하이드로겔 어레이는 3D 종양 모델에서 매트릭스 성분 및 치료제의 스크리닝 효과를 위한 처리량 증가를 가능하게 합니다.

Summary

본 프로토콜은 맞춤형 UV 조명 장치를 사용하여 3D 매트릭스-모방 배양물에서 환자 유래 교모세포종 세포의 화학요법 반응에 대한 기계적 및 생화학적 단서의 영향을 평가하기 위한 실험 플랫폼을 기술하며, 조정 가능한 기계적 특징을 갖는 하이드로젤의 고처리량 광가교를 용이하게 한다.

Abstract

세포 - 매트릭스 상호 작용은 생화학적, 기계적, 기하학적 단서를 통해 복잡한 생리 학적 과정을 중재하여 병리학 적 변화와 치료 반응에 영향을 미칩니다. 약물 개발 파이프라인 초기에 매트릭스 효과를 고려하면 새로운 치료제의 임상 성공 가능성이 높아질 것으로 예상된다. 3D 세포 배양에서 특정 조직 미세 환경을 재순환시키는 생체 재료 기반 전략은 존재하지만 이를 약물 스크리닝에 주로 사용되는 2D 배양 방법과 통합하는 것은 어려운 과제였습니다. 따라서, 여기에 제시된 프로토콜은 세포 생존을 위한 기존 약물 스크리닝 파이프라인 및 종래의 분석과의 통합을 용이하게 하기 위해 다중 웰 플레이트 포맷으로 소형화된 생체재료 매트릭스 내에서 3D 배양을 위한 방법의 개발을 상세히 기술한다. 배양된 세포에서 임상적으로 관련된 표현형을 보존하는데 중요한 매트릭스 특징이 고도로 조직- 및 질병-특이적일 것으로 예상되기 때문에, 매트릭스 파라미터의 조합 스크리닝은 특정 적용을 위한 적절한 조건을 식별하기 위해 필요할 것이다. 여기에 설명된 방법들은 매트릭스 역학 및 리간드 프리젠테이션의 직교 변이에 대한 암 세포 반응을 평가하기 위해 소형화된 배양 포맷을 사용한다. 구체적으로, 본 연구는 화학요법에 대한 환자 유래 교모세포종 (GBM) 세포의 반응에 대한 매트릭스 파라미터의 효과를 조사하기 위해 이 플랫폼의 사용을 입증한다.

Introduction

신약 개발의 예상 비용은 지난 10 년 동안 꾸준히 상승했으며 현재 추정치에서 10 억 달러 이상^{이었습니다 1}. 이 비용의 일부는 임상 시험에 들어가는 약물의 높은 실패율입니다. 약물 후보의 약 12 %는 궁극적으로 2019 년 미국 (미국) 식품 의약품 안전청 (FDA)의 승인을 얻습니다. 많은 약물이 예기치 않은 독성²로 인해 I 단계에서 실패하는 반면, 안전성 시험을 통과 한 다른 약물은 효능 부족으로 인해 실패 할 수 있습니다³. 비효능으로 인한 이러한 감소는 약물 개발 동안 사용되는 암 모델이 임상적 효능의 비예측으로 악명 높다는 사실에 의해 부분적으로 설명될 수 있다⁴.

시험관내 및 생체내 모델 사이의 기능적 불균형은 비종양 세포 및 물리적 ECM ^5,6을 포함하는 그들의 천연 미세환경으로부터 암 세포를 제거하는 것에 기인할 수 있다. 일반적으로 연구 그룹은 Matrigel (마우스 육종에서 유래 한 단백질성 기저막 매트릭스)과....

Protocol

환자 유래 GBM 세포주 (GS122 및 GS304)는 UCLA 기관 검토 위원회 (IRB # 10-000655)가 승인 한 프로토콜에 따라이 라인을 개발 한 David Nathanson 교수 (공동 작업자)에 의해 제공되었습니다. 세포주가 개별 환자와 다시 연결될 수 없도록 비확인 세포를 제공하였다.

