자사는 숙주 타우로콜레이트 나트륨 공동 수송 폴리펩티드와의 결합 친화도(KD)를 측정하기 위해 등온 적정 열량계를 사용하여 바이러스 진입 전후 수명 주기 단계를 표적으로 하는 B형 간염 바이러스(HBV) 화합물을 스크리닝하는 프로토콜을 제시합니다. 항바이러스 효능은 바이러스 수명 주기 마커(cccDNA 형성, 전사 및 바이러스 어셈블리)의 억제를 통해 결정되었습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
치료 표적으로 폴리펩티드를 공동 수송하는 나트륨 타우로 콜레이트를 통한 B 형 간염 바이러스 진입을 조사하는 유능한 간세포 모델
이 논문에서
요약
초록
B형 간염 바이러스(HBV) 감염은 간세포암의 중요한 위험 요소로 간주되어 왔습니다. 현재의 치료는 바이러스 부하를 줄일 수 있을 뿐 완전한 관해를 초래하지는 않습니다. HBV 감염에 대한 효율적인 간세포 모델은 치료제 스크리닝에 중요한 실제 바이러스 수명 주기를 제공할 것입니다. 대부분의 사용 가능한 항 HBV 제제는 바이러스 진입 후 수명주기 단계를 목표로하지만 바이러스 진입 전에는 그렇지 않습니다. 이 프로토콜은 바이러스 진입 전 및 바이러스 진입 후 수명 주기 단계를 표적으로 하는 치료제를 스크리닝할 수 있는 유능한 간세포 모델의 생성을 자세히 설명합니다. 여기에는 숙주 세포로서 imHC 또는 HepaRG를 기반으로 하는 나트륨 타우로콜레이트 공동 수송 폴리펩티드(NTCP) 결합, cccDNA 형성, 전사 및 바이러스 조립의 표적화가 포함됩니다. 여기서, HBV 진입 억제 분석은 NTCP를 통한 HBV 결합 및 수송 기능을 억제하기 위해 커큐민을 사용하였다. 억제제는 열역학적 파라미터에 기초한 HBV 약물 스크리닝을 위한 범용 도구인 등온 적정 열량측정법(ITC)을 사용하여 NTCP와의 결합 친화도(KD)에 대해 평가되었습니다.
서론
B형 간염 바이러스(HBV) 감염은 전 세계적으로 생명을 위협하는 질병으로 간주됩니다. 만성 HBV 감염은 간경변 및 간세포 암종1의 위험이 있습니다. 현재의 항 HBV 치료는 주로 핵 (t) ide 유사체 (NA) 및 인터페론 알파 (IFN-α)2,3를 사용한 바이러스 후 진입에 중점을 둡니다. HBV 진입 억제제 인 Myrcludex B의 발견은 항 HBV 제제4에 대한 새로운 표적을 확인했습니다. 만성 HBV에서 진입 억제제와 NA의 조합은 바이러스복제 단독을 표적으로 하는 것에 비해 바이러스 부하를 유의하게 감소시켰습니다5,6. 그러나, HBV 진입 억제제의 스크리닝을위한 고전적인 간세포 모델은 낮은 바이러스 수용체 수준 (나트륨 타우로 콜레이트 공동 수송 폴리펩티드, NTCP)에 의해 제한된다. 간암 세포(즉, HepG2 및 Huh7)에서 hNTCP의 과발현은 HBV 감염성을 개선합니다 7,8
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
알림: 다음 절차는 Class II 생물학적 위험 흐름 후드 또는 층류 후드에서 수행해야 합니다. HBV의 취급은 IRB (MURA2020/1545)에 의해 윤리적으로 승인되었습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 용액, 시약, 장비 및 세포주에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 숙주세포(성숙간세포) 준비
- 간세포(3.75 × 105 세포 HepaRG 또는 imHC)를 배양하고 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% L-글루타민, 100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F12 배지 10mL가 있는 75cm2 배양 플라스크에서 유지합니다. 세포가 80%-90% 합류에 도달할 때까지 기다립니다(1주일 이내).
- 플라스크에서 오래된 배지를 버리고 4mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세척합니다.
- PBS를 흡인하고 0.05% 트립신-EDTA 4mL를 추가합니다.
- 플라스크를 37°C 인큐베이터에서 2-3분 동안 배양하고 10x 대물 렌즈가 있는 도립 현미경을 사용하여 부착 세포를 확인합니다. 단층이 배양 표면에서 분리되었는지 확인....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
특히 imHC의 분화 단계에서 이핵 세포와 다각형 형태 (그림 1)를 포함한 간 성숙 특징이 관찰되었습니다 (그림 1A). NTCP 발현의 큰 증가는 d-HepaRG 및 d-imHC에서 각각 7배 및 40배로 측정되었습니다(그림 1B). HBV 진입에 대한 감수성을 부여하는 것으로 가정 된 NTCP의 고도로 글리코 실화 된 형태는 d-HepaRG보다 d-imHC에서 더 많이 검출되었다 (그림 1C). 분화된 imHC는 미분화 세포보다 65.9% 더 높은 NTCP 수준을 함유했습니다(그림 1D).
