하이드로겔 어레이는 3D 종양 모델에서 매트릭스 성분 및 치료제의 스크리닝 효과를 위한 처리량 증가를 가능하게 합니다.

Summary

본 프로토콜은 맞춤형 UV 조명 장치를 사용하여 3D 매트릭스-모방 배양물에서 환자 유래 교모세포종 세포의 화학요법 반응에 대한 기계적 및 생화학적 단서의 영향을 평가하기 위한 실험 플랫폼을 기술하며, 조정 가능한 기계적 특징을 갖는 하이드로젤의 고처리량 광가교를 용이하게 한다.

Abstract

세포 - 매트릭스 상호 작용은 생화학적, 기계적, 기하학적 단서를 통해 복잡한 생리 학적 과정을 중재하여 병리학 적 변화와 치료 반응에 영향을 미칩니다. 약물 개발 파이프라인 초기에 매트릭스 효과를 고려하면 새로운 치료제의 임상 성공 가능성이 높아질 것으로 예상된다. 3D 세포 배양에서 특정 조직 미세 환경을 재순환시키는 생체 재료 기반 전략은 존재하지만 이를 약물 스크리닝에 주로 사용되는 2D 배양 방법과 통합하는 것은 어려운 과제였습니다. 따라서, 여기에 제시된 프로토콜은 세포 생존을 위한 기존 약물 스크리닝 파이프라인 및 종래의 분석과의 통합을 용이하게 하기 위해 다중 웰 플레이트 포맷으로 소형화된 생체재료 매트릭스 내에서 3D 배양을 위한 방법의 개발을 상세히 기술한다. 배양된 세포에서 임상적으로 관련된 표현형을 보존하는데 중요한 매트릭스 특징이 고도로 조직- 및 질병-특이적일 것으로 예상되기 때문에, 매트릭스 파라미터의 조합 스크리닝은 특정 적용을 위한 적절한 조건을 식별하기 위해 필요할 것이다. 여기에 설명된 방법들은 매트릭스 역학 및 리간드 프리젠테이션의 직교 변이에 대한 암 세포 반응을 평가하기 위해 소형화된 배양 포맷을 사용한다. 구체적으로, 본 연구는 화학요법에 대한 환자 유래 교모세포종 (GBM) 세포의 반응에 대한 매트릭스 파라미터의 효과를 조사하기 위해 이 플랫폼의 사용을 입증한다.

Introduction

신약 개발의 예상 비용은 지난 10 년 동안 꾸준히 상승했으며 현재 추정치에서 10 억 달러 이상^{이었습니다 1}. 이 비용의 일부는 임상 시험에 들어가는 약물의 높은 실패율입니다. 약물 후보의 약 12 %는 궁극적으로 2019 년 미국 (미국) 식품 의약품 안전청 (FDA)의 승인을 얻습니다. 많은 약물이 예기치 않은 독성²로 인해 I 단계에서 실패하는 반면, 안전성 시험을 통과 한 다른 약물은 효능 부족으로 인해 실패 할 수 있습니다³. 비효능으로 인한 이러한 감소는 약물 개발 동안 사용되는 암 모델이 임상적 효능의 비예측으로 악명 높다는 사실에 의해 부분적으로 설명될 수 있다⁴.

시험관내 및 생체내 모델 사이의 기능적 불균형은 비종양 세포 및 물리적 ECM ^5,6을 포함하는 그들의 천연 미세환경으로부터 암 세포를 제거하는 것에 기인할 수 있다. 일반적으로 연구 그룹은 Matrigel (마우스 육종에서 유래 한 단백질성 기저막 매트릭스)과 같은 상업적으로 이용 가능한 배양 매트릭스를 사용하여 배양 된 종양 세포에 3D 매트릭스 미세 환경을 제공합니다. 2D 배양과 비교하여, 막 매트릭스에서의 3D 배양은 시험관내 결과 ^7,8의 임상적 관련성을 개선시켰다. 그러나, 막 매트릭스를 포함하는 탈세포화된 조직으로부터의 배양 생체재료는, 전형적으로 재현성⁹를 손상시킬 수 있는 배치-배치-배치-배치 가변성을 나타낸다. 더욱이, 연구된 것들로부터 상이한 조직 기원을 갖는 종양으로부터 유래된 매트릭스는 적절한 생리학적 단서⁽¹⁰)를 제공하지 않을 수 있다. 마지막으로, 종양내 이질성이 높은 암은 서브마이크론 크기 규모에 따라 다양하고 막 매트릭스가¹¹을 재조정하도록 조정될 수 없는 미세환경적 특징을 갖는다.