1. 하이드로겔 용액의 제조

1. 행크의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)에 HEPES 분말을 20mM로 용해시켜 HEPES 완충 용액을 준비하십시오. 완전 용매화 후 pH를 7로 조정한다.
2. HEPES 완충 용액에서, 티올화된 HA (700 kDa 공칭 분자량, 물질 표 참조)를 이전 보고서³¹에 따라 제조하여 각 글루쿠론산의 카르복실산 잔기의 6 % -8 %가 완충 용액 중 10 mg / mL의 농도로 티올로 변형되도록합니다.
   참고: 주변광에 의한 티올 산화를 방지하기 위해 호박색 바이알을 사용하는 것이 좋습니다.
   1. 자석 교반 플레이트 (<1,000 rpm)를 사용하여 완전히 용해 될 때까지 실온에서 교반하십시오, 전형적으로 약 45 분.
3. HA가 용해되....

Results

AFM 측정은 맞춤형 Arduino 제어 LED 어레이를 사용하여 광가교 중에 UV 조도(mW/^cm2)의 함수로서 하이드로겔 역학의 정밀한 제어를 확인했다(그림 2A). 이 프로토콜에 사용된 하이드로겔 제형은 표 2에서 확인할 수 있다. 제공된 템플릿에 있는 LED의 간격은 384웰 플레이트의 다른 모든 웰의 간격과 일치하므로 플레이트 내부에 젤을 형성할 수 있습니다(그림 2B). 단일 하이드로젤의 표면에서 미크론 스케일 영역에 대한 AFM 심문은 더 부드러운 평균 영 모듈리를 갖는 하이드로젤이 또한 더 뻣뻣한 하이드로젤보다 더 작은 모듈리 범위를 갖는다는 것을 보여주었다(도 2C-E).

생존력을 극대화하는 세포.......