도 2A 는 예방적 치료의 요약을 나타낸다. 도
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
HBV 감염은 간세포25 상의 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 (HSPGs)에 대한 낮은 친화도 결합을 통해 시작되고, 이어서 엔도 사이토 시스26을 통한 후속 내재화와 함께 NTCP에 결합한다. NTCP는 HBV 진입에 중요한 수용체이기 때문에 HBV 진입을 표적으로 하는 것은 임상적으로 번역되어 de novo 감염, 모자 간 전염(MTCT) 및 간 이식 후 재발을 감소시킬 수 있습니다. 바이러스 유입을 차단하는 것은 만성 HBV 감염에 대한 실행 가능한 대체 치료법이 될 것입니다.
위에서 언급한 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계가 여기에 요약되어 있습니다. 숙주 세포를 준비하는 동안 2% DMSO로 성숙 배지를 추가하기 전에 간세포가 100% 컨플루언시에 도달하는지 확인하십시오. 2 % DMSO에서 서브 컨플루언트 간세포를 배양하면 세포 사멸 및 박리가 발생합니다. 성숙 기간은 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 잠재적 인 이해 상충으로 해석 될 수있는 상업적 또는 재정적 관계가없는 상태에서 연구가 수행되었다고 선언합니다.
감사의 글
이 연구 프로젝트는 Mahidol University와 태국 과학 연구 및 혁신 (TSRI)이 A. Wongkajornsilp 및 K. Sa-ngiamsuntorn에게 별도로 수여합니다. 이 작업은 경쟁력을위한 프로그램 관리 단위 (보조금 번호 C10F630093)를 통해 국가 고등 교육 과학 연구 및 혁신 정책위원회 사무국에서 재정적으로 지원했습니다. A. Wongkajornsilp는 Mahidol University의 Faculty of Medicine Siriraj Hospital의 Chalermprakiat 보조금을 받았습니다. 저자는 ITC 기술에 대한 그녀의 도움에 대해 Sawinee Seemakhan (Mahidol University 과학 학부 약물 발견 우수 센터)에게 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 세포주 | |||
| HepaRG 세포, 동결 | Thermo Fisher Scientific | HPRGC10 | |
| Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line | Merck | SCC249 | |
| Reagents | |||
| 4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution | FUJIFLIM Wako 화학 | 물질 163-20145 | |
| BD 펌/워시 버퍼 | BD Biosciences | 554723 | 펌/워시 버퍼 |
| 사이클로스포린 A | abcam | 59865-13-3 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | 8 mM |
| G 418 디설페이트 솔 | Merck | 108321-42-2 | |
| Halt 프로테아제 억제제 칵테일 EDTA 무함유(100x) | Thermo Scientific | 78425 | |
| HEPES | Merck | 7365-45-9 | |
| illustraTM RNAspin Mini RNA 분리 키트 | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| illustra RNAspin Mini RNA 분리 키트 | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| ImProm-II 역전사 시스템 | Promega | A3800 | |
| KAPA SYBR FAST qPCR 키트 | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Lenti-X 농축기 | Takara bio | PT4421-2 | 농축기 |
| Luminata crescendo, Western HRP 기질 | Merck | WBLUR0100 | |
| 마스터 믹스(2개), Universal | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| 뉴클레오스핀 DNA 추출 키트 | macherey-nagel | 1806/003 | |
| 인산염 완충 식염수 | Merck | P3813 | |
| 폴리에틸렌 글리콜 8000 | Merck | 25322-68-3 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo scientific | P36930 | |
| 재조합 NTCP | Cloud-Clone | RPE421Hu02 | |
| RIPA 용해 버퍼(10x) | Merck | 20-188 | |
| TCA | Sigma | 345909-26-4 | |
| TCA Elisa 키트 | Mybiosource | MB2033685 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | 0.125%로 희석 |
| 항체 | |||
| 항-NTCP1 항체 | Abcam | ab131084 | 1:100 희석 |
| 항-GAPDH 항체 | Thermo Fisher Scientific | AM4300 | 1:200,000 희석& |
| nbsp; HRP-conjugated goat anti-rabbit anti-rabbit 항체 | Abcam | ab205718 | 1:10,000 희석 |
| HRP 염소 항-마우스 2차 항체 | Abcam | ab97023 | 1:10,000 희석 |
| 염소 항-토끼 IgG 2차 항체, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | 1:500 희석 |
| 시약 구성 | |||
| 1° 항체 희석 완충액 | |||
| 1배 TBST | |||
| 3% BSA | 시그마 | A7906-100G | 작업 농도: 3% |
| 나트륨 아지드 | 시그마 | 199931 | 작업 농도: 0.05% |
| <강>간세포 성장 매체 | |||
| DME/F12 | Gibco | 12400-024 | |
| 10% FBS | 시그마 알드리치 | F7524 | |