교모세포종(GBM)은 약 15개월의 중간 생존 시간을 갖는 균일하게 치명적인 뇌종양으로, 치료 개발이 특히 어려웠던 암이다^12,13. GBM에 대한 현재의 치료 표준은 원발성 종양 절제술, 방사선 요법, 그리고 테모졸로마이드 (TMZ)¹⁴를 사용한 화학 요법으로 구성됩니다. 그러나 임상 GBM 종양의 절반 이상이 다양한 메커니즘 ^15,16,17을 통해 치료 저항성을 나타냅니다. 개별 환자에 대한 치료 요법의 효능을 예측하는 것은 매우 어렵습니다. 개별 결과를 예측하는 데 사용되는 표준 전임상 모델은 면역저하된 마우스에 정형외적으로 이종이식편된 환자 유래 종양 세포로 구성된다. 환자 유래 이종이식편은 임상 GBM 종양의 여러 측면을 재검토할 수 있고 전임상 모델⁽¹⁸)에 가치가 있지만, 본질적으로 비용이 많이 들고, 처리량이 낮고, 시간이 많이 걸리며, 윤리적 관심사¹⁹를 수반한다. 환자 유래 세포의 배양, 2D 플라스틱 표면 또는 구상체는 대부분 이러한 문제를 피합니다. 환자 유래 세포는 유전적 수차를 보존하는 반면, 2D 또는 현탁된 구상체로서의 그들의 배양은 설치류 및 원래 환자 종양⁽²⁰)에서 환자 유래 이종이식편의 표현이 대체로 불량하였다. 이전에 우리와 다른 사람들은 뇌 조직의 기계적 및 생화학 적 특성을 모방 한 3D ECM에서 배양 된 GBM 세포가 약물 내성 표현형^10,21,22,23을 보존 할 수 있음을 보여주었습니다.

뇌 ECM에 풍부하며 GBM 종양에서 과발현되는 다당류인 히알루론산(HA)과 이의 CD44 수용체 사이의 상호작용은 시험관내 약물 내성의 획득을 조절한다 21,24,25,26,27. 예를 들어, 연질, 3D 배양물 내에 HA를 포함시키는 것은 치료 내성을 획득하는 환자 유래 GBM 세포의 능력을 증가시켰다. 이러한 메카노-반응성은 GBM 세포²¹ 상의 CD44 수용체에 대한 HA 결합에 의존하였다. 추가적으로, RGD 함유 펩티드에 대한 인테그린 결합은, 3D 배양 매트릭스에 혼입되어, 강성 의존적 방식으로 CD44 매개된 화학저항성을 증폭시켰다²¹. HA 이외에도, RGD 영역을 함유하는 많은 ECM 단백질의 발현은 정상 뇌와 GBM 종양⁽²⁸) 사이에서 다양하다. 예를 들어, 한 연구는 GBM 종양²⁹에서 28 개의 별개의 ECM 단백질이 상향 조절되었다고보고했습니다. 이러한 복잡한 종양 매트릭스 미세환경 내에서, 암 세포는 기계적 및 생화학적 단서를 통합하여 특정 내성 표현형을 산출하는데, 이는 인테그린 결합 펩티드^28,29,30의 영 모듈러스 또는 밀도에서 상대적으로 작은 차이(예를 들어^, 크기 차수 미만)에 의존한다.

본 프로토콜은 종양 세포가 매트릭스 단서의 고유한 조합을 해석하고 치료 저항성을 촉진하는 복잡하고 환자 특정 매트릭스 미세환경을 식별하는 방법을 특성화합니다(그림 1A). 3D 배양을 위해 소형화되고 정밀하게 조정된 매트릭스를 생성하는 광화학적 방법은 크고 직교하는 가변 공간을 제공합니다. 마이크로 컨트롤러에 의해 실행되는 맞춤형 LED 어레이가 384웰 플레이트 형식 내의 포토크로스링크 하이드로젤에 통합되어 자동화 및 재현성을 높였습니다. 노출 강도는 원자력 현미경 (AFM)을 사용하여 평가된 바와 같이 생성된 하이드로젤의 마이크로기계적 특성을 변경시키기 위해 웰에 걸쳐 다양하였다. 이 원고는 조명 어레이 자체를 구성하는 데 초점을 맞추지는 않지만 회로도(그림 1B) 및 부품 목록(재료 표)은 장치 재생을 위한 보조 도구로 제공됩니다.

