인하십시오 (그림 2).
  4. 15 μL의 겔 혼합물을 신경구 채널에 첨가한다.
  5. 10 μL의 젤로 10 μL 피펫을 로딩한 다음 하나의 신경구를 선택하십시오.
  6. NS를 신경구 채널에 증착하고 NS가 챔버에 있는지 확인하십시오. NS가 증착되면 나머지 겔을 방출하면서 피펫을 천천히 올립니다. NS가 올바르게 침착되었는지 확실하지 않은 경우 현미경을 사용하여 위치를 확인하십시오.
  7. 겔을 37°C에서 30분 동안 중합시키도록 허용한다.
  8. 20 ng/mL BDNF 및 10 ng/mL GDNF로 보충된 NbActiv4 450 μL를 저수지에 첨가하십시오.
  9. NS에서 근육 조직으로의 축삭 성장을 허용하기 위해 격일로 배지를 변경하십시오.

8. NMJ 기능의 동시 광학 자극 및 비디오 녹화 (24 +일)

  1. 이미징의 경우 과학적 상보성 금속 산화물 반도체(sCMOS) 카메라와 함께 반전 형광 현미경을 사용하십시오.
  2. 카메라 소프트웨어 비닝을 2x2, 노출 20ms, 롤링 셔터 ON, 판독 속도 540MHz, 다이나믹 레인지: 12비트 및 게인 1, 센서 모드: 오버랩으로 설정합니다.
  3. 현미경에서 2x 대물렌즈를 사용하여 미세 조직을 이미지화하십시오.
  4. 라이브 셀 챔버(37°C, 5%CO2)를 현미경 스테이지에 부착한다.
  5. 신경 골격 조직 조직을 포함하는 관심 영역(ROI)을 선택하여 파일 크기와 처리 시간을 최소화합니다.
  6. 샘플과 이미징 대상 사이에 594nm 장역 방출 필터를 배치하여 카메라에서 청색광 펄스를 필터링합니다.
  7. 4개의 생물반응기(24개 조직)가 들어있는 직사각형 4-웰 플레이트를 살아있는 세포 챔버에 넣는다.
  8. 라이브 뷰를 클릭합니다. 원하는 ROI로 이미지를 중심에 맞추고 초점을 맞춥니다.
  9. GitHub 폴더(https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis)에서 사용자 지정 매크로 코드를 업로드하여 스테이지 위치, Arduino 보드 및 비디오 수집을 제어합니다.
  10. 출력 동영상을 day_tissue group_tissue name_experiment.nd2로 설정합니다.
  11. 스테이지에서 원하는 X,Y 좌표를 설정하여 매크로 코드를 실행하고 50 프레임 / s에서 1700 프레임으로 빠른 시간 경과를 얻습니다.
  12. 이미징 후 매체를 교체하고 샘플을 인큐베이터로 되돌립니다. 조직 피로를 피하기 위해 이미지 획득 세션 사이에 최소 24시간을 허용하십시오.

9. 배치 처리 및 분석 (24 일 이상)

  1. 동영상 처리
    1. 사용자 지정 MATLAB 코드를 사용하여 배치 분석에서 비디오를 처리합니다. GitHub 폴더(https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis)에서 파일을 다운로드할 수 있습니다. 이 기능은 표 2에 나열되고 설명되어 있습니다.
      참고: 이 코드는 .nd2 및 .czi 형식과 호환됩니다. MATLAB에서 활성화하려면 병렬 처리가 필요하며 바이오 포맷 패키지가 필요합니다.
    2. 재귀 OSAnalysis 스크립트를 실행하여 병렬 처리를 통해 동영상을 분석합니다. 획득 한 모든 비디오를 동일한 폴더에 넣고 코드를 실행할 때 해당 폴더를 선택하십시오.
    3. 필요에 따라 사후 분석 매개변수를 조정합니다.
      1. 녹음 시작 시 자발적인 수축이 포착되는 경우 기준선 시간 (옵션 1)을 변경합니다. 이렇게하면 0보다 큰 초기 판독 방법이 표시되며 보상하기 위해 프레임을 이동해야합니다.
      2. 수축이 등록되지 않은 경우 peakThreshold (옵션 2)를 변경합니다. 이 코드는 기본적으로 가장 높은 피크의 25%를 초과하는 수축을 감지하여 이 값을 변경할 수 있도록 합니다.
      3. minMinProminence 및 minMinWidth를 변경하여 각 피크의 시작을 감지할 때 감도를 조정합니다.
    4. 비디오 및 그래프 출력을 생성합니다.
      1. recursiveOSMovie를 실행하여 각각의 수축성 추적이 있는 각 조직에 대한 비디오 파일을 생성합니다.