Discussion

현재의 연구는 HA 기반 내에서 3D, 소형화 된 배양물을 생성하는 동시에 인테그린 결합에 사용할 수있는 매트릭스 강성과 펩타이드를 변경하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 매트릭스 파라미터가 증가된 처리량으로 세포 표현형(예를 들어, 화학요법에 노출된 암 세포의 생존력)에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 체계적인 연구를 가능하게 한다. 본원에 제시된 것을 포함하는 이전의 접근법들은 최종 제형 내의 전체 중합체 퍼센트를 변화시킴으로써 조정된 히드로겔 강성을 가지며, 여기서 더 뻣뻣한 히드로겔은 더 높은 중합체 함량^21,31을 갖는다. 그러나, 이러한 접근법은 본질적으로 처리량을 낮추는 과정인 원하는 각각의 강성에 대해 독특한 하이드로겔 제형을 제조할 필요가 있다. 여기서, 하이드로겔 강성은 가교 동안 UV 조도를 변화시킴으로써 조정되어, 다중 강성의 하이드로겔이 단일 전구체 용액으로부터 얻어질 수 있다. 여기에 설명된 맞춤형 조.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.1 kOhm 저항기, 6 W	Digikey	35601k1ft
1.7 mL 마이크로 원심분리기 튜브	Genesse Scientific	21-108
15 mL 원뿔형 튜브	Fisher Scientific	14-959-70C
365 nm LED	Digikey	ltpl-c034uvh365
384 웰 플레이트	Bio Greiner One	781090
40 µ m 세포 여과기	MTC bio	C4040
4-Armed thiol 말단 폴리에틸렌 글리콜 (20 kDa)	Laysan Bio	4arm-PEG-SH-20K-1g
6 NPN BJTs	Digikey	2n5550ta
80 Ohm resistors, 0.125 W	Digikey	erjj-6enf80r6v
8-Armed norbornene 말단 폴리에틸렌 글리콜 (20 kDa)	Jenkem Technology	A7025-1
Accutase	혁신적인 세포 기술	AT104500	세포 해리  시약
AFM 프로브	Novascan		0.01 N / m 공칭 스프링 상수, 2.5 µ m SiO2 입자
Arduino IDE	Arduino	1.8.19
Arduino Nano	Makerfire	Mini Nano V3.0 ATmega328P 마이크로컨트롤러 보드
bFGF	Peprotech	100-18B	20 ng/mL
CCK8	Abcam	ab228554
원심분리기	Thermoscientific	sorvall legend xtr
CP100ST	Gilson	F148415	간접 변위 피펫 팁
Cubis Semi-Micro Balance	Sartorius	MSA225S100DI
DMEM - F12 (50-50)	Life Technologies	11330057	1x
	DMSO Fisher Scientific	BP231-100
DPBS Ca (-) Mg (-)	Genesse Scientific	25-508
EGF	Peprotech	AF100-15	50ng/mL
에탄올, 무수	Fisher Scientific	A405P	DI 물을 추가하여 70%로 희석
Fisherbrand Class B Amber Glass 나사산 바이알	Fisher Scientific	03-339-23C
Fisherbrand 계량 종이	Fisher Scientific	09-898-12B
G21 보충제	Gemini Bio	400-160	50x
Hanks Balanced Salt Solution	Thermo Fisher Scientific	14175095
HCl, ACS, 12M	Sigma Aldrich	S25838A	으로 희석하기 위해 DI 물을 첨가
	Sigma Aldrich	H3149-100Ku	25 µ g/mL
HEPES	시그마 Aldrich	H7006-100G
열풍 총	Wagner	HT1000
Integrin 결합 시알로단백질(IBSP) 펩타이드	Genscript	맞춤 주문	GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY
리튬 페닐-2,4,6 트리메틸벤조일포스피네이트(LAP), >95%	시그마 Aldrich	900889-1G
자기 교반 플레이트	열 Scientific	SP194715
Microcentrifuge	Thermo Scientific	Sorvall legend micro 21R
Microman E single Channel Pipettor	Gilson	FD10004	Positive displacement
pipette Micropipette Tips	Various Manufacturs		Various sizes
mLine micropipette	Sartorious
N-acetyl Cysteine	Sigma Aldrich	A7250-10G
Nanowizard 4	Bruker		AFM 현미경
NaOH	Fisher Scientific	ss255-1	DI 물을 추가하여 1M
Normoicin	Invivogen	ant-nr-1	500x
Osteopontin 펩타이드	Genscript	맞춤 주문	GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG
피펫 에이드	드러먼드	4000102
일반 현미경 슬라이드	Globe Scientific	1301
Press-To-Seal 실리콘 절연체, 12-4.5mm 직경 x 2mm 깊이	Grace Bio Labs	664201-A	단일 시트에서 8개의 개별 금형을 만들도록 절단
처리		처리 3.5.4
리피터 M4	Eppendorf	4982000322
리피터 피펫 팁	Sartorious	30089430	1 mL 크기
RGD 펩타이드	Genscript		GCGYGRGDSPG
Scoth 테이프
혈청학 피펫	Genesse Scientific	12-102,12-104	5,10 mL 피펫
솔더 페이스트	Digikey	315-NC191LT15T5-ND
솔더 와이어
스트레이트 해부 겸	VWR Scientific	82027-408
Synergy H1 플레이트 리더	Biotek
T-75 세포 배양 처리 플라스크	Genesee Scientific	25-209
Temozolomide	Sigma Aldrich	T2577	일반적으로 10 µ에서 사용됩니다. M에서 100 & 마이크로; M
Tenascin-C 펩타이드	Genscript		GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV
티올 화 히알루론산(700kDa), 6-8% 변형	Lifecore Biomedical	HA700K5
VWR Spinbar, Flea Micro	VWR	58948-375