이 보고서는 영 모듈러스 (단일 크기의 순서에 걸쳐 네 가지 수준)와 인테그린 결합 펩티드 함량 (네 가지 ECM 단백질에서 유래)이 직교적으로 다양한 독특한 3D 미세 환경에서 배양 된 GBM 세포 어레이의 신속한 생성을 보여줍니다. 이 접근법은 테모졸로마이드 (TMZ) 화학요법에 대한 내성을 획득함에 따라 환자 유래 GBM 세포의 생존 가능성 및 증식에 대한 하이드로겔 역학 및 ECM 특이적 인테그린 결합의 상대적 기여를 조사하기 위해 사용되었다.

Protocol

환자 유래 GBM 세포주 (GS122 및 GS304)는 UCLA 기관 검토 위원회 (IRB # 10-000655)가 승인 한 프로토콜에 따라이 라인을 개발 한 David Nathanson 교수 (공동 작업자)에 의해 제공되었습니다. 세포주가 개별 환자와 다시 연결될 수 없도록 비확인 세포를 제공하였다.

1. 하이드로겔 용액의 제조

1. 행크의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)에 HEPES 분말을 20mM로 용해시켜 HEPES 완충 용액을 준비하십시오. 완전 용매화 후 pH를 7로 조정한다.
2. HEPES 완충 용액에서, 티올화된 HA (700 kDa 공칭 분자량, 물질 표 참조)를 이전 보고서³¹에 따라 제조하여 각 글루쿠론산의 카르복실산 잔기의 6 % -8 %가 완충 용액 중 10 mg / mL의 농도로 티올로 변형되도록합니다.
   참고: 주변광에 의한 티올 산화를 방지하기 위해 호박색 바이알을 사용하는 것이 좋습니다.
   1. 자석 교반 플레이트 (<1,000 rpm)를 사용하여 완전히 용해 될 때까지 실온에서 교반하십시오, 전형적으로 약 45 분.
3. HA가 용해되는 동안, (1) 100 mg/mL의 8-arm-PEG-Norbornene (20 kDa), (2) 100 mg/mL의 4-arm-PEG-Thiol (20 kDa), (3) 4 mM의 시스테인 또는 시스테인 함유 펩티드 (예를 들어, GCGYGRGDSPG), 및 (4) 4 mg/mL의 LAP를 마이크로원심분리 튜브에 담아 별도의 용액을 준비 한다(표 참조).
   1. 이 네 가지 용액을 단계 1.1에서 준비된 HEPES 완충 용액에서 각각 준비하십시오. 단계 4를 수행하기 전에 각 시약의 완전한 용해를 보장하기 위해 용액을 소용돌이친다.
      참고: 다수의 상이한 펩티드를 시험하는 경우, 각각은 이러한 접합 화학을 위한 시스테인 또는 티올 모이어티의 다른 공급원을 함유해야 한다.
   2. 이 시점에서 단일 하이드로겔 내에 테더링될 모든 펩티드의 용액 (4 mM 이용가능한 티올)을 준비한다.
      참고: 이들이 유래되고 본 연구에서 사용된 ECM 단백질 및 펩티드 서열은 표 1에 열거되어 있다. N-아세틸 시스테인 ( 표 참조)은 세포가 결합하지 않는, 접착성 펩티드의 농도를 적정하거나 음성 대조군으로 작용하여 생체활성, 티올 함유 펩티드를 대체할 수 있다³¹.
4. HA, PEG-노보넨, PEG-티올 및 시스테인/티올 함유 펩티드( 물질 표 참조)의 개별 용액을 혼합하여 표 2에 열거된 최종 하이드로겔 매트릭스에 대한 최종 농도를 달성하십시오. 자석 교반 플레이트 상에서 (<1,000 rpm) 적어도 30분 동안 교반하여 완전히 혼합한다.
   참고: HA 솔루션은 점성이 높으며 포지티브 변위 피펫을 사용하여 가장 잘 처리 됩니다(재료 표 참조). 포지티브 변위 피펫을 사용할 수없는 경우, 점성 용액은 넓은 오리피스 팁을 사용하여 천천히 피펫팅하여 표준 마이크로 피펫으로 분배 될 수도 있습니다.

2. LED 어레이를 통한 하이드로젤의 조명 및 광가교

주의: UV 보호 안경을 착용하고 자외선 흡수 소재로 조명 필드를 덮으십시오.

참고: 이 프로토콜에 설명된 LED 어레이는 제공된 회로도에서 설명한 대로 직렬로 배치된 여덟 개의 LED 여섯 세트로 구성됩니다(그림 1A). 각 LED 세트는 독립적으로 전원을 공급할 수 있으므로 실행 당 최대 여섯 개의 서로 다른 조도가 가능합니다. 보충 파일 1 에는 추가 지침을 위해 다음 지침에 해당하는 스크린 샷이 포함되어 있습니다.