10. NMJ 기능의 교란 (24 일 이상)

  1. 20 ng/mL BDNF 및 10 ng/mL GDNF로 보충된 NbActiv4 기초 배지에 외부 이펙터를 추가하여 치료 배지를 준비하십시오.
    1. MG 혈청 실험을 위해, NbActiv4 + BDNF + GDNF에서 20% MG 환자 혈청을 사용하십시오.
    2. BTX 실험을 위해 NbActiv4 + BDNF + GDNF에서 5 μg/mL BTX를 사용하십시오.
  2. 3.2단계를 사용하여 자극/이미지. 베이스라인을 기록합니다.
  3. 조직의 배지를 치료 배지 (450 μL / 조직)로 교체하십시오.
  4. 원하는 시간 동안 인큐베이션한다 (환자 혈청의 경우 48 시간, BTX의 경우 20 분).
  5. 3.2단계를 사용하여 다시 자극/이미지화합니다. 치료 후 기능을 기록합니다.
  6. 치료 배지를 제거하고 조직이 원하는 시간 동안 쉬도록하십시오 (혈청 제거 후 48 시간)
    참고 : 조직의 피로를 피하기 위해 자극과 이미징 사이에 최소 24 시간을 허용하십시오.

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결과

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신경근 접합은 광유전학적 hiPSC 유래 모토뉴런을 비광유전학적 골격근 조직과 공동배양함으로써 생성되었다. 인간 일차 골격 근모세포(SkM)를 플랫폼 내로 시딩하고, 2주 프로토콜을 사용하여 다핵 근관으로 분화시켰다. 광유전학적 모토뉴런은 별도로 분화하되, 근관 분화와 병행하여, 플랫폼 내로 시딩하였다(도 1). 조직은 MN 시딩 후 7-12 일 후에 청색광 자극에 반응하여 수축하기 시작하여 NMJ의 성공적인 발달 및 성숙을 나타냅니다. NMJ는 모토네론 시딩 후 최대 40일 동안 배양, 자극 및 영상화될 수 있지만, 최적의 시점은 16일째19일에 발생한다. 광유전학적 단백질의 분화 및 존재에 대한 형태학적 및 생화학적 검증은 보충 도 1에 나타나 있으며 이전 연구18,19에서 검증되었다.

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 시스템은 광유전학과 비디오 처리를 결합하여 NMJ 기능에 대한 자동화되고 편견없는 평가를 가능하게하는 엔지니어링 된 3D 인간 조직 모델입니다. 표준화 된 프로토콜을 사용하여 우리는 생리 발달 동안 NMJ 기능의 변화를 측정하고 신경 독소 노출 및 중증 근무력증 환자 혈청과 같은 병리학의 해로운 영향을 특성화하는 능력을 입증했습니다.

이전의 연구들은 MG 환자 혈청22를 사용하여 골격 근관과 공동 배양에서 광유전학적 hPSC 유래 모토뉴런으로 MG를 모델링하는 능력을 보고하였다. 그러나 시스템은 2D로 되어 무작위 위치에 수축을 기록하여 재현성을 제한하고 모델의 양적 능력을 저하시켰습니다. 2D 시스템에 비해 우리 시스템의 가장 큰 장점 중 하나는 3D 환경을 에뮬레이트하여 MN과 SkMs간에 세포 및 형태 학적 개발을보다 정확하게 용이하게한다는 것입니다. 조직이 고유 생리학처럼 행동하는 데 필요한 생체 역학적 단서가 3D 시스템