| 1% 펜/스트렙 | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Hepatic maturation medium | |||
| 윌리엄스의 E 매체 | 시그마 알드리치 | W4125-1L | |
| 10% FBS | 시그마 알드리치 | F7524 | |
| 1% 펜/스트렙 | HyClon | SV30010 | |
| 1% 글루타맥스 | Gibco | 35050-061 | |
| 5 &마이크로; g/mL 인슐린 | 시그마 Aldrich | 91077C-100MG& | |
| nbsp; 50 &마이크로; M 하이드로코티손 | 시그마 알드리치 | H0888-1g | |
| 2% DMSO | PanReac AppliChem | A3672-250ml | |
| IF 차단 솔루션 | |||
| 1x PBS | 기브코 | 21300-058 | |
| 3% BSA | 시그마 | A7906-100G | 작업 농도: 3% |
| 0.2% Triton X-100 | Sigma | T8787 | 작업 농도: 0.2% |
| RIPA Lysis Buffer Solution | Merck | 20-188 | 최종 농도: 1X |
| 프로테아제 억제제 칵테일 | Thermo Scientific | 78425 | 최종 농도: 1X |
| Na3VO4 | 최종 농도: 1 mM | ||
| PMSF | 최종 농도: 1 mM | ||
| NaF | 최종 농도: 10 mM | ||
| Western blot reagent | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | 최종 농도: 1X |
| 트윈 20 | Merck | 9005-64-5 | |
| 1x TBST | 0.1% 트윈 20 | ||
| 1x PBS | 기브코 | 21300-058 | |
| Pierce BCA 단백질 분석 키트 | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
| 폴리아크릴아미드 겔 | Bio-Rad | 161-0183 | |
| 과황산 암모늄 (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | 최종 농도: 0.05% |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | 스태커 겔: 0.1%, 리졸버 겔: 0.05% |
| 2x Laemmli 샘플 버퍼 | Bio-Rad | 161-0737 | 최종 농도: 1X |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 161-0374 | |
| WB 차단 솔루션/ 2° 항체 희석 완충액 | |||
| 1배 TBST | |||
| 5% 탈지 우유 (무지방 분유) | Bio-Rad | 170-6404 | 작업 농도: 5% |
| 1x 러닝 버퍼 1 L | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | 최종 농도: 1X |
| 글리신 | 시그마 | G8898 | 14.4 g |
| SDS | Merck | 7910 | 작업 농도: 0.1% |
| <강력한>블롯 전달 버퍼 500 mL | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | 최종 농도: 1X |
| 글리신 | 시그마 | G8898 | 7.2 g |
| 메탄올 | Merck | 106009 | 100 mL |
| <강한>약한 스트리핑 솔루션 1 L | pH를 2.2& | ||
| nbsp로 조정; 글리신 | 시그마 | G8898 | 15 g |
| SDS | 머크 | 7910 | 1 g |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | 10 mL |
| Equipments | |||
| 15 mL 원심분리기 튜브 | Corning | 430052 | |
| 50 mL 원심분리기 | Corning | 430291 | |
| Airstream Class II | Esco | 2010621 | 생물 안전 작업대 |
| CelCulture CO2 인큐베이터 | Esco | 2170002 | 가습 조직 배양 인큐베이터 |
| CFX96 Touch Real-Time PCR 검출기 | Bio-Rad | 1855196 | |
| FACSVerse 유세포 분석기 | BD Biosciences | 651154 | |
| 눈금 파이펫(10mL) | Jet Biofil | GSP010010 | |
| 눈금 파이펫(5mL) | Jet Biofil | GSP010005 | |
| MicroCal PEAQ-ITC | Malvern | 등온 적정 열량계 | |
| Mini PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | 전기영동 챔버 |
| Mini Trans-blot 흡수성 여과지 | Bio-Rad | 1703932 | |
| Omega Lum G 이미징 시스템 | Aplegen | 8418-10-0005 | |
| 피펫 컨트롤러 | Eppendorf | 4430000.018 | Easypet 3 |
| PowerPac HC | Bio-Rad | 1645052 | 전원 공급 장치 |
| PVDF 멤브레인 | Merck | IPVH00010 | |
| T-75 세포 배양 플라스크 | Corning | 431464U | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | Semi-dry Transfer |
| Cell 초음파 프로세서(Vibra-Cell VCX 130) | Sonics & 재료 | ||
| : Versati 탁상용 냉장 원심 분리기 | Esco | T1000R | 원심 분리기, 스윙 버킷 로터 |
참고문헌
- Levrero, M., Zucman-Rossi, J. Mechanisms of HBV-induced hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 64 (1), 84-101 (2016).
- Kim, K. -H., Kim, N. D., Seong, B. -L. Discovery and development of anti-HBV agents and their resistance. Molecules. 15 (9), 5878-5908 (20....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