1. 보조 코딩 파일에서 조명 장치.zip 파일을 다운로드합니다. 이 디렉토리에는 Arduino.zip (보충 코딩 파일 1), 드라이버.zip (보충 코딩 파일 2), GUI.zip (보충 코딩 파일 3) 및 홀더.zip (보충 코딩 파일 4) 파일이 포함되어 있습니다.
   참고: 3D 회로 기판을 제자리에 고정하기 위해 위쪽과 아래쪽 부분을 인쇄합니다(자세한 내용은 보조 코딩 파일 참조).
2. 마이크로 컨트롤러 소프트웨어를 다운로드하여 설치합니다( 자료표 참조).
3. GUI 소프트웨어를 다운로드하여 설치합니다( 자료표 참조). 소프트웨어 작동 지침은 보조 파일 1을 참조하십시오.
4. 처리를 열고 스케치 > 가져 오기 라이브러리 > 라이브러리 추가를 클릭하여 controlIP5 라이브러리를 설치하십시오. 그런 다음 라이브러리에서 controlIP5를 검색하고 설치를 클릭하십시오. 이 작업을 처음으로 수행하십시오.
5. 36V 전원 공급 장치를 사용하여 조명 장치( 재료 표 참조)에 전원을 공급하고 micro-USB 케이블을 사용하여 PC에 연결합니다.
   참고: 일부 장치는 다양한 Arduino 나노 보드용 드라이버를 자동으로 설치하지 않습니다. 하나의 드라이버 집합이 장치 zip 파일에 제공됩니다.
6. Arduino IDE를 사용하여 Adruino.zip 폴더에 있는 Arduino.ino 파일을 엽니다.
7. 체크 마크 버튼을 클릭하여 Arduino.ino 파일을 컴파일하십시오. 화살표 버튼을 클릭하여 컴파일된 코드를 업로드합니다.
8. 처리를 사용하여 GUI.zip 폴더에 있는 GUI.pde 파일을 엽니다.
9. 처리 프로그램에서 실행 을 클릭하여 조명 장치를 제어하기위한 그래픽 사용자 인터페이스를 시작하십시오.
10. 그래픽 사용자 인터페이스 창에서 가교될 하이드로겔 전구체 용액을 포함하는 컬럼에 대한 강도 를 클릭하고 원하는 강도를 입력한다. 시간 상자를 클릭하고 원하는 시간을 입력하십시오. 표 2에 제공된 용액의 경우, 이것은 15초일 것이다.
    참고: 최종 사용자는 라디오미터를 사용하여 디지털 강도 값을 조도에 맞게 보정해야 합니다. 전형적인 강도의 예가 도 2A에 제공된다.
11. 샘플을 실리콘 몰드의 단일 컬럼(재료 표 참조) 또는 384웰 플레이트에 있는 다른 모든 LED와 조명 장치(그림 2B)와 정렬합니다. 마침을 클릭하여 조명을 시작하십시오. 여러 슬라이드 또는 384웰 플레이트의 다른 웰을 조명하는 데 필요한 경우 이 과정을 반복합니다.
    참고: 홀더는 384웰 플레이트가 조명 중에 내부 챔버의 한쪽 모서리와 플러시되도록 설계되었습니다.
    1. 조명에 이어 한쪽 모서리에 놓으면 웰 플레이트를 다음 모서리로 이동하고 반복하십시오. 플레이트의 나머지 절반에 있는 웰을 비추려면 홀더에서 플레이트를 들어올리고 180° 회전합니다.
12. 아래 단계에 따라 기계적 특성화를 위해 다양한 역학을 가진 하이드로젤을 생성합니다.
    1. 이물질을 제거하기 위해 테이프를 사용하여 유리 슬라이드와 실리콘 몰드를 청소하십시오. 실리콘 몰드를 유리 슬라이드에 부착하고 아래로 눌러 좋은 씰을 보장하고 기포를 대체하십시오.
    2. 피펫 단계 1.4에서 제조된 하이드로겔 전구체 용액 80 μL를 유리 슬라이드 상에 각각의 실리콘 몰드에 넣는다.
    3. 유리 슬라이드를 단일 열의 다른 모든 LED와 정렬된 조명 장치 위에 놓습니다. 하이드로겔 전구체를 단계 2에 기재된 바와 같이 15초 동안 자외선에 노출시켜 광가교결합시킨다.
    4. 조명이 멈춘 후에는 슬라이드를 회수하고 미세한 팁(10μL 피펫 팁, 30G 바늘 등)으로 몰드의 내부 둘레를 추적하여 몰드에서 겔을 느슨하게 합니다. 핀셋 / 포셉으로 실리콘 몰드를 제거하십시오.
    5. 가교 된 하이드로 젤을 주걱을 적시고 유리 슬라이드에서 부드럽게 밀어 넣어 12 웰 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 하이드로겔을 첨가하기 전에 각 웰을 2mL의 DPBS ( 물질표 참조)로 채운다. 실온에서 적어도 12 h (전형적으로 하룻밤) 동안 DPBS 용액에서 겔을 팽윤시킨다 (다음날의 기계적 특성화를 위해).