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공개 사항

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저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 NIH [보조금 번호 EB025765 및 EB027062], DOD [수상 번호 W81XWH-18-1-0095] 및 엔지니어링을 통한 UCSF 건강 혁신 (HIVE 펠로우십)의 자금 지원을 감사하게 생각합니다. 우리는 컬럼비아 대학 줄기 세포 코어가 세포 재 프로그래밍에 대한 도움과지도에 대해 감사하게 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Cells
SkMDCCook MyositeP01059-14M
Media and Supplements
Advanced DMEM/F12ThermoFisher Scientific12634-020
소 혈청 알부민 용액Millipore SigmaA9576-50ML
G-5 보충제 (100X)ThermoFisher Scientific17503-012
유전성 항생제 (G418 황산염) (50 mg/mL)ThermoFisher Scientific10131-035
인슐린, 재조합 인간Millipore Sigma91077C-100MG
MatrigelCorning354277
mTeSR PlusStem Cell Technologies100-0276
MyoTonic 성장 미디어 키트쿡 MyositeMK-4444
N-2 보충제ThermoFisher Scientific17502-048
NbActiv4 500 mLBrainBits LLCNb4-500
Neurobasal 매체ThermoFisher Scientific21103-049
Neurobasal-A 매체ThermoFisher ScientificA13710-01
Pluronic F-127Sigma AldrichP2443
ReLeSR줄기세포 기술5872
Plasticware
30 mm 케이지 큐브 시스템ThorLabsCM1-DCH, CP33, ER1-P4 및 ER2-P4
37 µ m 가역 여과기, 대형줄기세포 기술27250
546 nm 단역 여기 필터SemrockFF01-546/SP-25
573 nm 이색성 거울SemrockFF573-Di01– 25x36
594 nm 장역 통과 방출 필터SemrockBLP01-594R-25
594 nm 장역 여기 필터SemrockBLP01-594R-25
파란색 (470nm) 반란군 LED on a SinkPAD-II 10mm 정사각형 베이스 - 65 lm @ 700mALuxeonStarLEDsSP-05-B4
Carclo 29.8° 젖빛 10mm 원형 빔 광학 - 통합 다리LuxeonStarLEDs10413
Corning 60mm 초저 부착 문화 접시Corning3261
방열판LuxeonStarLEDsLPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 µ m, 25 팩, 멸균PluriSelect43-50400-03
pluriStrainer 500 µ m, 25 팩, 멸균PluriSelect43-50500-03
Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm 정사각형 베이스 - 65 lm @ 700mALuxeonStarLEDsSP-05-R5
링 작동식 아이리스 다이어프램ThorLabsSM1D12D
T-Cube LED 드라이버ThorLabsLEDD1B, KPS101
Molds
여성 나사식 육각 스탠드오프,  3 1/2" 10-32, 부분적으로 나사가 달린 1/2"McMaster91920A046
저프로필  C-클램프McMaster1705A12
Growth Factors
Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphateMillipore SigmaA9501-1G
CHIR 99021, 10 mgTocris4423/10
DAPT 10 mgR& D 시스템2634/10
인간 CNTF, 연구 등급, 5 &마이크로; gMiltenyl Biotec130-096-336
인간 Vitronectin 단백질, CFR & D Systems2349-VN-100
인간 Vitronectin 단백질, CFR & D Systems2349-VN-100
IGF1 재조합 인간 단백질ThermoFisher ScientificPHG0078
라미닌 마우스 단백질, 천연ThermoFisher Scientific23017015
재조합 인간 Agrin 단백질R& D 시스템6624-AG-050
재조합 인간 GDNF 단백질, CF 50ugR& D 시스템212-GD-050/CF
재조합 인간 신경 영양 3  100 ugCell SciencesCRN500D
Recombinant Human Neurotrophin-4Cell SciencesCRN501B
Recombinant Human Sonic Hedgehog/SHH (C24II) N-TerminusR& D Systems1845-SH-100
재조합 인간/쥐/쥐 BDNF 50 ugPeprotech450-02
레티노산, 50mgMilliporeSigma R2625-50
SAG 평활화 작용제Millipore Sigma566660
SB431542 10mg줄기세포 기술72234
StemMACS LDN-193189Miltenyl Biotec130-103-925
인간 플라즈마에서 추출한 비트로넥틴Millipore SigmaV8379-50UG
Y-27632 디하이드로클로라이드Tocris1254
Antibodies
;-actinin mAb (Mouse IgG1)Abcamab9465
콜린 아세틸전이효소 (ChAT) (염소)MilliporeAB144P
Desmin mAb (마우스 IgG1)DakoM076029-2
Myosin Heavy Chain (MHC) (마우스 IgG2b)DSHBMF20
Equipment
Arduino Uno R3ArduinoA000066
Automated stageApplied scientific instrumentationMS-2000 XYZ
팽창 플라즈마 세정Harrick PlasmaPDC-001 ( 115V)
Invitrogen Countess 자동화 세포 카운터원수 과학I-CACC
IX-81 도립 형광 현미경올림푸스IX-ILL100LH
시리즈 스테이지 상단 인큐베이터 시스템Tokai HitSTX TOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS 카메라 AndorTechnologyZYLA-4.2P-CL10
Software
Arduino 소프트웨어(IDE)ArduinoIDE 1.8.19
MastercamMastercam for Solidworks
Matlab MatlabR2021b
NIS 요소NikonBasic Research
Solidworks 3D CADSolidworksSolidworks Standard
&alpha기

참고문헌

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Optogenetic Neuromuscular JunctionHuman NMJ ModelTissue EngineeringInduced Pluripotent Stem CellsOptogenetic StimulationMuscle Contraction AnalysisMicrofabrication TechniquesVideo Contractility AnalysisMyasthenia Gravis ModelMotor Neuron Differentiation

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