3. 원자력 현미경 (AFM) 측정

1. 제조업체의 지침에 따라 원자력 현미경 (AFM)을 켭니다 ( 재료 표 참조). 이 프로토콜은 기기 및 관련 소프트웨어 사용에 대한 간단한 지침을 제공합니다.
2. AFM 프로브를 설치합니다( 재료 표 참조).
   참고: 본 연구를 위해, 0.01N/m의 공칭 스프링 상수를 갖는 삼각형 질화 실리콘 캔틸레버를 구형 2.5μm 이산화규소 입자로 개질하였다.
3. 설치 후 레이저를 삼각형 프로브의 정점에 맞춘 다음 미러와 레이저 편향을 조정하여 신호 합(일반적으로 1.5-2.2V 사이)을 최대화합니다.
4. 프로브를 DPBS에 담그고 최대 15분 동안 기다렸다가 열적 평형을 얻습니다. 교정 버튼을 클릭하고 접촉 종속 교정을 선택합니다. 열 튜닝 수집 버튼을 클릭하고 데이터 수집 후 교정을 위해 약 3kHz의 피크를 선택하십시오.
   참고: 굴절률 변화로 인해 액체에 침지한 후 거울과 레이저 디플렉터를 약간 조정해야 할 수 있습니다.
5. 접근 파라미터를 일정한 속도, 목표 높이 7.5μm 및 접근 속도 15μm/s로 설정하여 페트리 접시(플라스틱)의 표면에 접근합니다. 접근 방식에 대해 실행당 기준선 측정을 활성화하여 접근 방식이 지속적으로 실행되고 디플렉터의 드리프트로 인해 조기에 중단되지 않도록 합니다.
6. 접근 시 힘 매핑을 위한 수집 파라미터를 4nN 턴어라운드, 2μm 압입 거리, 1μm/s 속도 및 0s 접촉 시간으로 설정합니다. 시작 버튼을 눌러 플라스틱 표면(예: 우물 플레이트)에서 힘 곡선을 수집하기 시작합니다.
7. 보정 창으로 돌아가서 플라스틱의 접촉 및 압흔에 해당하는 힘 곡선의 부분을 선택합니다. 프로브에 대해 계산된 감도 및 강성 값을 수락하여 교정을 완료합니다.
8. 교정 후 AFM 프로브를 올리고 심문을 위해 하이드로겔 샘플을 놓습니다. 단계 5에서 제공된 설정에 따라 하이드로겔에 접근한다.
   참고: 하이드로겔 표면을 향한 접근 절차 동안, 유닛은 실수로 접근된 상태를 트리거할 수 있습니다. 실제 접근 방식을 확인하려면 4.6단계와 같이 힘 곡선을 구하십시오. 결과 커브에 접촉 및 결과 들여쓰기가 표시되지 않는 경우 접근 절차를 반복합니다.
9. 표면 접근이 성공하면 강제 매핑 모드로 전환하고 획득 파라미터를 축당 길이가 40μm인 8 x 8 크기의 맵으로 설정합니다. 다양한 영역에서 힘 맵을 획득하여 강성 측정의 균일성을 평가합니다.
   1. 소프트웨어 프로그램 JPK SPM 데이터 프로세싱을 사용하여 Hertz/Sneddon 모델 피팅(수식 1 및 2, 모든 변수의 정의에 대해서는 표 3 참조)을 사용하여 힘 곡선을 해석하고 구형 지오메트리를 선택한 ^{32,33,3 4}.
      수학식 1³²
      수학식 2³²

4. 3D, 매트릭스 임베디드 문화의 설정 및 약물 처리

1. 원하는 세포를 단일 세포 용액으로 준비하십시오.
   참고: 셀 유형마다 다른 패시징 방법이 필요할 수 있습니다. T-75 플라스크로부터 GBM 구상체의 현탁 배양물을 계대배양하기 위한 전형적인 프로토콜이 참고문헌³¹에 보고되어 있다.
2. 15 mL 원뿔형 튜브 내로 배양된 T-75 플라스크 현탁액으로부터 GBM 구상체(직경 약 150 μm)를 수집한다. 배양 플라스크를 5 mL의 DPBS로 헹구어 잔류 세포 및 배지를 제거하고 이 부피를 원뿔형 튜브에 첨가한다.
3. 세포를 함유하는 원뿔형 튜브를 실온에서 5분 동안 200 x g 에서 원심분리한다. 원심분리 후, 5 mL 혈청학적 피펫으로 상층액을 제거하고, 세포 펠릿을 교란시키지 않도록 주의하고, DPBS 5 mL에 재현탁시켰다.
4. 실온에서 5분 동안 200 x g 에서 원심분리하여 세포를 세척한다. 상층액을 5 mL 혈청학적 피펫으로 흡인하고, 세포 펠릿을 교란하지 않도록 주의하고, 이어서 세포를 2 mL의 세포 해리 시약에 재현탁시킨다( 표 참조).
5. 실온에서 10-15분 동안 인큐베이션한다. 3 mL의 완전한 배지 ( 물자재 표 참조)를 첨가하고 부드럽게 피펫을 3-5회 피펫하여 구상체를 단일 세포 현탁액⁽³¹)으로 분해한다.
6. 단일 세포 현탁액을 400 x g 에서 원심분리(단세포 현탁액은 펠릿 형성을 위해 더 빠르게 회전할 수 있음)를 실온에서 펠릿 세포에 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 5 mL 혈청학적 피펫으로 흡인하고, 세포 펠릿을 방해하지 않도록 주의한다. 세포를 1 mL의 완전 배지에 재현탁시킨다.
   참고: 세포가 현탁액 중의 단일 세포가 아닌 덩어리에 남아 있는 경우, 통과 후, 세포는 단일 세포 현탁액을 달성하기 위해 40 μm 세포 스트레이너를 통과할 수 있다.
7. 혈구측정기를 사용하여 계수하기 위해 세포의 일부를 제거하십시오. 이 부분을 트립판 블루로 두 배로 희석하여 생존력이 손상된 세포에 침투시킵니다. 살아있는 무색 세포 만 계산하십시오. 전형적으로, 플라스크 당 800,000 세포에 시딩된 T-75는 배양에서 일주일 후에 2-3백만 세포를 산출한다.
8. 캡슐화에 필요한 셀 수를 결정합니다. 필요한 총 세포 수를 포함하는 배지의 부피를 멸균 1.7 mL 마이크로원심분리 튜브 내로 옮긴다. 실온에서 5 분 동안 400 x g 에서 회전하십시오.
   참고: 예를 들어, 2.5백만 세포/mL에서 세포를 캡슐화하기 위해서는 1mL의 젤 부피에 재현탁된 최소 2.5백만 개의 세포가 필요합니다. 1mL의 겔 부피를 통해 사용자는 100 겔 방울을 분배 할 수 있으며, 각 겔 방울은 10 μL 부피입니다. 하이드로겔 용액에 현탁 된 여분의 ~ 20 % 부피의 세포를 준비하는 것은 피펫 전달 중 손실을 고려하는 것이 좋습니다. 따라서, 이 예에서 3백만 개의 세포와 1.2mL의 하이드로겔 전구체 용액을 제조할 것이다. 500,000,000,mL의 최소 밀도를 권장합니다.
9. 상층액을 마이크로 피펫으로 흡인하고, 세포 펠릿을 방해하지 않도록주의하십시오. 단계 1.4에서 제조된 하이드로겔 전구체 용액에 세포 펠렛을 재현탁시키고, 1,000 μL 마이크로피펫으로 4-5회 상하로 피펫팅하여 잘 혼합한다.
10. 세포를 10 μL를 분배하도록 설정된 반복 피펫터 ( 재료 표 참조)에 로딩하십시오. 거품과 고르지 않은 분배를 피하려면 폐기물 용기에 1-2 번 추가로 분배하여 반복 피펫터를 프라이밍하십시오.
11. 384-웰 플레이트의 각 웰에서, 하이드로겔 용액에 현탁된 10 μL의 세포를 반복 피펫터로부터 분주한다. LED 어레이를 사용하여 셀을 포함하는 각 웰을 15초 동안 강도로 조명(단계 2)합니다( 그림 2A 의 결과 1.14, 1.55, 2.15, 2.74mW/^cm2의 강도를 활용함).
    참고: 실험 조건당 다섯 번의 반복실험으로 시작하고 끝점 분석의 원하는 처리량 및 분산에 따라 확장 또는 축소하는 것이 좋습니다.
12. 세포를 함유하는 각 웰에 40 μL의 완전한 배지를 첨가한다. 50μL의 DPBS를 겔을 둘러싸고 있는 비실험적이고 건조한 웰에 첨가하여 증발로 인한 손실을 최소화합니다.
13. GBM 세포의 경우, 40 μL의 배지-함유 약물 (예를 들어, TMZ, 표 참조)을 첨가하여 최종 원하는 농도 (디메틸설폭시드 (DMSO) 또는 비히클 (DMSO) 중 100 μM)을 달성하고, 이에 따라, 캡슐화 후 3일 후에 시작한다.

5. CCK8 증식 분석

1. 10 μL의 CCK8 시약 ( 물질 표 참조)을 세포를 함유하는 각 웰에 첨가한다.
   참고: 이 분석을 처음 수행하는 경우, 배지 전용 또는 무세포 하이드로젤과 같은 음성 대조군 웰을 배지에 포함시키십시오.
2. 제조업체의 지침에 따라 1-4 시간 동안 배양하십시오.
   참고 :이 시간은 세포 유형 및 밀도의 함수로 다를 수 있으므로 흡광도 값이 맥주의 법칙³⁵를 적용하기위한 요구 사항 인 선형 범위 내에 속하도록 각 응용 프로그램에 대해 배양 시간을 테스트해야합니다.
3. 인큐베이션 후 모든 웰에 대해 450nm에서 흡광도를 판독합니다.
4. 각 그룹에 대한 비히클 조건에 대해 단계 3에서 수득된 450 nm에서의 평균 흡광도를 계산한다. 각 약물 처리된 웰을 그룹당 비히클 대조군의 평균으로 나눈다.
5. 백분위수 방법(³⁶)을 통해 부트스트랩 분포(N = 10,000)를 생성하여 신뢰 구간을 계산한다.
   참고: 일반적으로 95% 신뢰 구간을 활용하고 신뢰 구간이 1을 넘지 않는 조건을 유의하게 해석하고 추가 조사를 보증할 수 있습니다. 신뢰 구간을 95%로 설정하는 것은 p = 0.05의 유의 컷오프를 설정하는 것과 일치합니다. 결과에 나타난 데이터의 경우, 매트릭스 매개 약물 내성을 촉진하거나 억제하는 조건을 구별하는 데 유용성이 있으며, 양면 분석이 필요합니다.

Results

AFM 측정은 맞춤형 Arduino 제어 LED 어레이를 사용하여 광가교 중에 UV 조도(mW/^cm2)의 함수로서 하이드로겔 역학의 정밀한 제어를 확인했다(그림 2A). 이 프로토콜에 사용된 하이드로겔 제형은 표 2에서 확인할 수 있다. 제공된 템플릿에 있는 LED의 간격은 384웰 플레이트의 다른 모든 웰의 간격과 일치하므로 플레이트 내부에 젤을 형성할 수 있습니다(그림 2B). 단일 하이드로젤의 표면에서 미크론 스케일 영역에 대한 AFM 심문은 더 부드러운 평균 영 모듈리를 갖는 하이드로젤이 또한 더 뻣뻣한 하이드로젤보다 더 작은 모듈리 범위를 갖는다는 것을 보여주었다(도 2C-E).

생존력을 극대화하는 세포...

Discussion

현재의 연구는 HA 기반 내에서 3D, 소형화 된 배양물을 생성하는 동시에 인테그린 결합에 사용할 수있는 매트릭스 강성과 펩타이드를 변경하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 매트릭스 파라미터가 증가된 처리량으로 세포 표현형(예를 들어, 화학요법에 노출된 암 세포의 생존력)에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 체계적인 연구를 가능하게 한다. 본원에 제시된 것을 포함하는 이전의 접근법들은 최종 제형 내의 전체 중합체 퍼센트를 변화시킴으로써 조정된 히드로겔 강성을 가지며, 여기서 더 뻣뻣한 히드로겔은 더 높은 중합체 함량^21,31을 갖는다. 그러나, 이러한 접근법은 본질적으로 처리량을 낮추는 과정인 원하는 각각의 강성에 대해 독특한 하이드로겔 제형을 제조할 필요가 있다. 여기서, 하이드로겔 강성은 가교 동안 UV 조도를 변화시킴으로써 조정되어, 다중 강성의 하이드로겔이 단일 전구체 용액으로부터 얻어질 수 있다. 여기에 설명된 맞춤형 조...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.1 kOhm 저항기, 6 W	Digikey	35601k1ft
1.7 mL 마이크로 원심분리기 튜브	Genesse Scientific	21-108
15 mL 원뿔형 튜브	Fisher Scientific	14-959-70C
365 nm LED	Digikey	ltpl-c034uvh365
384 웰 플레이트	Bio Greiner One	781090
40 µ m 세포 여과기	MTC bio	C4040
4-Armed thiol 말단 폴리에틸렌 글리콜 (20 kDa)	Laysan Bio	4arm-PEG-SH-20K-1g
6 NPN BJTs	Digikey	2n5550ta
80 Ohm resistors, 0.125 W	Digikey	erjj-6enf80r6v
8-Armed norbornene 말단 폴리에틸렌 글리콜 (20 kDa)	Jenkem Technology	A7025-1
Accutase	혁신적인 세포 기술	AT104500	세포 해리  시약
AFM 프로브	Novascan		0.01 N / m 공칭 스프링 상수, 2.5 µ m SiO2 입자
Arduino IDE	Arduino	1.8.19
Arduino Nano	Makerfire	Mini Nano V3.0 ATmega328P 마이크로컨트롤러 보드
bFGF	Peprotech	100-18B	20 ng/mL
CCK8	Abcam	ab228554
원심분리기	Thermoscientific	sorvall legend xtr
CP100ST	Gilson	F148415	간접 변위 피펫 팁
Cubis Semi-Micro Balance	Sartorius	MSA225S100DI
DMEM - F12 (50-50)	Life Technologies	11330057	1x
	DMSO Fisher Scientific	BP231-100
DPBS Ca (-) Mg (-)	Genesse Scientific	25-508
EGF	Peprotech	AF100-15	50ng/mL
에탄올, 무수	Fisher Scientific	A405P	DI 물을 추가하여 70%로 희석
Fisherbrand Class B Amber Glass 나사산 바이알	Fisher Scientific	03-339-23C
Fisherbrand 계량 종이	Fisher Scientific	09-898-12B
G21 보충제	Gemini Bio	400-160	50x
Hanks Balanced Salt Solution	Thermo Fisher Scientific	14175095
HCl, ACS, 12M	Sigma Aldrich	S25838A	으로 희석하기 위해 DI 물을 첨가
	Sigma Aldrich	H3149-100Ku	25 µ g/mL
HEPES	시그마 Aldrich	H7006-100G
열풍 총	Wagner	HT1000
Integrin 결합 시알로단백질(IBSP) 펩타이드	Genscript	맞춤 주문	GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY
리튬 페닐-2,4,6 트리메틸벤조일포스피네이트(LAP), >95%	시그마 Aldrich	900889-1G
자기 교반 플레이트	열 Scientific	SP194715
Microcentrifuge	Thermo Scientific	Sorvall legend micro 21R
Microman E single Channel Pipettor	Gilson	FD10004	Positive displacement
pipette Micropipette Tips	Various Manufacturs		Various sizes
mLine micropipette	Sartorious
N-acetyl Cysteine	Sigma Aldrich	A7250-10G
Nanowizard 4	Bruker		AFM 현미경
NaOH	Fisher Scientific	ss255-1	DI 물을 추가하여 1M
Normoicin	Invivogen	ant-nr-1	500x
Osteopontin 펩타이드	Genscript	맞춤 주문	GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG
피펫 에이드	드러먼드	4000102
일반 현미경 슬라이드	Globe Scientific	1301
Press-To-Seal 실리콘 절연체, 12-4.5mm 직경 x 2mm 깊이	Grace Bio Labs	664201-A	단일 시트에서 8개의 개별 금형을 만들도록 절단
처리		처리 3.5.4
리피터 M4	Eppendorf	4982000322
리피터 피펫 팁	Sartorious	30089430	1 mL 크기
RGD 펩타이드	Genscript		GCGYGRGDSPG
Scoth 테이프
혈청학 피펫	Genesse Scientific	12-102,12-104	5,10 mL 피펫
솔더 페이스트	Digikey	315-NC191LT15T5-ND
솔더 와이어
스트레이트 해부 겸	VWR Scientific	82027-408
Synergy H1 플레이트 리더	Biotek
T-75 세포 배양 처리 플라스크	Genesee Scientific	25-209
Temozolomide	Sigma Aldrich	T2577	일반적으로 10 µ에서 사용됩니다. M에서 100 & 마이크로; M
Tenascin-C 펩타이드	Genscript		GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV
티올 화 히알루론산(700kDa), 6-8% 변형	Lifecore Biomedical	HA700K5
VWR Spinbar, Flea Micro	VWR	58948-375